DB13T 1090-2009 饲料用酶制剂中木聚糖酶活力测定—分光光度法

'ICS65.120B46DB13河北省地方标准DB13/T1090-2009饲料用酶制剂中木聚糖酶活力的测定—分光光度法2009-06-17发布2009-07-02实施河北省质量技术监督局发布 DB13/T1090-2009前.占.曰本标准由河北省畜牧兽医局提出。本标准起草单位:河北省饲料产品质量监督检验站、石家庄市畜产品质量监测中心、河北省畜牧本标准主要起草人:武英利、王萍、左晓磊、闺超、王作艳、李广东。 DB13/T1090-2009饲料用酶制剂中木聚糖酶活力的测定分光光度法1范围本标准规定了饲料用酶制剂中木聚糖酶活力的单位定义和测定方法。本标准适用于饲料用酶制剂中木聚糖酶活力的测定，不适用于饲料中木聚糖酶活力的测定。2规范性引用文件下列文件通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注明日期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注明日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GB/T6682-2008分析实验室用水规格和试验方法3术语和定义下列术语和定义适用于本标准。3.1木聚糖酶活力单位在500C,pH5.5的条件下，1min水解木聚糖生成15mol木糖所需的酶的量，规定为一个酶活力单位。4原理木聚糖酶水解木聚糖生成木糖和木二糖等低聚糖，生成的木糖在沸水浴条件下还原3,5一二硝基水杨酸，生成棕红色的3-氨基一5一硝基水杨酸，溶液颜色与酶解产生的木糖量成正比，而木糖的生成量与酶的活力成正比，用分光光度计测定其吸光度值，依据吸光度值计算其酶活力。5仪器和设备5.，分析天平:感量0.0001g05.2研钵。5.3容量瓶:50mL,100mL05.4电炉:温度可调。5.5恒温水浴摇床:温控范围30℃土0.20C"--60℃土0.20C.5.6烧杯:200mL,250mL05.7砂芯玻璃滤器:孔径0.455m05.8酸度计:精确至0.0105.9秒表。5.10离心机:6000r/min05.11移液器:精度105l05.12分光光度计。5.13比色管:25mL06试剂 DB13/T1090-2009方法中所用试剂，除另有规定外均为分析纯试剂，所用水应符合GB/T6682-2008三级以上用水要求。6.1氢氧化钠。6.2冰乙酸。6.3三水乙酸钠(CH3COONa"3H2O)06.43,5一二硝基水杨酸。6.5四水酒石酸钾钠(C4H刀6.4H刃)。6.6苯酚。6.7无水硫酸钠。6.8木糖:含量大于99%06.9木聚糖。7溶液7.1氮氧化钠溶液，浓度200g/L称取20.0g氢氧化钠，加水溶解，用水定容至100mL07.2乙酸溶液，浓度0.1mo比吸取冰乙酸0.60mL，加水溶解，用水定容至100mL07.3乙酸钠溶液，浓度0.1mo巩称取三水乙醚钟1.36g，加水溶解，用水定容至‘OOmL07.4乙酸一乙酸钠缓冲液，pH5.5称取三水乙酸钠23.14g，加冰乙酸1.70mL用水溶解，并定容至2000mL，用乙酸溶液或乙酸钠溶液调pH值至5.5o7.5DNS试剂(3,5一二硝基水杨酸试剂)称取3,5一二硝基水杨酸3.15g，溶解于500mL水中，搅拌5s，水浴加热至4590。缓缓加人100mL氢氧化钠溶液，同时不断搅拌，直到溶液澄清(此过程温度不要超过48-C)。再依次加人四水酒石酸钾钠91.0g，苯酚2.50g，无水硫酸钠2.50g，继续45℃水浴保温，同时补加水300mL，搅拌至完全溶解。冷却至室温后，用水定容至1000mL，用砂心滤器过滤，滤液储存于棕色瓶中，室温下保存7d后使用，有效期6个月。