紫外-可见分光光度法

'波长nm10-3~-2~1~102.7~104~106.2~108~109频率Hz1020-19~1017~1014.3~1012.8~1010.7~109~108波数cm-11010-9~107104.3102.880.10.01波段γ-射线X-射线紫外可见红外微波射频波谱γ-射线光谱X-射线波谱紫外光谱可见光谱红外光谱顺磁共振核磁共振跃迁方式核反应内层电子跃迁外层电子跃迁分子振动分子转动，核自旋1 第3章紫外－可见分光光度法（ultravioletandvisiblespectrophotometry;UV-vis）概念：研究物质在紫外-可见光区分子吸收光谱的分析方法。（近紫外光区200-400nm，可见光区400-760nm）Aλ2 分光：将复合光变成单色光叫分光可见光（400-760nm）红橙黄绿青蓝紫红外紫外610-780400-435分光系统3 特点：灵敏度高（10-6g/ml），简单方便。应用：1、定性分析2、定量分析发展趋势：与计算机联用及某些数学联用（如导数光谱）4 §1基本概念电子跃迁：σ-σ*、п-п*、n-п*、n-σ*（1）跃迁类型σσ*пп*nσ-σ*п-п*n-σ*n-п*成键成键未成键反键反键能量5 （2）吸收强度（ε）：I0与I相差越大，吸收越强。△EλI0I同型轨道跃迁几率大，吸收强；不同型轨道跃迁几率小，吸收弱。如п-п*吸收强，n-п*吸收弱。当ε>104，为强吸收；ε<103为弱吸收；ε=103-104为中吸收6 注意：吸收何种光（λ）与能级差有关（△E）吸收强度如何（ε）与跃迁机率有关。△EλI0I7 (1)σ-σ*跃迁：能级大，△E大，λmax小，σ-σ*的λmax<150nm，远紫外吸收。（2）п-п*跃迁：△E小a单个п键，λmax=200nm，末端吸收b共轭п键，λmax=210-250nm，ε>104。200nmλA末端吸收8 （3）n-п*跃迁，存在于-C=O，-C≡N，△E更小，λmax>250nm，ε=10-100。(4)n-σ*跃迁，存在于-OH、-NH2、—X等。λmax=200nm，末端吸收。9 λAA表示物质对不同光的吸收程度300400500600(二)术语吸收曲线(吸收光谱):以波长λ（nm）为横坐标，以吸光度A为纵坐标所描绘的曲线。10 吸收峰：曲线上吸收最大的地方，它所对应的波长称最大吸收波长（λmax）。谷：峰与峰之间的部位叫谷，该处的波长称最小吸收波长（λmin）。末端吸收：在图谱短波端只呈现强吸收而不成峰形的部分称末端吸收。Aλ吸收峰肩峰（sh）吸收谷末端吸收λmaxλmin11 生（发）色团：可引起电子跃迁的不饱和基团。主要为п-п*、n-п*跃迁，如C＝C、C＝O等。助色团：与发色团相连的饱和的杂原子或原子团。如－OH、－NH2、－OR、－SH、－SR、卤素原子等。12 红移（长移）：使吸收峰向长波方向移动。如助色团、共轭键的影响。蓝（紫）移（短移）：使吸收峰（λ）向短波方向移动。如共轭键减少或溶剂的影响。增色效应和减色效应：使吸收强度（ε）增加称增色效应。反之称减色效应或淡色效应。强带和弱带：化合物的紫外可见吸收光谱中，凡摩尔吸光系数值（εmax）大于104的吸收峰称为强带，凡εmax小于103的吸收峰称为弱带。13 （三）吸收带及其与分子结构的关系吸收带:说明吸收峰在紫外－可见光谱中的位置。可分为六种类型。R带：由n-п*跃迁引起的吸收带。如C＝O–NO等特点：（1）λmax>250nm（2）ε<100，为弱吸收（3）溶剂的极性越大，λmax减小200nm250nm14 例非极性溶剂极性溶剂Π*nΠ*n15 K带：由共轭双键中п-п*跃迁所产生的吸收峰。