用分光光度法快速测定蛋白质含量的研究

'用分光光度法快速测定蛋白质含量的研究第32卷第4期河南工业大学(自然科学版)2011年8月JournalofHenanUniversityofTechnology(NaturalScienceEdition)Vo1.32.No.4Aug.2011文章编号:1673—2383(2011)04—0027—03用分光光度法快速测定蛋白质含量的研究何保山,王丹,左春艳,王金水(1.河南工业大学粮油食品学院,河南郑州450052;2.河南工业大学生物工程学院,河南郑州450001)摘要:基于分光光度法检测技术,建立了样品中蛋白质含量的快速分析方法.利用试样中蛋白质与染色剂考马斯亮蓝G-250间的快速结合反应,生成有色结合物,在最大吸收波长610nm处生成物吸光值与样品中蛋白质浓度成比例,线性范围0～100~g/mL,相关系数为0.997,检测时间少于2min,可用于样品中蛋白质含量的快速测定.关键词:分光光度法;蛋白质;考马斯亮蓝G.250;快速测定中图分类号:TS201.2文献标志码:B0引言蛋白质在生物体内占有特殊的地位,它和核酸是构成原生质的主要成分,是生命现象的物质基础,在催化生命体内各种反应进行,调节代谢,抵御外来物质入侵及控制遗传信息等方面都起着至关重要的作用,具有糖类和脂肪不可替代的作用_l-2].民以食为天,食品是人们生活的最基本必需品,而食物中的蛋白质是人体中氮的唯一来源.因此,食品中蛋白 质含量的多少,不仅表示食品的质量,而且也关系着人体的健康].国家食品卫生标准也对部分食品中蛋白质的含量作了相应规定,其中,动物乳和动物乳制品中蛋白质的测定是食物营养成分分析的必测项目_5】.传统的凯氏定氮法其基本原理是将食品与硫酸和催化剂一同加热消化,使蛋白质分解,分解的氨与硫酸结合生成硫酸铵,然后碱化蒸馏使氨游离,用硼酸吸收后再以硫酸或盐酸标准溶液滴定,根据酸的消耗量乘以换算系数,即为蛋白质含量[6-9].很明显,利用凯氏定氮法测得的结果不完全是蛋白质,还包括一些非蛋白质类的含氮收稿日期:2011—03—02基金项目:河南省重点科技攻关资助项目(102102310305);河南省教育厅自然科学研究资助项目(2011A550002);郑州市科技攻关资助项目(0910SGYS34370—3);郑州市科技攻关资助项目(2010GYXM482)和河南工业大学博士基金资助项目(2009BS0091作者简介:何保山(1978一),男,河南南阳人,讲师,主要从事食品安全快速检测,传感器技术和仪器仪表分析研究物质,如尿素氮,游离氨氮,无机氨盐等,致使不法分子有机可乘,在原料中掺入大量蛋白精——三聚氰胺以提高奶粉蛋白质含量,非法牟取暴利,从而导致震惊全国的"三鹿奶粉"事件的爆发,给国家和人民造成了不可挽回的损失.可见,传统方法难以解决牛奶中蛋白质的掺伪检验难题,同时也存在操作流程繁琐,耗时费力等缺点,且在操作过程中会产生大量有害气体而污染环境,影响操作人员健康,不能满足快速准确测定的需要.为解决以上问题,本研究应用蛋白质与染料考马斯亮蓝G一250间的显色反应,实现了对样品中 蛋白质的快速定量分析,具有检测速度快,特异性高,结果准确等特点.1材料与方法1.1试验材料牛血清蛋白(BSA,专业生化试剂供应商),考马斯亮蓝G-250(国药集团化学试剂有限公司),氯化钠注射液(郑州永和制药有限公司),磷酸(85%,洛阳吴华化学试剂有限公司),氢氧化钠(汕头市陇化工厂有限公司).所用试剂均为分析纯.