紫外分光光度法快速测定多菌灵农药残留研究

'http://www.paper.edu.cn紫外分光光度法快速测定多菌灵农药残留研究张婷甘肃农业大学农学院，甘肃兰州（730070）E-mail：zting1129@163.com摘要：本文通过大量试验，改进了紫外分光光度测定农药残留方法。本法是以甲醇(CH3OH)为中间渗透剂，使多菌灵农药残留在稀盐酸和三氯甲烷(CHCl3)间相互转移而实现净化的。改进后的方法操作简单，易于掌握，灵敏度高，线性关系良好(其线性回归方程为y=0.1972x-0.0009，相关系数r=0.9988)，回收率高，成本低，是一种值得推广的测定多菌灵农药残留的方法。关键词：多菌灵，紫外分光光度法，回收，改进1.引言多菌灵属于苯并咪唑类，英文通用名称为carbendazim，化学名称为苯并咪唑-2-基氯基甲酸甲酯，其分子式为C9N3H10O2。其纯品为白色结晶，熔点310℃（分解），几乎不溶于水，在有机溶剂中的溶解度分别为丙酮300mg/l，氯仿100mg/l，二氯甲烷68mg/l。可溶于稀无机酸和有机酸形成相应的盐。[1]多菌灵是一种低毒高效杀菌剂，按我国农药毒性分级标准属低毒广谱内吸性杀菌剂。其主要作用机制是干扰菌的有丝分裂中纺垂体的形成，从而影响细胞分裂，对许多子囊菌和[2]半知菌都有效，而对卵菌和细菌引起的病害无效。主要对水稻瘟病、三麦赤霉病、油菜菌[3、4]核病及棉花、蔬菜等的苗期病害均有过较好疗效，但80年代以来，病原菌对其抗性日[5]益严重。近年来，由多菌灵衍生出的新的农药产品和复配试剂不断出现，并不断用于防治[6~8]各种病害，其中，运用多菌灵有机酸盐防治各种作物贮藏期病害弊多菌灵具有更好的防[9，10]效。[11]根据联合国粮农组织（FAO）的规定，多菌灵在果蔬中的残留量应低于0.5mg/kg，[12]我国的国标规定与联合国粮农组织的规定相同（GB18406.1—2001）。[13][14]多菌灵残留量的测定方法有很多，如高效液相色谱分析法，红外光谱分析法，气[15][16][17][18]相色谱法，薄层扫描法，可见光比色法及紫外光谱法，荧光分析法等。相对于其他方法，紫外分光光度法易于掌握，且成本低廉的方法。但是，报道的紫外法提取、净化步骤比较烦琐且测定时间较长，本文通过大量的实验，对其测定方法进行了改进，改进后的方法操作步骤简单，缩短了测定时间，且方法的重复性、灵敏度也有所提高，特别适用于在小型农产品检测实验室推广。2.基本原理多菌灵是一种高效低毒的杀菌剂，是一种两性化合物，不溶于水，可溶于稀无机酸和有[19]机酸形成相应的盐，在酸性溶液中pKa=11.15,在碱性溶液中pKb=4.25,其在氯仿中的溶解度为100mg/l。多菌灵在稀盐酸中于281nm处有吸收峰，在278nm处有吸收谷，在290nm[20]处以上基本处于平衡，并且符合郎伯-比尔定律，因此以[A281nm-(A278nm+A290nm)/2]为校正值，和浓度作图可以测定多菌灵农药残留。-1- http://www.paper.edu.cn3.材料与方法3.1仪器、材料及试剂仪器：紫外分光光度计（美国热电）、全自动电子天平（瑞典梅勃公司）、台秤、酸度计、打样机、比色管、抽滤装置、吸管、移液管等。材料：番茄、韭菜、豆角等。试剂：盐酸（V/M=36-38%）、氯仿（分析纯）、无水乙酸、乙酸、甲醇、98%多菌灵干品、硅藻土等。3.2试验方法3.2.1试剂的配制1mol/l盐酸的配制：用量筒取172ml盐酸（V/M=36~38%）于2000ml容量瓶中，用蒸馏水定容。多菌灵标准液的配制：准确称取0.0500g多菌灵样品于250ml容量瓶中用1N盐酸定容，则为200mg/l的多菌灵标准贮备液。吸取此标准液50ml于100ml容量瓶中用1N盐酸定容，为100mg/l的多菌灵标准工作液。配制PH=6.5的乙酸-乙酸钠缓冲液：称取16.4g无水乙酸钠溶解于1000ml容量瓶中，冷却后用蒸馏水定容，用乙酸调PH至6.5。3.2.2试验方法将样品20g至于250ml三角瓶中，加入50ml乙酸-乙酸钠缓冲液，10ml甲醇，30ml氯仿，振荡30min后静置30min，然后加入2g硅藻土，抽滤，将滤液倒入100ml容量筒中，静置2min后吸取下层氯仿层25ml于比色管中，加入25ml1mol/l盐酸，振荡2ml后静置30min（在吸取氯仿时若不能吸取25ml则能吸取多少氯仿就相应加入多少1N盐酸）。吸取上层盐酸于紫外分光光计上测定278nm，281nm，290nm处的吸光值A。并使用△A=[A281nm-(A278nm+A290nm)/2]进行校正，将值代入标准曲线（图1）求出相应的浓度。4.