分光光度法测食品中的亚硝酸盐.doc

'第二法分光光度法8原理亚硝酸盐采用盐酸萘乙二胺法测定，硝酸盐采用镉柱还原法测定。试样经沉淀蛋白质、除去脂肪后，在弱酸条件下亚硝酸盐与对氨基苯磺酸重氮化后，再与盐酸萘乙二胺偶合形成紫红色染料，外标法测得亚硝酸盐含量。采用镉柱将硝酸盐还原成亚硝酸盐，测得亚硝酸盐总量，由此总量减去亚硝酸盐含量，即得试样中硝酸盐含量。9试剂和材料除非另有规定，本方法所用试剂均为分析纯。水为GB/T6682规定的二级水或去离子水。9.1亚铁氰化钾（K4Fe(CN)6·3H2O）。9.2乙酸锌（Zn(CH3COO)2·2H2O）。9.3冰醋酸（CH3COOH）。9.4硼酸钠（Na2B4O7·10H2O）。9.5盐酸（ρ＝1.19g/mL）。9.6氨水（25%）。9.7对氨基苯磺酸(C6H7NO3S）。9.8盐酸萘乙二胺(C12H14N2·2HCl）。9.9亚硝酸钠（NaNO2）。9.10硝酸钠（NaNO3）。9.11锌皮或锌棒。9.12硫酸镉。9.13亚铁氰化钾溶液(106g/L)：称取106.0g亚铁氰化钾（9.1），用水溶解，并稀释至1000mL。9.14乙酸锌溶液(220g/L)：称取220.0g乙酸锌（9.2），先加30mL冰醋酸（9.3）溶解，用水稀释至1000mL。9.15饱和硼砂溶液(50g/L)：称取5.0g硼酸钠（9.4），溶于100mL热水中，冷却后备用。9.16氨缓冲溶液（pH9.6～9.7）：量取30mL盐酸（9.5），加100mL水，混匀后加65mL氨水（9.6），再加水稀释至1000mL，混匀。调节pH至9.6～9.7。9.17氨缓冲液的稀释液：量取50mL氨缓冲溶液（9.16），加水稀释至500mL，混匀。9.18盐酸(0.1mol/L)：量取5mL盐酸，用水稀释至600mL。9.19对氨基苯磺酸溶液（4g/L）：称取0.4ｇ对氨基苯磺酸（9.7），溶于100mL20%（V/V）盐酸中，置棕色瓶中混匀，避光保存。9.20盐酸萘乙二胺溶液（2g/L）：称取0.2g盐酸萘乙二胺（9.8），溶于100mL水中,混匀后，置棕色瓶中，避光保存。9.21亚硝酸钠标准溶液（200μg/mL）：准确称取0.1000ｇ于110℃～120℃干燥恒重的亚硝酸钠，加水溶解移入500mL容量瓶中，加水稀释至刻度，混匀。9.22亚硝酸钠标准使用液（5.0μg/mL）：临用前，吸取亚硝酸钠标准溶液5.00mL，置于200mL容量瓶中，加水稀释至刻度。9.23硝酸钠标准溶液（200μg/mL，以亚硝酸钠计）：准确称取0.1232g于110℃～120℃干燥恒重的硝酸钠，加水溶解，移于入500mL容量瓶中，并稀释至刻度。9.24硝酸钠标准使用液（5μg/mL）：临用时吸取硝酸钠标准溶液2.50mL，置于100mL容量瓶中，加水稀释至刻度。10仪器和设备10.1天平：感量为0.1mg和1mg。10.2组织捣碎机。 10.3超声波清洗器。10.4恒温干燥箱。10.5分光光度计。10.6镉柱10.6.1海绵状镉的制备：投入足够的锌皮或锌棒于500mL硫酸镉溶液(200g/L)中，经过3h～4h，当其中的镉全部被锌置换后，用玻璃棒轻轻刮下，取出残余锌棒，使镉沉底，倾去上层清液，以水用倾泻法多次洗涤，然后移入组织捣碎机中，加500mL水，捣碎约2s，用水将金属细粒洗至标准筛上，取20目～40目之间的部分。10.6.2镉柱的装填：如图2。用水装满镉柱玻璃管，并装入2cm高的玻璃棉做垫，将玻璃棉压向柱底时，应将其中所包含的空气全部排出，在轻轻敲击下加入海绵状镉至8cm～10cm高，上面用1cm高的玻璃棉覆盖，上置一贮液漏斗，末端要穿过橡皮塞与镉柱玻璃管紧密连接。如无上述镉柱玻璃管时，可以25mL酸式滴定管代用，但过柱时要注意始终保持液面在镉层之上。当镉柱填装好后，先用25mL盐酸(0.1mol/L)洗涤，再以水洗两次，每次25mL，镉柱不用时用水封盖，随时都要保持水平面在镉层之上，不得使镉层夹有气泡。10.6.3镉柱每次使用完毕后，应先以25mL盐酸（0.1mol/L）洗涤，再以水洗两次，每次25mL，最后用水覆盖镉柱。10.6.4镉柱还原效率的测定：吸取20mL硝酸钠标准使用液，加入5mL氨缓冲液的稀释液，混匀后注入贮液漏斗，使流经镉柱还原，以原烧杯收集流出液，当贮液漏斗中的样液流完后，再加5mL水置换柱内留存的样液。