7.6木糖标准溶液，浓度1005moVmL精密称取木糖1.5013g，加乙酸一乙酸钠缓冲溶液溶解，定容至100mL，摇匀即为1005mol/mL的木糖标准溶液。7,7木聚糖溶液，浓度8.0叭称取木聚糖0.80g于100mL烧杯中，加人60mL乙酸一乙酸钠缓冲溶液，置磁力搅拌器上搅拌并缓慢加热，直至完全溶解，然后停止加热，再搅拌30min，用乙酸一乙酸钠缓冲溶液转移并定容至100mL,摇匀。4℃避光保存，有效期3do8试样的选取和制备选取具有代表性的试样用四分法缩减至200g，粉碎至0.25mm，装人密封容器中，备用。9分析步骤9.1木糖标准工作曲线的绘制9.1.1准确量取100umol/mL木糖标准液0,1.0,2.0,3.0,4.0,5.0,6.0mL置7支比色管中，分别用乙酸一乙酸钠缓冲溶液定容至100mL，配制成0,1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.05mol/mL的标准 DB13/T1090-2009工作溶液。9.1.2准确量取9.1.1的标准工作溶液各1.00mL，分别置7支比色管中，各加人乙酸一乙酸钠缓冲溶液2.00mL和DNS试剂2.5mL，在沸水浴中显色3min(准确计时)，用水冷却至室温，加蒸馏水至刻度，摇匀，作为标准测试溶液。9.1.3以0浓度标准测试溶液为空白对照，在480nm处测定吸光度值。以木糖浓度为纵坐标(Y轴)，吸光度值为横坐标(X轴)计算出标准曲线回归方程。9.2待测酶液的制备9.2.1称取试样0.5-2g(精确至0.0002g)置研钵中，用少量乙酸一乙酸钠缓冲溶液湿润，研磨3min，加人15mL乙酸一乙酸钠缓冲溶液混匀，静置，将上层清液转移至100mL容量瓶中。9.2.2沉渣部分继续研磨3min，再用10mL乙酸一乙酸钠缓冲溶液混匀，静置，将上层清液转移至容量瓶中。9.2.3重复9.2.2操作至少3次，将试样全部转移至容量瓶中，用乙酸一乙酸钠缓冲溶液定容至刻度，摇匀。9.2.4取9.2.3溶液20mL6000r/min离心10min，吸取上清液适量，用乙酸一乙酸钠缓冲溶液稀释至酶活力0.2U/mL^-0.4U/mL供试验用。9.3测定9.3.1样品空白测定溶液9.3.1.，准确量取9.2.4稀释酶液1.00mL置于25mL比色管中，置温度50℃土0.290、振摇速度100次/分钟的水浴摇床中预热10min，加入2.5mLDNS试剂，置沸水浴中加热3min(准确计时)，用水冷却至约50909.3.1.2加2.00mL木聚糖溶液(经过50℃预热的)至9.3.1.1比色管中，置温度50℃士0.290、振摇速度100次/分钟的水浴摇床中保温10min(准确计时)。用水冷却至室温，加蒸馏水至刻度，作为样品空白测试溶液。9.3.2样品测定溶液9.3.2.1准确量取9.2.4的稀释酶液1.00mL于25mL比色管中，置温度50CC10.29C、振摇速度100次/分钟的水浴摇床中预热10min，加人2.00mL木聚糖溶液(经过50℃预热的)，置上述水浴摇床中保温10min(准确计时)，立即加人2.5mLDNS试剂终止反应。9.3.2.2将9.3.2.1比色管置沸水浴中加热3min(准确计时)，用水冷却至室温，加蒸馏水至刻度，作为样品测试溶液。9.3.2.3以0浓度标准测试溶液为空白对照，在480nm波长处测定样品空白和样品测试溶液的吸收度，用标准曲线回归方程计算出对应的木糖的量。9.4结果计算和表述9.4.1结果计算木聚糖酶活力按(1)式进行计算:WxnX=(I)lOxM式中:X-一一酶活力单位，U/g.w—用回归方程计算出的试样溶液相当的木糖量，5mol;n—试样溶液总稀释倍数;10-酶反应时间，min;M—试样质量，g09.4.2结果表述每个样品应取2份平行样进行测定，以其算术平均值为分析结果，结果保留整数。 DB13/T1090-200910孟复性两平行测定结果的允许相对偏差不超过3.0%.'