如等。特点：（1）λmax=210-250nm（2）ε>104，为强吸收（3）溶剂的极性越大，λmax越大200nm250nm16 п-п*跃迁，K带Π*ΠΠΠ*非极性溶剂极性溶剂17 п-п*跃迁，K带n-п*跃迁，R带，，200nm300nmAλK带R带18 B带：苯环骨架振动和环内共轭п-п*重叠所致，是芳香族化合物的特征吸收带。特点:(1)在非极性的溶剂中，B带230-270nm产生细微振动19 （2）在极性的溶剂中，细微结构消失，中心吸收带λmax=256nm附近，ε在200左右。（3）被取代时，细微结构消失（4）B带是有机化合物的特征谱带蒸气在环已烷中在水中240nm260nm256nm20 E带：由苯环结构中三个乙烯的п-п*所产生，分为E1和E2带。是苯环的特征吸收谱带。E1带：λ＝180nm，ε＝4.7×104。E2带：λ=200nmε＝7000。21 例：B带λmax增大，282nmE2带与K带合并，移至210-250nmBRK当苯环上有发色团取代并共轭时，E2带与K带合并，吸收带长移，且使B带长移。22 logε1030020010050040070060080012345远紫外区近紫外区可见光区σσ*пП*п*σ＊nn波长(nm)几种常见的紫外与可见吸收光谱п*nR带K带R带пП*K带23 运用：预测一个化合物的吸收带可能出现的范围及吸收带的类型。R带（250-500nm）п*n共轭K带（210-250nm）пП*24 (四)影响吸收带的因素1.位阻影响立体空间结构影响共轭效应。顺式二苯乙烯反式二苯乙烯同分异构体：25 2.跨环效应3.溶剂效应：除了影响吸收峰（λ）位置外，还影响吸收强度（ε）和光谱形状。溶剂极性对异丙叉丙酮的两种跃迁吸收峰的影响跃迁类型正已烷氯仿甲醇水迁移п-п*230238237243长移n-п*329315309305短移26 4.体系pH值的影响：主要是对弱酸弱碱性物质的影响。非极性溶剂极性溶剂非极性溶剂极性溶剂跃迁п*n跃迁п*п27 §2基本原理－吸光的定量关系一.参数1.入射光的强度I0I0b2.透射光的强度II3.透光率T＝I/I0百分透光率T％＝I/I0×100％4.比色池厚度：b5.样品浓度：C（mol/l，％）6.吸光度：A＝－logT=lg(I0/I)I0、I、C、b、T、A量的关系28 二.Lambert-Beer定律Lambert定律：C一定，A＝-logT=K1bBeer定律：b一定，A＝-logT=K2c两定律合并：A＝a·b·ca=K1K2a为吸收系数注：吸光度A是指某一波长（λ）下的吸光强度即入射光为单色光29 吸收系数：摩尔吸收系数(ε)：在一定条件下，当C＝1mol/l，b=1cm时的吸光度。百分吸收系数（E1cm1%）：一定条件下，当C＝1％，b=1cm时的吸光度。30 特征：1）ε、E均为特征常数2）ε、E是有条件的，同一物质，不同条件下所测值不同（波长不同、溶剂不同、温度不同等）。3）ε、E越大，测定吸光度灵敏度越高。4）ε=104-105为强吸收，103-104为中吸收，<103为弱吸收。5）用于定性判断，K带吸收大，ε、E大，R带的ε、E小。31 例：紫草素（C16H6O5288.3），2.00mg溶于100.0mlEtOH中，b=1cm，λmax=516nm，A=0.484.求ε、E注：若溶液中存在多种吸光物质时，吸光度将是各组分吸光度的总和。A总＝Aa+Ab+Ac+……＝εadCa+εbdCb+εcdCc+……I0a、b、cId注：每种物质的吸收度仅由本身的性质和C决定，与其它物质无关。