GB541316-2010食品安全国家标准婴幼儿食品和乳品中叶酸（叶酸盐活性）的测定.pdf

'中华人民共和国国家标准GB5413.16—2010食品安全国家标准婴幼儿食品和乳品中叶酸（叶酸盐活性）的测定NationalfoodsafetystandardDeterminationoffolicacid(folateactivity)infoodsforinfantsandyoungchildren,milkandmilkproducts2010-03-26发布2010-06-01实施中华人民共和国卫生部发布 GB5413.16—2010前言本标准代替GB/T5413.16-1997《婴幼儿配方食品和乳粉叶酸（叶酸盐活性）测定》。本标准与GB/T5413.16-1997相比，主要变化如下：——对磷酸盐缓冲液作了调整；——增加了米粉的处理方法；——增加了光密度法测定步骤。本标准所代替标准的历次版本发布情况为：——GB5413-1985、GB/T5413.16-1997。I GB5413.16—2010食品安全国家标准婴幼儿食品和乳品中叶酸（叶酸盐活性）的测定1范围本标准规定了婴幼儿食品和乳品中叶酸（叶酸盐活性）的测定方法。本标准适用于婴幼儿食品和乳品中叶酸（叶酸盐活性）的测定。2规范性引用文件本标准中引用的文件对于本标准的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本标准。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本标准。3原理利用干酪乳杆菌（Lactobacilluscasei）ATCC7469对叶酸的特异性，在含有叶酸的样品中生长产生的酸度和形成的光密度来测定叶酸的含量。4试剂和材料除非另有规定，本方法所用试剂均为分析纯，水为GB/T6682规定的二级水。4.1鸡胰腺：称取100mg干燥的鸡胰腺，加20mL蒸馏水，搅拌15min，离心10min（3000转/分钟），取上清液，临用前配制。4.20.9%生理盐水：称取9.0g氯化钠溶解于1000mL水中，分装于具塞试管中，每管10mL，121℃灭菌15min。每周准备一次。4.3磷酸盐缓冲液4.3.1磷酸盐缓冲液Ⅰ（0.05mol/L）：称取5.85g磷酸二氢钾，1.22g磷酸氢二钾，用1000mL水溶解。临用前按0.5g/100mL加入抗坏血酸。4.3.2磷酸盐缓冲液Ⅱ（用于谷物及谷物制品前处理）：称取14.2g磷酸氢二钠，用1000mL水溶解。临用前按1.0g/100mL加入抗坏血酸，用氢氧化钠溶液A（4.16）调pH至7.8±0.1。4.3.3磷酸盐缓冲液III（用于谷物及谷物制品测试）：称取14.2g磷酸氢二钠，用1000mL水溶解。临用前按1.0g/100mL加入抗坏血酸，用氢氧化钠溶液A（4.16）调pH至6.8±0.1。4.3.4磷酸盐缓冲液Ⅳ（0.1mol/L）（用于谷物及谷物制品标准溶液制备）：溶解13.61g磷酸二氢钾于水中稀释到1000mL。用氢氧化钾溶液（4.10）调pH至7.0±0.1。4.4叶酸标准品。4.5氨水（10.8%）。4.6甲苯（C7H8）。4.7抗坏血酸（C6H8O6）。4.8菌株：干酪乳杆菌（Lactobacilluscasei）ATCC7469。1 GB5413.16—20104.9培养基4.9.1乳酸杆菌琼脂培养基：胨化乳15g，酵母浸膏5g，葡萄糖10g，番茄汁100mL，磷酸二氢钾2g，聚山梨糖单油酸酯1g，琼脂10g，加蒸馏水至1000mL，调pH至6.8±0.2（20℃～25℃）。121℃高压灭菌15min，备用。4.9.2乳酸杆菌肉汤培养基：胨化乳15g，酵母浸膏5g，葡萄糖10g，番茄汁100mL，磷酸二氢钾2g，聚山梨糖单油酸酯1g，加蒸馏水至1000mL，调pH至6.8±0.2（20℃～25℃）。121℃高压灭菌15min，备用。