答辩论文）用荧光分光光度法测定中药配方颗粒对自由基的清除作用

'用荧光分光光度法测定中药配方颗粒对自由基的清除作用答辩人：张承导师：蔡继文教授 选题意义1.自由基是一种外层轨道上含有未配对电子的原子、原子团或呈特殊状态的分子。2.机体内自由基大量产生或清除过缓,使积累超过临界水平后,就会对机体产生损伤，各种炎症、癌症、脏器损伤、老化等都与自由基密切相关。(一)自由基概述及其危害 (二)中药以及中药配方颗粒中药抗氧化剂具有经济和毒、副作用小等明显的优点,在中草药中,有许多药物都对自由基有清除作用。中药配方颗粒品质优良，效果客观，使用简便快捷，必将成为21世纪中医药配方的主流。因此研究它的药性有着重要的意义。 (三)测定自由基清除率的方法电子自旋共振法、高效液相色谱法、化学发光法、紫外分光光度法、荧光分光光度法等。本实验采用用仪器简单，操作方便的荧光分光光度法对中药消除自由基的性能进行研究。 1.实验原理Fe2+－EDTA在弱碱性介质中可还原溶解氧产生·OH，其进攻对苯二甲酸产生强荧光羟基化产物2－羟基对苯二甲酸(HOTP).·OH清除剂加入后,导致HOTP的生成量减少,从而体系荧光强度明显降低。实验内容 2.仪器日本岛津RF-5301PC荧光分光光度计，激发波长316nm，测定发射光谱。3.试剂及反应体系对苯二甲酸钠溶液(1.0×10-4mol/L);Fe2+(硫酸亚铁溶液,1.0×10-3mol/L)；EDTA(1.0×10-3mol/L)；磷酸钠缓冲溶液(0.2mol/L;pH=7.4),山茱萸等中药配方颗粒。依次加入对苯二甲酸溶液0.50mL,EDTA溶液0.3mL,中药颗粒溶液0.5mL；Fe2+溶液0.30mL,缓冲液2.00mL,稀释至10.0mL,反应6min后测定体系荧光强度。 4.实验内容及其结果讨论(1).不加中药时体系的发射光谱123由此可见,羟基对苯二甲酸是体系的唯一的强荧光物质，自由基或者是对苯二甲酸本身不产生荧光。峰值位置为426nm1:对苯二甲酸+Fe2++EDTA2:与1相比,无对苯二甲酸钠3:与1相比,体系中没有加入Fe2+ (2)测定中药自身的发射光谱，激发波长316nm为减小误差，选择了在426nm处的荧光强度值相对较小的中药:半支莲，山茱萸，茶多酚，黄芩，红花，桂枝，地龙，柴胡，猪苓 (3)对各种中药进行抑制自由基的测定无中药荧光强度F0 中药名C=0.03g/L中药自身荧光强度F′加入中药后荧光强度F清除率（％）[F0-(F-F′)]/F0黄芩63.803154.98474.1红花109.52241.01662.6桂枝83.272211.28463.6地龙88.537233.33858.8柴胡87.727231.92359.0猪苓59.979217.03555.3各种中药对自由基的清除率 (4)用不同浓度的半支莲，山茱萸和茶多酚进行研究无中药半支莲对自由基的抑制作用 山茱萸对自由基的抑制作用无中药 茶多酚对自由基的抑制作用。无中药 （5).山茱萸和半支莲不同比例的混合物对自由基的抑制作用荧光强度值没有明显的提高或降低，没有发现有明显的协同或负协同效应。空白 茶多酚半支莲山茱萸浓度/g/lΔF清除率/%浓度/g/lΔF清除率/%浓度/g/lΔF清除率/%0.10189.573.60.10120.346.70.10200.577.90.08175.468.10.08131.251.00.06189.973.80.06159.161.80.06118.946.20.04170.466.20.04143.755.80.04129.950.50.02141.354.90.02126.249.00.01103.540.20.0193.3236.20.008113.644.10.00886.833.70006100.039.00.00685.933.40.00497.437.80.00480.431.20.00288.434.40.00273.528.5不同浓度的中药及其清除率 5.数据处理茶多酚半支莲山茱萸斜率3.07相关系数0.999斜率15.3相关系数0.974斜率8.94相关系数0.978 用对苯二甲酸羟基化反应体系可以评价中药清除·OH的作用能力。可以粗略的得到一定浓度下各种中药的清除率。可以看出在一定的浓度范围内，中药颗粒浓度与其清除率大致成线性比例。在较高浓度范围山茱萸的清除自由基能力好于半支莲，而在低浓度时相反。三实验结论 创新点当前对中药的提取物的清除自由基研究已经比较多。而对使用的越来越广泛的中药配方颗粒的清除自由基的研究报道较少。本实验采用了市售的中药颗粒配方进行研究。 致谢感谢导师蔡继文教授给我这样一个独立的科学探索的机会，感谢实验室所有的师兄师姐对我的帮助，特别要感谢梁建洪师兄和周悦芸同学。最后要感谢化学院创新研究基金的大力支持。'