取10.0mL还原后的溶液（相当10μg亚硝酸钠）于50mL比色管中，以下按11.4自“吸取0.00mL、0.20mL、0.40mL、0.60mL、0.80mL、1.00mL……”起依法操作，根据标准曲线计算测得结果，与加入量一致，还原效率应大于98%为符合要求。10.6.5还原效率计算还原效率按式（2）进行计算。%…………………………………………………………（2）式中：X——还原效率，%；A——测得亚硝酸钠的含量，单位为微克（μg）；10——测定用溶液相当亚硝酸钠的含量，单位为微克（μg）。11分析步骤11.1试样的预处理同5.1。11.2提取称取5ｇ（精确至0.01g）制成匀浆的试样（如制备过程中加水，应按加水量折算），置于50mL烧杯中，加12.5mL饱和硼砂溶液（9.15），搅拌均匀，以70℃左右的水约300mL将试样洗入500mL容量瓶中，于沸水浴中加热15min，取出置冷水浴中冷却，并放置至室温。11.3提取液净化在振荡上述提取液时加入5mL亚铁氰化钾溶液（9.13）,摇匀,再加入5mL乙酸锌溶液（9.14）,以沉淀蛋白质。加水至刻度,摇匀,放置30min,除去上层脂肪,上清液用滤纸过滤,弃去初滤液30mL,滤液备用。 11.4亚硝酸盐的测定吸取40.0mL上述滤液于50mL带塞比色管中，另吸取0.00mL、0.20mL、0.40mL、0.60mL、0.80mL、1.00mL、1.50mL、2.00mL、2.50mL亚硝酸钠标准使用液（相当于0.0μｇ、1.0μｇ、2.0μｇ、3.0μｇ、4.0μｇ、5.0μｇ、7.5μｇ、10.0μｇ、12.5μｇ亚硝酸钠），分别置于50mL带塞比色管中。于标准管与试样管中分别加入2mL对氨基苯磺酸溶液（9.19），混匀，静置3min～5min后各加入1mL盐酸萘乙二胺溶液(9.20)，加水至刻度，混匀，静置15min，用2cm比色杯，以零管调节零点，于波长538nm处测吸光度，绘制标准曲线比较。同时做试剂空白。11.5硝酸盐的测定11.5.1镉柱还原11.5.1.1先以25mL稀氨缓冲液（9.17）冲洗镉柱，流速控制在3mL/min～5mL/min（以滴定管代替的可控制在2mL/min～3mL/min）。11.5.1.2吸取20mL滤液于50mL烧杯中，加5mL氨缓冲溶液（9.16），混合后注入贮液漏斗，使流经镉柱还原，以原烧杯收集流出液，当贮液漏斗中的样液流尽后，再加5mL水置换柱内留存的样液。11.5.1.3将全部收集液如前再经镉柱还原一次，第二次流出液收集于100mL 容量瓶中，继以水流经镉柱洗涤三次，每次20mL，洗液一并收集于同一容量瓶中，加水至刻度，混匀。11.5.2亚硝酸钠总量的测定吸取10mL～20mL还原后的样液于50mL比色管中。以下按11.4自“吸取0.00mL、0.20mL、0.40mL、0.60mL、0.80mL、1.00mL……”起依法操作。12分析结果的表述12.1亚硝酸盐含量计算亚硝酸盐（以亚硝酸钠计）的含量按式（3）进行计算。……………………………………………………（3）式中：X1——试样中亚硝酸钠的含量，单位为毫克每千克（mg/kg）；A1——测定用样液中亚硝酸钠的质量，单位为微克（μg）；m——试样质量，单位为克（ｇ）；V1——测定用样液体积，单位为毫升（mL）；V0——试样处理液总体积，单位为毫升（mL）。以重复性条件下获得的两次独立测定结果的算术平均值表示，结果保留两位有效数字。12.2硝酸盐含量的计算硝酸盐（以硝酸钠计）的含量按式（4）进行计算。……………………………（4）式中：X2——试样中硝酸钠的含量，单位为毫克每千克（mg/kg）；A2——经镉粉还原后测得总亚硝酸钠的质量，单位为微克（μg）；m——试样的质量，单位为克（g）；1.232——亚硝酸钠换算成硝酸钠的系数；V2——测总亚硝酸钠的测定用样液体积，单位为毫升（mL）；V0——试样处理液总体积，单位为毫升（mL）；V3——经镉柱还原后样液总体积，单位为毫升（mL）；V4——经镉柱还原后样液的测定用体积，单位为毫升（mL）；X1——由式（3）计算出的试样中亚硝酸钠的含量，单位为毫克每千克（mg/kg）。以重复性条件下获得的两次独立测定结果的算术平均值表示，结果保留两位有效数字。13精密度在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10%。'