GBT18634-2002饲用植酸酶活性的测定分光光度法

'免费标准网(www.freebz.net)标准最全面GB/T18634-2002前言本标准参考美国公职分析化学家协会(AOAC)方法和国外有关文献资料制定。本标准确定了饲用植酸酶的活性单位定义，采用钒铝显色分光光度法测定植酸酶活性。此项标准分为绝对法和相对法，对标准物质和试剂的选择均有详细说明。规定了方法的适用范围.检测原理，检测程序及最佳样品浓度。本标准的附录A是提示的附录。本标准由全国饲料工业标准化技术委员会提出并归口。本标准起草单位:国家饲料质量监督检验中心(北京)、罗氏泰山(_L海)维生素制品有限公司、巴斯夫维生素有限公司。本标准主要起草人:马东霞、苏晓鸥、张苏、王云全、张若寒。免费标准网(www.freebz.net)无需注册即可下载 免费标准网(www.freebz.net)标准最全面中华人民共和国国家标准饲用植酸酶活性的测定分光光度法GB/T18634一2002DeterminationoffeedphytaseactivitySpectrothotometricmethod飞范围本标准规定了以分光光度法测定饲用植酸酶活性的方法。本标准适用于作饲料添加剂用的植酸酶产品，也适用于添加有植酸酶的配合饲料、浓缩饲料和添加剂预混合饲料。样品最低检出量为90U/kg,2引用标准下列标准所包含的条文，通过在本标准中引用而构成为本标准的条文。本标准出版时，所示版本均为有效。所有标准都会被修订，使用本标准的各方应探讨使用下列标准最新版本的可能性。GB/T6682--1992分析实验室用水规格和试验方法(neqISO3696:1987)3植酸酶活性单位定义样品在植酸钠浓度为5.0mmol/L,温度37C,pH值5.50的条件下，每分钟从植酸钠中释放1timol无机磷，即为一个植酸酶活性单位，以U表示。4方法原理植酸酶在一定温度和pH条件下，水解底物植酸钠，生成正磷酸和肌醇衍生物，在酸性溶液中，用钒钥酸钱处理会生成黄色的[(NH,),PO,NH,VO,"16MoO,〕复合物，在波长415nm下进行比色测定。5试荆和溶液本标准中所用试剂，在没有注明其他要求时，均指分析纯试剂和符合GB/T6682中规定的三级水。清洗试验用容器不要用含磷清洗剂。5.1乙酸缓冲液(I),c(CH,000Na·3H,O)为0.25mol/I:称取34.02g三水乙酸钠，0.1g吐温20于1000m工容量瓶中，加人900mL水溶解，用盐酸调节pH至5.50士0.01，并用蒸馏水定容至1000ML,室温下存放2个月有效。5.2乙酸缓冲液(I),c(CH3000Na"3H,0)为0.25mol/I:称取34.02g三水乙酸钠，5g吐温20,30g乙二胺四乙酸二钠(EDTA)于1000MI容量瓶中，加人900m工_水溶解，用盐酸调节pH至5.50士0.01，并用蒸馏水定容至1000mL,室温下存放2个月有效。5.3植酸钠溶液，c(C6H〔),P,Na)为7.5mmol/1_:称取0.6929g肌醇六磷酸钠(C,H,O,,P,Na:)于100m工容量瓶中，用乙酸缓冲液((5.1)溶解并定容至刻度，现用现配(实际反应液中的最终浓度为5.0mmol/I)。中华人民共和国国家质f监督检验检疫总局2002-02-19批准2002-07-01实施标准分享网www.bzfxw.com免费下载免费标准网(www.freebz.net)无需注册即可下载 免费标准网(www.freebz.net)标准最全面Gs/T18634一20025.4硝酸溶液:1+2水溶液。5.5100g/1铝酸按溶液:称取log钥酸t}L(NH,)6Mo,024.4H20习于100m工容量瓶中，加人l.0ml,氨水(250o)用水溶解定容至刻度5}62.35g/1钒酸钱溶液:称取0.235g钒酸钱(NH4VO3)于100m工，棕色容量瓶中，加人Zm工J硝酸溶液(5.4)，用水溶解定容至刻度。避光条件下保存一周有效。5.7颜色终止液:移取2份硝酸溶液(5.4),1份钥酸钱溶液(5.5),1份钒酸钱溶液(5-6)混合后使用，现用现配。5.8植酸酶标准品(标明准确活性单位和类型)。5.9磷酸二氢钾(KH,PO):基准物。6仪器和设备6.1实验室常用仪器设备。6.2恒温水浴(37士。.1)c.6.3分光光度计:有10mm比色皿，可在415nm下测定吸光度。6.4磁力搅拌器。6.5涡流式混合器。6.6酸度计:精确至小数点后2位。6.7离心机:转速为4000r/min以上。了试样制备取有代表性样品，用四分法将试样缩分至2。。9，植酸酶产品不需粉碎，配合饲料和添加剂预混合饲料需粉碎通过0.45mm标准筛，装人密封容器，防止试样成分变化。8测定步骤8-1绝对法(仲裁法)8.1.1标准曲线准确称取。.6804g在105c烘至恒重的基准磷酸二氢钾(5.9)于100mL容量瓶中，用乙酸缓冲液(5.1)溶解，并定容至100mL，浓度为50.0mmol/L。按表1的比例稀释成不同浓度，与试样一起反应测定，以无机磷浓度为横坐标，吸光值为纵坐标，列出直线回归方程(y=az+b)表l标准序号稀释量/.L浓度八mmol/L)10.5~12520.5-212530.5-46.2540.5-83.12550.5-161.56258门.2试样溶液的制备按照附录八中建议的称样量称取试样两份，精确至0.0001g.