32 吸光度A具有加和性，对同一物质来说浓度（C）吸光度（A）001CA2C2A3C3A4C4A工作曲线CA负偏离正偏离线性范围：线性范围越大越好。C133 三、偏离Beer定律的因素1)化学因素：离解、缔合、配位等化学变化，使吸光物质形态发生变化。溶剂、pH、温度等影响。A＝a·b·c影响吸收系数a的因素有：1、物质的性质2、波长的不同3、其它因素如溶剂的影响等34 ε×104亚甲蓝阳离子水溶液的吸收光谱abc(a)6.36×10-6mol/l(b)6.36×10-4mol/l(c)6.36×10-3mol/lCA负偏离610nm660nm35 2、光学因素（1）单色光的纯度Λ2λ1AλAλBeer定律前题：入射光是单色光。36 单色光I0I单色器复合光狭缝I0比色池760nm400nm可见光II/2谱带宽度:狭缝具有一定宽度，使分离出的光同时包含了所需波长的光和附近波长的光。常用半峰宽来表示。单色光的谱带宽s=λ2-λ112λ510-520透光强度37 谱带宽度的值愈小，单色性愈好。但因仍是复合光，故仍可以使吸光度变小而偏离Beer定律。38 （2）杂散光:与所需波长相隔较远的光。IoIsIIs<39 （4）非平行光（3）散射、反射克服方法：比色池：擦干净溶液：溶液均一，透明；用空白作参比。克服方法：比色池位置放正确，与光路垂直。40 3.透光率测量误差：△T（是偶然误差，来自噪声）读数精度41 透光率T%吸光度A△C/C×100%0.022±10.2800.0972.8700.1552.00.0221.630.3991.360.5231.38200.6991.55101.0002.17不同T%或A时的浓度相对误差（△T=±0.5%）42 结论：当A值在0.2-0.7，相对误差较小，是测量最适宜范围。△C/CA0.20.7A=0.434T%=36.8%43 §3显色反应及其显色条件的选择一、有色物质的测定二、显色后物质的测定44 1、显色剂与显色反应显色反应：在光度分析中将被测组分转变为有色化合物的反应。显色剂：与被测组分反应生成有色化合物的试剂，称为显色剂。二、显色后物质的测定45 1、灵敏度高从ε来判断2、选择性好3、稳定性好显色反应生成有色化合物组成稳定。4、显色剂在测定波长处无明显吸收一般要求两者最大吸收波长相差60nm5、反应具化学计量关系显色反应的选择原则46 1）显色剂的选择：生成物稳定，且有一定的计量关系。2）溶剂：根据反应物、生成物的溶解度确定。2、显色条件的选择47 3）显色剂的用量：应加入略过量的显色剂。ababAACC48 4）酸度溶液酸度的影响是多方面的。（1）对显色剂颜色的影响（2）对显色反应影响5）显色时间：abAt注：确定实验方法要考察稳定性。6）显色温度：显色反应进行与温度有关。49 3、反应条件的控制确定反应条件，需通过实验考察，已确定的实验条件，不应随意更改条件。50 §4测量条件的选择1、测定波长的选择：选择原则“吸收最大，干扰最小”。如出现几个最大吸收波长时，选择干扰最小，吸光度较大而且平坦的最大吸收波长。2、控制吸光度测量范围吸光度控制在0.2-0.7。方法：调节溶液的浓度改变吸收池的厚度51 3、选择适宜的空白（参比）溶液种类：（1）溶剂空白：溶剂作为空白。适用：溶液中只有被测组分对光有吸收，其它组分对光无吸收。（2）试剂空白：与样品相同条件下，不加试样溶液，其余均加。适用：测定条件下，显色剂或其它试剂、溶剂对待测组分测定有干扰的情况。52 （3）试样空白：如为显色反应，只是不加显色剂所制备的溶液。适用：试样基体有色并在测定条件下有吸收。