结果与讨论4.1净化试剂的选择多菌灵是一种两性化合物，在碱性溶液中的pKb=4.25，在酸性溶液中的pKa=11.15，难溶于一般有机溶剂，因此利用NaOH—氯仿或HCl—氯仿的液液分配进行净化，因此设计了三种净化方法，分别加入0.5mg、0.25mg按实验方法做其回收率试验：①氯仿—NaOH溶液+氯仿—HCl溶液；②氯仿—NaOH溶液；③氯仿—HCl溶液。三种净化方法各做两个水平。其回收率公式为：回收率（%）=（回收量/加入量）*100。其测定结果如表1：由表1可以看出，采用氯仿—HCl溶液净化的效果最好，并且操作简单，试剂用的少，因此我们选择了氯仿—HCl溶液作净化试剂。-2- http://www.paper.edu.cn表1：净化试剂的选择净化方法加入量（mg）回收量（mg）回收率（%）氯仿—NaOH+0.500.47194.2氯仿—HCl0.250.24698.40.500.43687.2氯仿—NaOH0.250.22790.80.500.49897.8氯仿—HCl0.250.257102.8多菌灵溶液在PH=6.0~6.5时对紫外光的吸收最强，应将溶液的PH值调整为6.0~6.5，由于调整PH值很困难，所以选择了用缓冲液调整。由于乙酸-乙酸钠缓冲液是接近中性，可以用乙酸调整PH值为需要的PH值。因为大多数果蔬都呈弱酸性，所以一般将乙酸-乙酸钠调节为PH=6.5。由于多菌灵在甲醇中的溶解，且甲醇对多菌灵性状影响很小，为了使净化更加完全我们又选择了甲醇作中间渗透剂。4.2试剂加入量的选择为了选择试剂合适的加入量，按实验方法用用20ml的甲醇确定乙酸-乙酸钠的加入量，用50ml的乙酸钠缓冲溶液确定甲醇的加入量。（1）乙酸-乙酸钠缓冲液用量的选择：分别吸取1ml100mg/l的多菌灵标准液和20ml的甲醇于4个250ml三角瓶中，分别加入乙酸-乙酸钠缓冲液50ml，60ml，40ml，30ml，各加入氯仿30ml，振荡30min后各吸取下层氯仿25ml于50ml比色管中，分别加入25ml1N的盐酸后振荡2min后，静置30min。用紫外可见光光度计测定278nm，281nm，290nm处的吸光值A，求出相应的△A。各做一平行，其结果见表2。由表2可以看出缓冲液的加入量在30~60ml之间对测定值的影响不大，所以缓冲液的加入量在30~60ml之间都可以，本文为了量取方便选择了缓冲液的加入量为50ml。表2：缓冲液加入量的选择编多菌灵加缓冲液加甲醇加入分别的平均的号入量（ml）入量（ml）量（ml）△A△A0.16411.0030.020.00.1610.1580.16421.0040.020.00.1640.1630.15631.0050.020.00.1560.1560.15641.0060.020.00.1670.178-3- http://www.paper.edu.cn（2）甲醇用量的选择：分别吸取1ml100mg/l的多菌灵标准液和50ml乙酸-乙酸钠缓冲液于3个250ml三角瓶中，分别加入甲醇0ml，10ml，20ml，各加入氯仿30ml，振荡30min后各吸取下层氯仿25ml于50ml比色管中，分别加入25ml1N的盐酸后振荡2min后，静置30min。用紫外可见光光度计测定278nm，281nm，290nm处的吸光值A，求出相应的△A。各做一平行，其结果见表3。由表3显然可以看出甲醇的加入量为0ml，10ml时测得的△A最大，但由于在加入甲醇0ml（即不加甲醇）时测定值不稳定，而加入10ml甲醇时测定值较稳定（两次测定值相差0.001），因此选定甲醇加入量为10ml。表3：甲醇加入量的选择编号多菌灵加缓冲液加甲醇加入分别的平均的入量（ml）入量（ml）量（ml）△A△A0.16211.0050.00.00.1720.1830.17521.0050.010.00.1740.1740.15631.0050.020.00.1560.1564.3助滤剂硅藻土加入时间的选择由多次的试验发现在试验过程中过滤困难，所以我们在抽滤时加入了助滤剂硅藻土以加快过滤的速度，多次试验以后发现效果良好，在此对助滤剂硅藻土的加入时间进行了选择。吸取5个100mg/l的多菌灵标准液1ml，按2.3.2试验方法做，分别在振荡、振荡后、振荡后15min、振荡后30min加入2g硅藻土作助滤剂和不加助滤剂，各做一平行。在紫外可见光光度计上测定278nm、281nm、290nm处吸光值A，并求出相应的△A，其结果见表4。