4.9.3叶酸测定用培养基：酪蛋白胨10g，葡萄糖40g，乙酸钠40g，磷酸氢二钾1g，磷酸二氢钾1g，DL-色氨酸0.2g，L-天门冬氨酸0.6g，L-半胱氨酸盐酸盐0.5g，硫酸腺嘌呤10mg，盐酸鸟嘌呤10mg，尿嘧啶10mg，黄嘌呤20mg，聚山梨糖0.1g，谷光甘肽5mg，硫酸镁0.4g，氯化钠20mg，硫酸亚铁20mg，硫酸锰15mg，核黄素1mg，p-氨基苯甲酸2mg，维生素B64mg，盐酸硫胺素400μg，泛酸钙800μg，烟酸800μg，生物素20μg，加蒸馏水至1000mL，调pH至6.7±0.1（20℃～25℃）。注：市售商业化合成培养基效果更稳定。4.10氢氧化钾溶液（4mol/L）：称取224g氢氧化钾于1000mL烧杯中，用400mL水溶解，冷却至室温后，转移至1000mL容量瓶中，用水定容。4.11木瓜蛋白酶溶液：1g蛋白酶（活力≥6000U/mg，pH6.0±0.1，40℃）溶于100mL磷酸盐缓冲液Ⅰ（4.3.1）中。临用前配制。4.12α-淀粉酶溶液：1gα-淀粉酶（1.5U/mg）溶于100mL磷酸盐缓冲液Ⅰ（4.3.1）中。临用前配制。4.130.22μm灭菌滤膜。4.14标准溶液的制备4.14.1叶酸标准贮备液（500μg/mL）：称取55mg～56mg（精确至0.1mg）叶酸标准品（4.4），用50mL蒸馏水转入100mL容量瓶中，加2mL氨水（4.5）。溶液制备后，按式（1）计算溶液的体积，要求贮备液中叶酸盐的浓度为500μg/mL：m×1000×c贮备液体积（mL）=100×500m×c或简化为：贮备液体积（mL）=………………………………………………(1)50式中：m——叶酸标准品的质量，单位为毫克（mg）；c——叶酸标准品的纯度，单位为克每百克（g/100g）。用水稀释溶液至刻度，用吸管加水至计算要求的体积，充分混合，放入棕色试剂瓶中2℃～4℃冰箱冷藏，保存期为4个月。4.14.2叶酸标准中间液（50μg/mL）：吸取10mL叶酸标准贮备液（4.14.1）于100mL棕色容量瓶中，用水定容至刻度，充分混匀，2℃～4℃冰箱冷藏，保存期为1个月。4.14.3叶酸标准工作液（0.05ng/mL，0.1ng/mL）：吸取1mL叶酸标准中间液（4.14.2）于100mL棕色容量瓶中，用水定容至刻度，混合。再吸该液1mL于100mL棕色容量瓶中，定容，混合。从上液中分别吸取5mL于250mL和500mL棕色容量瓶中，用磷酸盐缓冲液Ⅰ（4.3.1）定容到刻度，混匀，即为高浓度标准工作液（0.1ng/mL）和低浓度标准工作液（0.05ng/mL）。临用前配制。4.15盐酸（1mol/L）：量取83.0mL盐酸溶于水中，冷却后定容至1000mL。2 GB5413.16—20104.16氢氧化钠溶液A（4mol/L）：称取160g氢氧化钠于1000mL烧杯中，用400mL水溶解，冷却至室温后，转移至1000mL容量瓶中，用水定容。4.17氢氧化钠溶液B（0.1mol/L）：吸取2.5mL氢氧化钠溶液A（4.16）转移至100mL容量瓶中用水定容。4.18氢氧化钠标准滴定溶液（0.1mol/L±0.0002mol/L）：称取4g（精确至0.0001g）氢氧化钠用水稀释至1000mL，用邻苯二甲酸氢钾标定。保存此溶液的容器要密封，以防二氧化碳渗入。4.18.1氢氧化钠标准溶液的标定：称取约0.18g（精确至0.0001g）于105℃～110℃烘至恒重的邻苯二甲酸氢钾，用50mL除二氧化碳的水溶于锥形瓶中，加两滴5g/L的酚酞指示剂，用配好的氢氧化钠溶液滴定至粉红色，同时作空白实验。按式（2）计算氢氧化钠标准溶液的浓度：mc=……………………………………………………(2)(V−V)×.0204212式中：c——氢氧化钠的浓度，单位为摩尔每升（mol/L）；m——称取的邻苯二甲酸氢钾的质量，单位为克（g）；V1——氢氧化钠溶液的用量，单位为毫升（mL）；V2——空白试验氢氧化钠溶液的用量，单位为毫升（mL）。4.18.2酚酞溶液：取0.5g酚酞溶于75mL体积分数为95%的乙醇中，加入20mL水，再加入氢氧化钠溶液（4.18），直至加入一滴立即变成粉红色，再用水定容至100mL。4.19溴麝香草酚蓝指示剂：称取0.1g溴麝香草酚蓝于研钵中，加入1.6mL氢氧化钠溶液B（4.17）研磨，加少许水至完全溶解，转移至250mL容量瓶中用水定容。