实验四原子吸收分光光度法测定金属元素含量

'兰州理工大学现代生物仪器分析实验指导书（四年制生物工程、食品科学与工程专业）王永刚编写生命科学与工程学院二零一二年十月 目录实验一、紫外吸收光谱法同时测定Vc和VE3实验二气相色谱法测定酒或酊中C2H5OH含量5实验三高效液相色谱法测定维生素B1含量7实验四原子吸收分光光度法测定金属元素含量10 实验一、紫外吸收光谱法同时测定Vc和VE一、实验目的1．掌握Cary50紫外可见分光光度计的使用；2．学会用解联立方程组的方法，定量测定吸收曲线相互重叠的二元混合物。二、方法原理维生素C（抗坏血酸）和维生素E（生育酚）起抗氧剂作用，即它们在一定时间内能防止油酯变酪。两者结合在一起比单独使用的效果更佳，因为它们在抗氧剂性能方面是“协同的”。因此，它们作为一种有用的组合试剂用于各种食品中。抗坏血酸是水溶性的，生育酚是酯溶性的，但它们都能溶于无水乙醇，因此，能用在同一溶液中测定双组分的原理来测定它们。根据朗伯—比尔定律，用紫外—可见分光光度法很容易定量测定在此光谱区内有吸收的单一成分。由两种组分组成的混合物中，若彼此都不影响另一种物质的光吸收性质，可根据相互间光谱重叠的程度，采用相对应的方法来进行定量测定。如：当两组分吸收峰部分重叠时，选择适当的波长，仍可按测定单一组分的方法处理；当两组分吸收峰大部分重叠时，则宜采用解联立方程组或双波长法等方法进行测定。解联立方程组的方法是以朗伯—比尔定律及吸光度的加合性为基础，同时测定吸收光谱曲线相互重叠的二元组分的一种方法。从图中可以看出，混合组分在λ1的吸收A组分和B组分分别在λ1的吸光度之和Aλ1A+B，即Aλ1A+B=κλ1AbcA+κλ1BbcB同理，混合组分在λ2的吸光度之和Aλ2A+B应为Aλ2A+B=κλ2AbcA+κλ2BbcB若首先用A，B组分的标样，分别测得A，B两组分在λ1和λ2处的摩尔吸收系数κλ1A，κλ2A和κλ1B，κλ2B，当测得未知试样在λ1和λ2的吸光度Aλ1和Aλ2后，解下列二元一次方程组：Aλ1=κλ1AbcA+κλ1BbcBAλ2=κλ2AbcA+κλ2BbcB即可求得A，B两组分各自的浓度cA和cB。一般来说，为了提高检测的灵敏度，λ1和λ2宜分别选择在A，B两组分最大吸收峰处或其附近。三、仪器和试剂仪器：Cary50紫外可见分光光度计：美国瓦里安中国有限公司；石英比色皿2只；50mL容量瓶9只，；10mL吸量管2只。试剂：抗坏血酸：称3mg抗坏血酸，溶于无水乙醇中，并用无水乙醇定容于100mL；生育酚：称8mg生育酚溶于无水乙醇中，并用无水乙醇定容于100mL四、实验步骤1.配制标准溶液（1）分别取抗坏血酸贮备液1.00、1.50、2.00、2.50mL于4只10mL比色管中，用无水乙醇稀释至刻度，摇匀。 （2）分别取生育酚贮备液1.00、1.50、2.00、2.50mL于4只10mL比色管中，用无水乙醇稀释至刻度，摇匀。2.绘制吸收光谱以无水乙醇为参比，在320~220nm范围测绘出抗坏血酸和生育酚的吸收光谱，并确定和。3.绘制标准曲线以无水乙醇为参比，在波长和，分别测定步骤1配制的8个标准溶液的吸光度。4.未知液的测定取未知液5.00mL于50mL容量瓶中，用无水乙醇稀释至刻度，摇匀。在和分别测其吸光度。五、数据处理1.绘制抗坏血酸和生育酚的吸收光谱，确定和。2.分别绘制抗坏血酸和生育酚在和时的4条标准曲线，求出4条直线的斜率，即、、和。3.计算未知液中抗坏血酸和生育酚的浓度。六、问题讨论1．今有吸收光谱曲线相互重叠的三元体系混合物，能否用解联立方程组的方法测定它们各自的含量？2．设计一个用双波长法测定本实验内容的实验方案。七、实验报告要求Vc、VE紫外扫描图，四条标准工作曲线（要求编辑成WORD文档打印，并作标注）结果计算报告 实验二气相色谱法测定酒或酊中C2H5OH含量一、目的要求1．学习气相色谱法测定含水样品中的C2H5OH含量。2．学习和熟悉氢火焰检测器的调试及使用方法。3．学习和掌握色谱内标定量方法。二、实验原理内标法是一种准确而应用广泛的定量分析方法，操作条件和进样量不必严格控制，限制条件较少。当样品中组分不能全部流出色谱柱，某些组分在检测器上无信号或只需测定样品中的个别组分时，可采用内标法。内标法就是将准确称量的纯物质作为内标物，加入到准确称取的样品中，根据内标物的质量m。与样品的质量m及相应的峰面积A求出待测组分的含量。待测组分质量mi与内标物质量ms之比等于相应的峰面积之比。