53 药物中微量铁的测定在2只25ml容量瓶中,用吸量管分别加入0.00,1.00ml铁标准溶液,分别加入1ml盐酸羟胺,2ml邻二氮菲,5ml醋酸-醋酸钠缓冲液,用水稀释至刻度后摇匀,主置10min.用1cm比色皿,以试剂为空白,在所选波长下,测量吸光度。54 单色光I0I单色器复合光狭缝I0比色池检测器记录§5紫外-可见分光光度计55 一、组成：光源－单色器－吸收池－检测器－记录钨灯、氘灯狭缝、色散元件、准直镜比色池、比色皿光电池、光电管、光电二极管阵列指针显示、数字显示56 光源要求：发射强度足够且稳定具有连续光谱钨灯和钨卤灯：发射光能的波长覆盖宽，但紫外区很弱。常取波长大于350nm的光为可见区光源。寿命达10000小时。氢灯和氘灯：发射波长为150-400nm的连续光谱。使用时间1000小时。57 单色器将光源的连续光谱变成单色光。组成：进口狭缝、准直镜、色散元件、出口狭缝进口狭缝出口狭缝色散元件准直镜混合光单色光58 1）色散元件：棱镜和光栅棱镜:对不同波长的光有不同的折射率。缺点：色散后光谱按波长排列疏密不均，长波区密，短波区疏。为非均匀分布光谱。分光系统红紫59 光栅:利用光的干涉作用。光特点：色散后的光谱，各谱线间距离相等，是均匀分布的连续光谱。60 2）准直镜：以狭缝为焦点的聚光镜。将发散光变为平行光，将色散后的平行光聚焦。61 3）狭缝：狭缝宽度直接影响分光质量。过宽，单色光不纯，太窄，光通量小，降低灵敏度。62 吸收池（比色池、比色皿）2）用玻璃制成的吸收池，只能用于可见光区。3）用石英制成的吸收池，可用于紫外光区。1）型号有：0.5、1.0、2.0、5.0cm63 4）吸收池两光面易损蚀，应注意保护，装溶液时，要擦净。若被污染，要洗净。使用前进行检查：透光率检查：以空气为参比空气T%=100%，比色皿应T%>84%64 5）使用时：应选择透光率误差小于0.5%比色皿配对使用。配对性检查：溶液于440nm处测定透光率。6）应注意比色池在光路中的位置要正确。65 检测器将光能转变成电能的装置。光电池：是一种光敏半导体。要求：灵敏度高，噪声低分类：硒光电池和硅光电池。特点：光电流大小与照射光强成正比。光电流不易放大，光强弱时，不能测量。易“疲劳”，不能长时间使用。A66 光电管光阳极光敏阴极放大器指示器特点：电流可放大，较有高灵敏度。有“疲劳现象”67 光电倍增管光档板倍增极（共9个）阳极光电倍增管大大提高了仪器测量的灵敏度。68 光二极管阵列检测器：由一系列的二极管紧密排列在一块硅晶体片上组成。光例：HP8452A型二极管阵列：波长范围为190-820nm，二极管316个。λA特点：测量速度快69 信号显示系统（记录系统）分类：指针显示数字显示T%0100%50%0A721型分光光度计显示系统T%100%50%0A721型分光光度计显示系统70 三、几种光路的仪器1、单光束（传统）特点：仪器结构简单，灵敏度高，但对光源发光强度稳定性要求高。71 2、双光束：普遍被采用。特点：可减免因光源强度不稳而引入的误差，但灵敏度较单光束差。72 3、二极管阵列特点：全波长测定，测定速度快。73 §5分析方法一、定性方法光谱特征：光谱形状、吸收峰数目、吸收峰波长位置（峰形、峰数、峰位）定性依据：1、结构相同的化合物在相同条件下有完全相同的吸收光谱。2、吸收光谱不同，一定不是相同物质。3、吸收光谱相同，可能是相同物质。74 1.比较吸收光谱将试样与标准样品谱图或文献所载的标准图谱进行核对。定性鉴别方法：75 醋酸氢化可的松醋酸可的松醋酸泼尼松局限性：不同种化合物可以有雷同的吸收光谱，因此得到相同的吸收光谱，应考虑并非同一物质的可能。