5仪器和设备5.1pH计：精度为0.01。5.2离心机：转速≥2000转/分钟。5.3分光光度仪。5.4天平：感量为0.1mg。5.5生化培养箱：36℃±1℃5.6滴定管：分刻度值为0.1mL。5.7涡旋振荡器。6分析步骤6.1测试菌液的制备6.1.1干酪乳杆菌（Lactobacilluscasei）ATCC7469冻干菌粉转入乳酸杆菌肉汤培养基（4.9.2）中，36℃±1℃培养24h后，转接至乳酸杆菌琼脂培养基（4.9.1）试管中，再36℃±1℃培养24h。培养好的乳酸杆菌琼脂培养基（4.9.1）试管的培养物作为贮备菌种。3 GB5413.16—20106.1.2从贮备菌种培养基上分别转接到三个乳酸杆菌琼脂培养基（4.9.1）试管中，放入培养箱中36℃±1℃培养24h。每月转接一次，作为月接种管贮于冰箱中。每月定期从月接种管中重新接种3个转接管保存新菌株。6.1.3从月接种的培养管中的一支再接种一支乳酸杆菌琼脂培养基（4.9.1）试管，36℃±1℃培养24h，作为日接种管每日测定用。6.1.4从日接种管中接种一管乳酸杆菌肉汤培养基（4.9.2），36℃±1℃培养24h。在无菌条件下离心该培养液10min（2000转/分钟），弃去上清液。用10mL生理盐水（4.2）振荡洗涤菌体，离心10min（2000转/分钟），弃去上清液，用10mL生理盐水（4.2）振荡清洗。如前离心操作，弃去上清液。再加10mL生理盐水（4.2），混匀。吸1mL该菌悬液于10mL生理盐水（4.2）中，混匀制成测试菌液。6.1.5以生理盐水（4.2）做对照，用分光光度计，于550nm波长下，测测试菌液（6.1.4）的光密度值，此值应在60%～80%之间。6.2试样的制备6.2.1乳制品称取2g（精确至0.0001g）试样（约含叶酸5μg）于100mL烧杯中，用25mL～30mL水复原样品，转入100mL容量瓶中，用水定容至刻度，溶液中叶酸的质量浓度大约为0.05μg/mL。吸取1mL该样液和1mL鸡胰腺（4.1）于一个180mm×15mm的带螺旋盖的试管中，充分混合。加18mL含抗坏血酸的磷酸缓冲液Ⅰ（4.3.1），再加1mL甲苯（4.6）。同时制备±空白对照管，吸1mL蒸馏水和1mL鸡胰腺（4.1）于空白管中，加18mL含抗坏血酸的磷酸缓冲液Ⅰ（4.3.1）及1mL甲苯（4.6）。在37℃下，样品管和空白管保温16h后，于100℃水浴加热5min。用磷酸盐缓冲液Ⅰ（4.3.1）作适当稀释，得到浓度约为0.1ng/mL的叶酸盐溶液。若确定样品中强化叶酸与原生叶酸相比所占比例很大，则可以用1mL样液加19mL含抗坏血酸的磷酸缓冲液Ⅰ（4.3.1）于100℃水浴加热5min，再用磷酸盐缓冲液Ⅰ（4.3.1）稀释，得到浓度约为0.1ng/mL的叶酸盐溶液。6.2.2谷物及谷物制品称取大约含1μg叶酸的试样于150mL三角烧瓶中。加20mLpH7.8磷酸缓冲溶液Ⅱ（4.3.2），混匀后加50mL水和1.0mL甲苯（4.6）。加盖后121℃15min灭菌，然后迅速冷却。加1mL木瓜蛋白酶溶液（4.11），于36℃±1℃保温3h后100℃加热3min，冷却。加1mLα-淀粉酶溶液（4.12），36℃±1℃保温2h后加4mL鸡胰腺（4.1），加盖，36℃±1℃保温16h后100℃加热3min，冷却。用1mol/L盐酸（4.15）调pH至4.5，用水稀释定容到100mL。过滤得到澄清滤液，然后吸取1mL澄清滤液用磷酸盐缓冲液III（4.3.3）定容至100mL，得到浓度约为0.1ng/mL的叶酸盐溶液。若确定样品中强化叶酸与原生叶酸相比所占比例很大则可以直接在样品中加20mL0.05mol/L含抗坏血酸的磷酸缓冲液Ⅱ（4.3.2）和50mL水，于121℃灭菌15min，然后吸取1mL澄清滤液，再用0.05mol/L磷酸盐缓冲液III（4.3.3）稀释，得到浓度约为0.1ng/mL的叶酸盐溶液。6.3标准曲线管的制作按表1顺序加入蒸馏水、标准工作液（4.14.3）（测定谷物及谷物制品的标准溶液用磷酸盐缓冲液Ⅳ（4.3.4）代替磷酸盐缓冲液Ⅰ（4.3.1））和叶酸测定用培养基（4.9.3）于培养管中。