置于100mL容量瓶中，加人约70ml乙酸缓冲液(5.1)"，一个磁力棒，在磁力搅拌器(6.4)上高速搅拌30min，用乙酸缓冲液(5.1)定容至刻度(减去磁力棒的体积)。摇匀，在离心机(6.7)上以4000r/min离心10min。分取不同体积的上清液用乙酸缓冲液(5.1)稀释，使样液浓度保持在。.4U/mI左右，待反应飞)添加剂预溉合饲料样品需采用乙酸缓冲液(5.2)免费标准网(www.freebz.net)无需注册即可下载 免费标准网(www.freebz.net)标准最全面GB/T1863d一2002建议在测定样品时附加一个己知活性的植酸酶参考样，便于检验整个操作过程是否有偏差。8门.3反应取10ml_试管按下面的反应顺序进行操作，在反应过程中，从加入底物(5.3)开始，向每支试管中加人试剂的时间间隔要绝对一致，37〔’水解30min。反应步骤及试剂、溶液用量见表2表2反应顺序样品、标准样品空白(标准空白)1.加乙酸缓冲液(弓.1或5.2)1.sml_1.sml(20ml)2.加人待反应液0.2ml_{MmL_3.混合甲丫4.37(预热smin丫5依次加人底物(5.3)4ml4rnL(第二步)6.字昆合丫丫7.37〔水解3()mln丫....—一一一8.依次加人终止液(5.7)4ml4rnl(第一步)9.混合寸丫.急体积飞OmlIOrnl_8.1.4样品测定反应后的试样在室温下静置10min，如出现混浊需在离心机(6.7)上以4o00r/min离心10mm，上清液以标准曲线的空白调零，在分光光度计(6.3)415nm波长处测定样品空白(A。)和样品溶液(A)的吸光值，八一A。为实测吸光值。用直线回归方程计算植酸酶的活性8.2相对法8.2门标准曲线准确称取一定量的标准植酸酶(5.8)，精确至。.00019，于50ml容量瓶中，用0·25mol/L乙酸缓冲液(易.1)溶解并定容至刻度。做两次稀释使植酸酶活性大约在。.05U/m工左右，当日配制。将上述植酸酶标准液再按表3比例用缓冲液(5.1)进行稀释，需要准确计算植酸酶的浓度。然后与样品一起进行反应测定。以植酸酶浓度为横坐标，吸光值为纵坐标，列出直线回归方程(y=a二斗b)。表3叮一一一一飞蒲藻厂一一一丁一一不巍藕翻寇丽云}大约酶活性八u/mL)0~5010~5.00.01001502C1.5于5.02.0一5.002525~503.0，5.0:.:::3.5下5.08，2.2样品溶液的制备以下操作步骤按8.1.2进行，使样液浓度保持在0.02U/ml左右。待反应注:添加剂预混合饲料样品需采用乙酸缓冲液(5.2)8.2.3)乏应取1o1们试管按下面的反应顺序进行操作，在反应过程中，从加人底物(5.3)开始，向每支试竹中标准分享网www.bzfxw.com免费下载免费标准网(www.freebz.net)无需注册即可下载 免费标准网(www.freebz.net)标准最全面Gs/T18634一2002加人试剂的时间间隔要绝对一致，37C水解30min反应步骤及试剂、溶液用量见表40表4反应顺序样液样液空白标准’1.加人待反应液Z.L2ml.Zml.2.37预热;nun训丫罕3.依次加人底物(5.3)4ml4ml(第2步)4ml4.混合J丫丫5.37(水解30mun州丫甲6.依次加人终止液(5.7)4ml4-1-(第1步)1ML7.混合丫丫甲总体积10-L10mL10m1,”标准空白加2ml，乙酸缓冲液(5.1)8.2-4样品测定反应后的试样在室温下静置10min，如出现混浊需在离心机(5.7)上以4000r/min离心10min,卜清液以标准曲线的空白调零，在分光光度计(6.3)415nm波长处测定样品空白(A。)和样品溶液(A)的吸光值，A-A。为实测吸光值。用直线回归方程计算植酸酶的活性。9结果计算和表示9门植酸酶活性U按式(i>和式(2)计算9门门绝对法c了=(.........‘·..·..·.·····。··一(1)刀于x丽XF式中-，U一试样中植酸酶的活性，U/g;〔、一一根据实际样液的吸光值由直线回归方程计算出的酶活性，U;F一一试样溶液反应前的总稀释倍数;m一一试样质量,g;30--一反应时间，min.今卞产矛亡相对法U_旦XF一’.“.··⋯⋯‘···⋯⋯(2)式中;U—试样中植酸酶的活性，U/g;〔-一一根据实际样液的吸光值由直线回归方程计算出的酶活性，U;F一一试样溶液反应前的总稀释倍数;胡一一试样质量，9。今2结果表示两个平行样品的测定结果用算术平均值表示，保留整数。9.3重复性同一样品两个平行测定值的相对偏差，植酸酶产品不大于80o。添加植酸酶的各种饲料样品不大于10%免费标准网(www.freebz.net)无需注册即可下载 免费标准网(www.freebz.net)标准最全面GB/T18634一2002附录A(提示的附录)建议称样t根据样品植酸酶活性的不同，建议称样量见表A1表A1植酸酶活性//(U/g)称样魔/g50000.1-1z5000.2-15001-23001-21-0.55-10标准分享网www.bzfxw.com免费下载免费标准网(www.freebz.net)无需注册即可下载'