土壤中脱氢酶活性的测定-ttc分光光度法

'土壤中脱氢酶活性的测定殷晓晨，武亨杰，朱承彬（中国石油大学化学化工学院，山东青岛266555）摘要：为了研究土壤中微生物降解有机物的能力，设计实验，采用TTC分光光度法测定受石油污染并接受生物修复的各土壤样品中脱氢酶的活性。研究表明，所采集的土壤样品中脱氢酶的含量很少，基本无法用本方法检测出，说明土壤在过去的一年里发生了某些变化使脱氢酶含量降低。关键词：土壤；脱氢酶；TTC；紫外分光光度法中图分类号：X705文献标志码：AMeasurementofCatalaseActivityinSoilYinXiao-chen,WuHeng-jie,ZhuCheng-bin（CollegeofChemistryandChemicalEngineering,ChinaUniversityofPetroleum，Qingdao266555，China）Abstract:Thisexperimentisdesignedtoinvestigatetheabilityofmicroorganismsinsoiltodegradeorganicmatters.Thedehydrogenaseactivityinsoilwhichwascontaminatedbypetroleumandthenbiologicallyrepairedwasmeasuredbythemethodofultravioletspectrometry.Theresearchshowsthatthecontentofdehydrogenaseinsoilssamplesaresominutethatcannotbedetectedbythismethod.Keywords:soil;dehydrogenase;TTC;ultravioletspectrometry. 土壤中的微生物对于有机物的降解，实质上是微生物经过一系列的酶的催化作用下的生物氧化还原反应。参加生物氧化的重要酶为氧化酶和脱氢酶二大类，其中脱氢酶类尤为重要。其中脱氢酶能使氧化有机物的氢原子活化并传递给特定的受氢体实现有机物的氧化和转化。如果脱氢酶活化的氢原子被人为受氢体接受，就可以通过直接测定人为受氢体浓度的变化间接测定脱氢酶的活性，表征生物降解过程中微生物的活性。因此，脱氢酶的活性可以反映土壤体系内活性微生物量以及其对有机物的降解活性，以评价降解性能。脱氢酶活性测定方法有MB.2H定性分析法和TTC比色法，目前用得较多的为氯化三苯基四氮唑（TTC）比色法。利用TTC作为人为受氢体，无色的TTC受氢后变成红色的TPF（三苯基甲月替），根据红色的深浅，测出相应的吸光度值，从而计算TPF的生成量，求出脱氢酶的活性。本实验使用TTC分光光度法测定土壤中脱氢酶的活性。1.实验1.1实验器材本实验所用器材为721分光光度计，比色皿，三角瓶，容量瓶，漏斗，滤纸等。1.2试剂1mg/mLTTC溶液（绘制标准曲线）：称取0.5gTTC，溶解，定容至500mL；1%TTC溶液（土壤测定）：取1gTTC，溶解，并定容至100mL容量瓶中；Tris-HCl缓冲溶液（pH=7.6）：称取6.037g Tris（三强甲基氨基甲烷，分析纯），再加入1mol/L的盐酸，调pH值为7.6；1.3土壤样品本实验土壤样品取自于受石油污染并接受生物修复的位于东营市的土壤，共有14个土壤样品。1.4实验方法1.4.1TPF标准曲线的绘制配制系列浓度的TTC标准溶液：取8个50mL容量瓶，分别吸取0.5mL、1mL、1.5mL、2mL、2.5mL、3mL、3.5mL1mg/mLTTC溶液加入以上容量瓶中，用蒸馏水定容。绘制标准曲线：取8支具塞试管，分别依次加入2mLTris-HCl缓冲溶液（pH=7.6）、2mL蒸馏水和2mL不同浓度的TTC标准溶液（空白对照用蒸馏水代替TTC溶液）。然后分别加入0.1g低亚硫酸钠（保险粉），振荡摇匀。待充分显色后，加入5mL甲苯，振荡萃取微红色的TPF，上清液于485nm处测定吸光度值。以TPF的浓度为横坐标，以吸光度A值为纵坐标绘制标准曲线。1.4.2土样测定分别取5g过1.25mm筛的新鲜土壤样品于具塞三角瓶中，每个三角瓶加入2mL1%的TTC溶液，2mL蒸馏水，充分混匀。置于37℃恒温箱中避光培养6h。培养结束后，加入5mL甲醇，剧烈震荡1min，后静置5min，再振荡20s，然后静置5min。将三角瓶中的物质全部过滤到比色管中，并用少量的甲醇洗涤三角瓶2-3次，洗涤液也全部过滤到比色管中，定容到25mL，于485nm下测定吸光度值A，以每g干土生成的TPF为脱氢酶的一个活性单位。1.结果分析 表1标准曲线绘制数据表C(TTC)/(ug/ml)空白10203040506070C(TPF)/(ug/ml)03.597.1810.7714.3617.9521.5425.13吸光度A0.0000.1270.2330.3310.4340.5380.6480.754例：1号TTC溶液C(TPF)/(ug/ml)=10ug/ml*2ml*300.46/(334.8*5ml)绘制的标准曲线如图所示：图1脱氢酶吸光度标准曲线表2土壤中脱氢酶活性数据表土样土样质量/g吸光度　土样土样质量/g吸光度北中一5.00340.006右二5.00110.006北中一（平行）5.00200.008右三5.00130.008南右一5.00170.005北左一5.00220.007南右一（平行）5.00190.006北左二5.00090.008左一5.00230.008北中二5.00160.006左一（平行）5.00240.007南左一5.00140.007左二5.00160.006北右一5.00140.008左三5.00110.005北右三5.00180.006右一5.00210.008空白0.00000.000注：由于吸光度值太小，无法计算酶活性 3.实验讨论实验过程中，考虑到处理过程中微生物对环境的适应特点，将样品培养温度控制在37℃为宜。另外，由于TTC具有较高的光敏感性，整个实验过程尽量严格在避光的条件下进行。第一次实验用风干土样严格按以上步骤进行，过滤后滤液基本为无色透明，吸光度值均在0.001-0.009之间，分析原因，可能由于甲醇存取效果不好，遂于第二次实验时换成甲苯，离心后发现上部液体呈黑色，无法测定吸光度。第三次实验将样品于37℃下培养18h，用甲醇作萃取剂，仍无显色，分析原因可能由于风干土样中酶活性较低，因此第四次实验采用新鲜土样，严格按照以上步骤进行，并从校园任取两处土样作为对照。实验结果为：从东营所采土样吸光度值依然极小，而校园土过滤后明显呈微红色，测定吸光度值分别为0.013和0.137。认真检查后药品仪器无问题，操作无不当，原因只能在于土壤样品中脱氢酶含量极少，用普通的分光光度法无法准确检测出。参考文献：[1]关松萌等.土壤酶及其研究法.北京：农业出版社，1986:121-3.[2]李玉瑛，李冰.柴油污染土壤生物修复对土壤酶活性的影响.生态环境学报,2009,18(5):1753-1756.[3]朱南文，闽航，陈美慈，赵宇华.TTC一脱氢酶测定方法的探讨.中国沼气，1996:14（2）.[4]牛志卿，刘建荣，吴国庆.'