式中：fi、fs——为i组分和内标物的相对质量校正因子；Ai、As——为i组分和内标物的峰面积。三、实验用品1．仪器VarianCP3800毛细管气相色谱仪氢火焰检测器（FID）石英毛细管色谱柱（30m×0.32mm，涂层厚0.25mm）微量注射器容量瓶（50mL）吸量管（2mL、5mL)2．药品：C2H5OH无水AR;n-C3H7OH无水AR3．其它：食用酒酊剂检品四、操作步骤1．色谱操作条件柱温升温程序：60℃1min，10℃/min升至200℃，并维持5min.进样温度200℃，检测器温度300℃，N2（载气）流速1.0mL·min-1，分流比20：1， H2流速为30mL·min-1，空气流速300mL·min-1，尾吹气25ml/min.2．标准溶液的测定准确移取2.50mL无水C2H5OH和2.50mL无水n-C3H7OH于50mL容量瓶中，用蒸馏水稀释至刻度，摇匀。用微量注射器吸取0.2μL标准溶液，注入色谱仪内，记录各峰的保留时间tR，测量各峰的峰面积，求以n-C3H7OH为标准的相对校正因子。3．样品溶液的测定准确移取5.00mL酒样及2.50mL内标物无水n-C3H7OH于50mL容量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀。用微量注射器吸取0.2μL样品溶液注入色谱仪内，记录各峰的保留时间tR，以标准溶液与样品溶液的tR对照，定性样品中的醇，测定C2H5OH、n-C3H7OH的峰高及半峰宽，求样品中C2H5OH的含量。五、数据处理本实验C2H5OH的含量按下列公式计算：式中：ρi——C2H5OH的质量浓度（单位为g·mL-1);mi——样品中C2H5OH质量（单位为g);V——样品溶液体积（单位为mL);10——稀释倍数；Ai/As——样品溶液中C2H5OH与n-C3H7OH的峰面积比；Ai′/As′——标准溶液中纯C2H5OH与n-C3H7OH的峰面积比；mi′——标准溶液中纯C2H5OH的质量，它等于体积V乘密度ρ。六、思考题1.内标物的选择应符合哪些条件？用内标法定量有何优缺点？2.热导检测器和氢火焰检侧器各有什么特点？七、实验报告要求附标准溶液和样品溶液色谱图（要求编辑成WORD文档打印，并作标注）结果计算报告（注意：计算需要无水C2H5OH和无水n-C3H7OH密度，实验中根据标签记录） 实验三高效液相色谱法测定维生素B1含量一、实验目的1.学习和掌握含维生素样品的处理和HPLC检测方法。2.进一步了解高效液相色谱仪的使用操作性能。3.掌握标准工作曲线的建立、数据的处理及定量分析。二、实验原理果蔬及其制品、各种饮料制品中的主要维生素B1可用高效液相色谱进行测定。样品经过酸水解处理、离心及超滤，用C-18反相柱和甲醇-庚烷磺酸钠溶液作流动相，在紫外280nm处定量测定。本法可同时测定维生素B2、B3、B6、B12及烟酰胺等多种维生素含量。三、材料与仪器材料：果汁。仪器：100ml量筒、烧杯、移液管、高效液相色谱仪、分析天平、0.45μm滤膜、溶剂过滤器、样品过滤器，微量进样器等。四、试剂冰醋酸、三乙胺、庚烷磺酸钠为分析纯；甲醇为色谱纯；维生素B1标准品（纯度大于98%）。流动相的制备：0.005mol/L庚烷磺酸钠（0.05%三乙胺和0.5%冰醋酸）-甲醇（72:28）用0.45μm膜过滤，置超声波振荡仪上脱气1h，待用。维生素B1标准母液配制（1mg/mL）：称取维生素B1100mg，加适量水，置65℃水浴中振摇15分钟，冷却至室温，定容至100mL。五、操作步骤（一）样品制备取5mL果汁至烧杯中，用流动相定容至100mL容量瓶中，再用0.45μm微孔滤膜过滤，作为待测液。（二）色谱条件色谱柱:十八烷基硅烷键合硅胶填料Octadecylsilyl，简称ODSC-18柱（4.6mm×250mm，5μm）； 流动相：0.005mol/L庚烷磺酸钠（0.05%三乙胺和0.5%冰醋酸）-甲醇（72:28）流速：1.0ml/min检测波长：UV280nm柱温：30℃进样量：20μl（三）标准曲线的制作取维生素B1标准液，用倍比稀释法稀释成0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0μg/ml浓度，进样量为20μl，进行分离，并以各种维生素B1的浓度对峰高（或峰面积）分别制成标准曲线。在标准曲线的线性范围内进行样品中各种维生素B1含量的测定。