表4：助滤剂加入时间的选择加入时A278nmA281nmA290nm分别的平均的间△A△A0.1570.246-0.0070.171振荡前0.1720.1560.2400.0010.1720.1670.262-0.0070.182振荡后0.1810.1730.2670.0010.180振荡后0.1660.260-0.0070.1800.18015min0.1740.2690.0010.181振荡后0.1650.258-0.0060.1780.17530min0.1670.2560.0010.172不加助0.1660.257-0.0030.1750.176滤剂0.1710.2630.0010.177由表测定值可以看出与不加助滤剂相比，在不同时间加入助滤剂后测定的△A相差不大，这表明助滤剂对多菌灵没有吸附作用或吸附作用很小（可以忽略），为了做试验的方便-4- http://www.paper.edu.cn我们选择抽滤前加入助滤剂，即振荡后30min加入助滤剂。4.4试验回收率的测定为了检验本方法的可靠性，本试验用西红柿，韭菜，豆角样做回收率试验。分别称取粉浆的西红柿，韭菜，豆角样各20g两份，其中1#样加入1ml100mg/l的多菌灵标准液，2#样不加多菌灵标准液，按2.3.2试验方法做，各做一平行，并按2.3.2试验方法测定1ml100mg/l的多菌灵标准液在278nm、281nm、290nm处的吸光度A值，求出其△A。由于回收率（%）=[（∆A加入1ml多菌灵-∆A未加多菌灵）/∆A1ml多菌灵标准液]*100，测定后其结果见表5。所以由表5得出西红柿的回收率为98.86%，韭菜的回收率为105.71%，豆角的回收率为101.71%，回收率都离100很近，由此可以看出用此方法回收率高，是一种可行的方法。表5：回收率的测定试验样品未加多菌加入1ml多1ml多菌灵标回收率灵△A菌灵△A准液△A（%）西红柿0.0050.17898.86%韭菜0.0070.1920.175105.71%豆角0.0140.192101.71%4.5标准曲线的绘制及其线性关系：（1）标准曲线的绘制：分别吸取100mg/l的多菌灵标准0,0.25，0.50，0.75，1.00，1.25，1.50,1.75ml于八只三角瓶中，各加入50ml乙酸钠缓冲液，10ml甲醇，30ml氯仿，振荡30min后，静置30min，再加入2g硅藻土做助滤剂，抽滤，将滤液倒入100ml的量筒中，静置2min后吸取下层氯仿25ml于50ml比色管中。然后加入25ml1N的盐酸，振荡2min，静置30min后，以0ml的为参比用紫外分光光度计在279nm，282nm，291nm处分别测定吸光值A，以△A=[A282nm-(A279nm+A291nm)/2]为校正值△A，测得结果如表6，以△A为横轴，以浓度为纵轴绘制标准曲线（图1）。表6：标准曲线的绘制加入多菌灵的量（ml）对应的C多菌灵平均△A（mg/l）0.250.00830.0420.500.01670.0960.750.02500.1311.000.03330.1741.250.04170.2171.500.05000.2561.750.05830.276（2）标准曲线的线性关系：将表6结果进行最小二乘法线性回归作图（图1），得方程式：y=0.1972x-0.0009其相关系数..r=0.9988，说明本试验线性范围在0.0083~0.0500mg/l之间，线性关系良好，灵敏度较高。-5- http://www.paper.edu.cn5.结论多菌灵残留的测定对于其0.06药性和病原菌对其抗性的研究，y=0.1972x-0.00090.05提高农作物品质，以及对保护人0.04健康的安全性都有一定的意义。本文通过对净化试剂（确定0.03为氯仿—HCl溶液），波长（确0.02多菌灵浓度C定测定波长为278nm、281nm、0.01290nm），试剂用量（确定甲醇0加入量为10ml，乙酸-乙酸钠缓00.10.20.3冲液加入量为50ml），助滤剂的吸光值A加入时间（确定为振荡完静置30min后，即抽滤前）的选择以图1：标准曲线图及回收率试验和标准曲线的绘制，表明改进的方法简便易行，简化了试验过程，缩短了测定时间（与报道的方法相比减少了浸渍过夜、反复洗滤、调节PH值，浓缩样品提取液等步骤），灵敏度和回收率都较高，并且线性关系良好，成本低，是一种值得推广的一种测定多菌灵农药残留的方法。紫外光谱分析是基于测量苯并咪唑结构的特征吸收峰的光密度值二队多菌灵进行测量的，由于残存的微量杂质的干扰而影响定量计算，采用双波厂光密度差值法能较好的消除干扰，提高方法的灵敏度，减少分析误差。由于仪器及其他各方面原因，本文对多菌灵农药残留的测定仍有许多不足，希望大家多提出宝贵意见，对本试验进一步完善和提高。•6.致谢本文的试验写作和材料提供得到了甘肃省农科院田世龙老师和朱友春老师的大力帮助和指导，并且得到了甘肃农业大学崔志军老师的指导，在此一并表示衷心的感谢。-6- http://www.paper.edu.cn参考文献[1]中国标准出版社，中国农业标准汇编.植保与农药卷（上册）[M].北京：中国标准出版社，1998.585[2]林孔勋，杀菌剂毒理学[M]，北京；中国农业出版社，1995.