76 对比法1、比较吸收光谱特征数据λmax、εmax一致性安宫黄体酮决诺酮77 2、比较吸光度（吸光系数）的比值不只一个吸收峰的化合物，可用在不同吸收峰处测得吸光度比值作为鉴别的依据。可消除绝对误差(或浓度、吸收池厚度)。例：中国药典规定：B12在361nm、278nm吸光度的比值应为1.70-1.88;361nm、550nm比值为3.15-3.45。78 作用：推断发色团及其之间的共轭关系，推断分子的骨架。１、饱和碳氢化合物这类化合物在200-400nm没有吸收，在紫外吸收光谱分析中常用作溶剂。二、结构分析79 3、含有K带吸收，有共轭双键。2、在200nm左右有吸收，可能有孤立双键。4、含有R带吸收，有C＝O等键5、含有B带，有苯环80 三、纯度检测：1、杂质检查A化合物无吸收杂质强吸收则含少量杂质可用光谱检查出来81 B化合物强吸收杂质无吸收杂质存在使化合物的表观吸收系数值降低C化合物强吸收杂质更强吸收杂质存在使化合物的表观吸收系数值升高82 2、杂质限量检测：肾上腺素中含杂质肾上腺酮在310nm处，A<0.05310nm肾上腺酮肾上腺素83 §5定量分析方法测定条件：①波长的选择②控制A大小③选择合适的溶剂84 选择合适的溶剂选择原则：a安全、无毒b被测物的溶解度大C不干扰：许多溶剂本身在紫外光区有吸收峰，所选用的溶剂应不干扰被测组分的测定。截止波长：10mm光径长度透过率<25%（A=0.6020）的波长。组分的测定波长必须大于溶剂的截止波长。85 溶剂极性截止波长（nm）危险性蒸馏水78.5<200无正已烷1.9199易燃无水乙醇24.3215易燃甲醇32.6215易燃/有毒环已烷2.0211易燃/有毒氯仿4.8245易燃/有毒二甲亚砜无270有毒丙酮20.7331易燃一些常用溶剂性质86 注：使用易挥发性溶剂，最好用带盖的样品池，以防溶剂挥发，改变样品浓度。综上所述：常用溶剂中水、异丙醇、甲醇、乙醇首选水，其次是甲（乙）醇。甲醇用途广范：原因主要是粘度小，色散小。异丙醇有溶解气泡的能力，折射光少，但价格较高。87 一、单组分样品的定量方法（一）吸光系数法根据公式或计算物质浓度的方法，也称绝对法。例1：VB12的水溶液在361nm处的b=1cm，测得A=0.414，则溶液浓度为？88 例：B12样品25.0mg用水溶成1000ml后，盛于1cm吸收池中，在361nm处测得吸光度A为0.507，则：求其纯度？89 （二）、工作曲线法（标准曲线法）步骤：①标准曲线的绘制配制系列标准溶液，测定吸光度，绘制曲线。②测定样品吸光度。③计算样品浓度。90 1、配制系列标准溶液，测定吸光度，绘制曲线。标准曲线的绘制ACACAC91 2、影响标准曲线不通过原点的原因：（1）空白溶液的选择和配制不当，不能完全消除干扰。（2）显色反应不够灵敏，被测组分低于某一浓度时不能显色，无吸光度。（3）吸收池的厚度或光学性能不一致；吸收池位置安放不妥；吸收池透光面不洁净等。92 计算样品的浓度方法：1、作图法2、建立回归方程93 相关系数（r）：显示所测数据的线性关系。00.999以上为好。造成r不合要求的原因:a操作者操作误差太大.减免方法:重新操作.b所选浓度范围不对,太大或太小,重新浓度范围.94 标准曲线法应注意的问题（1）制备一条标准曲线至少要5个点（2）待测样品浓度应包括在标准曲线浓度范围内（3）待测样品和对照品必须使用相同的溶剂系统和显色系统，并在相同条件下测定。（4）仪器更换元件，维修或重新校正波长时，必须重新制作标准曲线。95 （三）对照法在同样条件下配制标准溶液和样品溶液，在选定波长处，分别测量吸光度。使用条件：a通过原点时可用。单点法对照法96'