（四）样品测定取样品处理液20μl进行色谱分析，以标准色谱图进行对照，根据保留时间确定样品中的维生素B1，并计算含量。六、计算按下列公式计算样品中维生素B1的含量（C）C=N*（H/Hm）*F.50.（V/W）.（1000/1000）式中：C—各种维生素的含量，以mg/kg（L）表示N—20μl维生素含量μg/20μlH—样品中某种维生素的峰高（mm）Hm—标准溶液中某种维生素的峰高（mm）F—稀释倍数V—样品的定容体积（100ml）W—样品的称取量（g或ml）七、注意事项上机之前对各样品及标样用0.45μm膜过滤2ml左右，并用剩余的样品测pH值，pH小于2.5不能上机。手动进样时必需用力均匀，水平注入，避免进样引起误差。八、实验报告要求1、各浓度标准维生素的洗脱图2、样品洗脱图。（要求编辑成WORD文档打印）3、绘制标准工作曲线（在EXCEL中进行打印）。 4、结果计算报告思考题1、维生素B1的测定—HPLC法中样品峰的定性依据是什么？2、通过本次实验要想得到分离效果较好的样品洗脱图谱的工作条件主要取决于哪些？3、HPLC法测定维生素B1与其它方法比较有哪些优点？ 实验四原子吸收分光光度法测定金属元素含量一、实验目的1．掌握原子吸收分光光度法的特点及应用；2．了解原子吸收分光光度计的结构及其使用方法。二、原子吸收光谱法的基本原理原子吸收光谱分析是基于从光源中辐射出的待测元素的特征光波通过样品的原子蒸气时，被蒸气中待测元素的基态原子所吸收，使通过的光波强度减弱，根据光波强度减弱的程度，可以求出样品中待测元素的含量。利用锐线光源在低浓度的条件下，基态原子蒸气对共振线的吸收符合朗伯—比尔定律式中，A为吸光度，I0为入射光强度，Iv为经原子蒸气吸收后的透射光强度，K为吸光系数，l为辐射光穿过原子蒸气的光程长度，N为基态原子密度。当试样原子化，火焰的绝对温度低于3000K时，可以认为原子蒸气中基态原子的数目实际上接近原子总数。在固定的实验条件下，原子总数与试样浓度c的比例是恒定的，则等式（1）可记为：A==K’c是原子吸收分光光度法定量分析的基本关系式。常用标准曲线法、标准加入法进行定量分析。三、仪器设备1）原子吸收分光光度计2）50mL容量瓶3）250mL容量瓶4）分析天平5）铜、钙、铅等的空心阴极灯 四、试剂1．标准贮备液（1000ug/mL）2．标准使用液（100ug/mL）准确吸取10mL上述标准贮备液于100mL容量瓶中，用水稀释至刻度线，摇匀备用。五、试验步骤1.样品前处理样品消化或灰化。2.配制标准工作液3.配制样品溶液准确吸取适量样液置于25mL容量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，使测定结果落在标准曲线范围内。4.测定开机前先检查水封是否有水，乙炔管道有无泄漏（空气中有无乙炔气味）,打开抽风机打开电脑以及原子吸收分光光度计电源开关。分析方法设计进入软件→点文件→选择新建→选择分析方法（火焰法、石墨法、氢化物法等）→分析任务选择（Cu、Pb、Ca等）→填写数据表（批数、个数、测量次数、稀释倍数）→展开→完成→仪器控制→点击自动波长→精调→完成→检测（准备两杯水，一杯调零，另一杯洗样管）将元素灯预热30min打开空压机，将压力调到0.3Mpa打开乙炔钢瓶阀，将出气阀压力调到0.05～0.06Mpa之间调整燃烧器高度，对好光路旋开仪器上的乙炔伐，按点火开关，点火，调节火焰大小.依次检测标准空白（纯水）、标液1～4标液，未知样品。检测完毕后，保存数据吸去离子水10min，关乙炔，使管道中气体烧完再关仪器、电脑、空压机。六、数据及处理1.记录实验条件（1）仪器型号（2）吸收线波长（nm）（3）空心阴极灯电流（mA）（4）狭缝宽度（mm）（5）燃烧器高度（mm） （6）乙炔流量（L/min）（7）空气流量（L/min）列表记录测量标准溶液系列的吸光度（nm），然后以吸光度为纵坐标，标准溶液系列浓度为横坐标绘制标准曲，相关系数应在0.995以上。测量样品溶液的吸光度，然后在上述标准曲线上查得样液中cu的浓度（ug/mL）。若经稀释需乘上倍数求得原始样品中金属元素含量。七、注意事项1.实验时，要打开通风设备，使金属蒸汽及时排除室外2.更换空心阴极灯时，要将灯电流开关关掉，以防触电和造成电源短路3.点火前，必须检查排液管水封是否有水，以防止回火。4.钢瓶附近严禁烟火。八、思考题原子吸收分光光度分析为何要用待测元素的空心阴极灯作为光源？能否用氢灯或钨灯代替，为什么？'