，90~98。[3]沈阳化工研究院----杀菌剂组，内吸性杀菌剂多菌灵（苯并咪唑44#）研究（第一报）[J]，农药，1973，（1）：11~25。[4]农业部农药检定所，新农药手册[M]，北京，农业出版社，1989，348~350。[5]马什RW.内吸性杀菌剂[M]，北京，化学工业出版社，1983，152~157。[6]李俊凯，郭敦成，灭菌促长剂增效机理的初步研究[J]，中国农业科学，1999，32（2）：66~71。[7]郭敦成，姚安庆，蔡哲斌等，灭菌促长剂（枯萎立克）药效试验初报[J]，湖北化工，1999，（增刊）：95~96。[8]刘曙照，薄层---紫外法测定混合制剂中多菌灵和三唑酮的含量[J]，农药，1993，32（5）：28~29。[9]李俊凯，江定心，郭敦成，灭菌促长剂防治柑橘贮藏期病害的药效试验[J]，湖南化工，2000，30（5）：44~45。[10]李俊凯，易金兰，郭敦成，多菌灵草酸盐防治柑橘贮藏期病害的初步研究[J]，湖北农学院学报，2000，20（4），316~318。[11]中国农业百科全书编辑部，中国农业百科全书·农药卷[M],北京：农业出版社，1993，476~477。[12]中国农药百科全书编辑部，中国农业百科全书.农药卷[M]，北京：中国标准出版社，1993，476~477。[13]RodneyJB,heatherLH,jasothaKetal,Determinnationofcarbendaziminblueberriesbyreversedphasehigh-performanceliquidchromatography[J],1991,(587):321~324。[14]丁明，多菌灵红外光谱定量分析研究[J]，农药，1989，28（1）：16~17。[15]HideyoS.RapidandsystematicdetermationofthiophanatemethylbenomylandMBCbyacombinedmethodofaluminacolumnclean-upandUVspectrophotometry[J],AgrBioChem,1982,46(2):549~552。[16]陈建立，委敏怡，多菌灵薄层---紫外分析方法研究[J]，农药，1986，（4）：6~7。[17]李俊凯，易金兰，程玲，柑橘中多菌灵残留量紫外光谱分析[J]，湖北农学院学报，21卷，2001.（5），131~134。[18]MikioC,RajPSingh,High-performanceliquidchromatographicmethodforsimultaneousdeterminationofbenomylandcarbendaziminaqueousmedia[J],JAgricFoodChem,1986,34：108~112。[19]中国标准出版社，中国农业标准汇编•植保与农药卷（上册）[M]，北京：中国标准出版社，1998，585。[20]胡人卫，罗平，小麦中多菌灵残留的快速测定[J]，农药，1991，（1）：41~42。StudyonthedeterminationofCarbendazimResiduesbyUltravioletspectraphotometryZhangTingAgriculturalcollegeGansuagriculturaluniversity(730070)AbstractThemethodwhichdeterminescarbendazimresiduebyultravioletspectraphotometrywasimprovedthroughalotofexperiments.Themethodisusedtoclearedthecarbendatimresiduesdependingonthetransferenceofmethanol(CH3OH)andthemiddleosmoticmaterialsbetweenthediluteacidanddichloromethane(CHCl3).Theimprovedmethodhashighsensitivityandtherecoverablerate,remarkablelinearrelationship(thelinearregressionequalisy=0.1972x-0.0009andthecorrelationcoefficientisr=0.9988)andlowcost.Itcanbeunderstoodeasilyandworthytopopularize.Keywords:Carbendazim;Ultravioletspectraphotometry;Recoveryimprovement-7-'