表1中每一编号需制作3管。试管S2至S10中，相当叶酸含量为0.00ng、0.05ng、0.10ng、0.15ng、0.20ng、0.25ng、0.30ng、0.40ng、0.50ng。4 GB5413.16—2010表1标准曲线管的制作试管号S1S2S3S4S5S6S7S8S9S10蒸馏水（mL）5543210210标准溶液（mL）0012345345培养基（mL）5555555555注1：试管S3～S7中加低浓度标准工作液。注2：试管S8～S10中加高浓度标准工作液。6.4试样管的制作按表2顺序加入蒸馏水、试样和叶酸测定用培养基于试管中，表中每一编号需制作3管。表2试样管的制作试管号1234蒸馏水（mL）4321样品（mL）1234培养基（mL）55556.5灭菌将标准曲线管和试样管121℃灭菌5min，迅速冷却到室温（商品化培养基按标签说明进行灭菌)。注：保证加热和冷却过程中条件均匀，灭菌管数过多或距离太近，在灭菌锅中都可产生不良影响。6.6接种无菌条件下每管中均加入一滴（约50μL）菌悬液（6.1.4），加盖，充分振荡混匀所有试管（标准曲线未接种空白管S1除外）。6.7培养6.7.1酸度法：36℃±1℃培养72h。对每支试管进行目测检查，未接种管内培养液应是澄清的，标准曲线管和试样管中培养液的浊度应有梯度。未接种管中若出现混浊，则测定无效。6.7.2光密度法：在36℃±1℃，培养16h～24h。其他同6.7.1。6.8测定6.8.1酸度法6.8.1.1用10mL水将未接种空白管S1和接种空白管S2的培养物转至三角烧瓶中，以溴麝香草酚蓝（4.19）作指示剂，或用pH计以pH6.8±0.2为滴定终点用氢氧化钠标准滴定溶液（4.18）滴定标准曲线未接种空白管S1和接种空白管S2。记录下消耗的氢氧化钠标准滴定溶液体积。注：如果接种空白滴定反应消耗的氢氧化钠标准滴定溶液体积数等于或高于未接种空白水平的1.5mL，则测定结果无效。6.8.1.2用10mL水将标准曲线管和试样管中的培养物转至三角烧瓶中，以溴麝香草酚蓝（4.19）作指示剂，或用pH计以pH6.8±0.2为滴定终点用氢氧化钠标准滴定溶液（4.18.1）滴定标准曲线管和试样管的培养物。记录下消耗的氢氧化钠标准滴定溶液体积。注：通常标准曲线管S7消耗的0.1mol/L的氢氧化钠标准滴定溶液体积数在8mL～12mL之间。6.8.2光密度法5 GB5413.16—2010以接种空白管（表1中试管号S2）作对照，取出最高浓度标准曲线管S7，振荡5s，在波长550nm下读取光密度值，放回重新培养。2h后同等条件重新测该管的光密度，如果两次光密度的绝对差结果≤2%，则取出全部检验管测定标准溶液和试样的光密度。6.9标准曲线的绘制以标准曲线管叶酸含量作横坐标，以消耗氢氧化钠标准滴定溶液的毫升数或光密度值为纵坐标绘制标准曲线。6.10试样管中叶酸含量的计算按照13.8每个试样管测定的消耗氢氧化钠标准滴定溶液的毫升数或光密度值，从标准曲线中查得对应的叶酸含量。每一编号的三个试样管应计算管中每毫升测定液叶酸的含量，并与其平均值相比较。相对偏差小于15%的试管为有效试管，无效试样管应舍去，有效试样管总数应大于所有试样管总数的2/3。重新计算每一编号的有效试样管中每毫升测定液叶酸含量的平均值，以此平均值计算全部编号试样管的总平均值Cx。注：样品管中叶酸含量低于0.05ng，高于0.5ng的值应舍去。7分析结果的表述试样中叶酸含量按式（3）计算：100X＝[(C×D)−EB]×…………………………………………（3）x1000m式中：X——试样中叶酸含量，单位为微克每百克（μg/100g）；Cx——6.10中计算所得的总平均值，单位为纳克（ng）；D——样品在处理后的稀释因子；EB——鸡胰腺空白管中叶酸含量，单位为纳克每毫升（ng/mL）；m——样品的质量或体积，单位为克（g）。以重复性条件下获得的两次独立测定结果的算术平均值表示，结果保留三位有效数字。8精密度在重复性条件下获得的两次独立测试结果的绝对差值不超过算术平均值的10%。9其他本标准检出限为2μg/100g。6'