试验所用水为二次蒸馏水.1.2主要仪器双光束紫外可见分光光度计(北京普析通用仪器有限责任公司).28河南工业大学(自然科学版)第32卷1.3试验方法1.3.1考马斯亮蓝G-250显色剂(2.0mg/mL)配制准确称取2.4mg考马斯亮蓝G一250置于400txL无水乙醇和800ILL磷酸的混合溶液中,充分溶解,备用.1.3.2补充溶液的配制准确量取2.5mL无水乙醇,5.0mL磷酸和42.5mL的蒸馏水置于50mL的带塞玻璃瓶中,充分混匀,备用.1.3.3牛血清蛋白(BSA)标准溶液(1.0mg/mL)的配制准确称取1.0mg牛血清蛋白样品置于1000IxL的生理盐水中,充分溶解.1.3.4样品中蛋白质的测定测试时,首先分别移取150考马斯亮蓝 G-250显色剂,2300IxL补充溶液至比色肌中,再移取50检测试样至比色皿中,室温下反应2min,然后利用Tu一1901双光束紫外分光光度计测量其在波长610nm的吸光值,通过吸光值与蛋白质浓度间的响应关系得知样品中蛋白质的含量.2结果与分2.1蛋白质与考马斯亮蓝G-250问生成物最大吸收波长的确定由于不同厂家生产的考马斯亮蓝G一250与蛋白质问的生成物其光谱特点会有所差异,因此,利用考马斯亮蓝法对蛋白质进行检测时,首先需要对显色反应的光谱特点进行考察.试验中分别对游离考马斯亮蓝G一250溶液以及蛋白质与考马斯亮蓝G一250间的反应溶液进行了光谱扫描,结果如图1所示.由图1可以看出,在200～900nm之间的整个扫描区间内,游离考马斯亮蓝G一250在波长469nm处有明显的吸收峰,此为游离考马斯亮蓝G一250的最大吸收波长(图1曲线A).当溶液中引入蛋白质后,游离考马斯亮蓝G一250与蛋白质问发生快速结合反应,考马斯亮蓝G一250浓度下降,其最大吸收波长469nm处吸光值由1.918降为1.465,而光谱曲线在波长610nm处较游离考马斯亮蓝G一250出现了明显的吸收峰,峰值为2.365,此应为游离考马斯亮蓝G.250与蛋白质反应后生成物的特征吸收峰.因此,试验中将显色反应的最大吸收波长定为610lain.A:150IxL2.0mg/mL考马斯亮蓝G一250+2350ILL补充液B:150IxL2.0mg/mL考马斯亮蓝c一250+2300补充液+5OL1.0mg/ml蛋白质 图1考马斯亮蓝G一250与蛋白质间的光谱扫描曲线2.2反应时间的优化试验中将测量波长定为610nm,依次移取125L考马斯亮蓝G一250溶液,2250txL补充液和125IxL的BSA标准溶液置于比色皿中充分混合,在紫外可见光分光光度计上进行时间扫描,结果如图2所示.由图2可以看出,蛋白质与考马斯亮蓝G250结合反应非常迅速,2rain后生成物吸光值即可达到稳定,因此,选择反应时间为2min.图2蛋白质与考马斯亮蓝G一250间显色反应的时间扫描曲线2.3显色剂用量的优化试验固定比色皿中蛋白质溶液的浓度为100I~g/mL,改变考马斯亮蓝G.250用量,分别移取0L,50L,100L,150IxL,200ILL,250ILL和300IxL2.0mg/mL考马斯亮蓝G一250置于比色皿中,反应2min,进行光谱扫描,结果如图3所示.由图3可以看出,随着考马斯亮蓝G一250引入量的增加,在最大吸收波长610nm处生成物的吸光值也逐渐增大,当考马斯亮蓝G一250引入量大于150IxL时,峰值趋于恒定,但峰形出现了较多尖锐第4期何保山,等:用分光光度法快速测定蛋白质含量的研究的凸起,体系不再稳定,这说明此时结合反应需要更长的时间才能完成,另外,试验中还发现,染料过量的引入,其自身的颜色也会对体系的吸光值产生影响,因此,结合实际情况,将考马斯亮蓝G?250的引入量定为150IxL.A:0I~L;B:50L;C:100I,zL;D:150~L;E:200L;F:250LLL;G:300IxL 图3不同用量的考马斯亮蓝G250与蛋白质反应的光谱扫描曲线2.4其他含氮物质对吸光值的影响试验中分别将三聚氰胺,硫酸铵和甘氨酸作为干扰物质引入到蛋白质与考马斯亮蓝G一250的反应体系中,结果显示,在相同试验条件下,上述3种试剂不与考马斯亮蓝G一250发生结合反应,对显色反应并不产生影响,这说明本方法选择性高,抗干扰能力强,可有效地区别真假蛋白质.2.5样品的测定在最优化的检测条件下,应用上述建立的光学显色法对浓度为0-100~g/mL的蛋白质样品进行检测,结果如图4所示.图4蛋白质浓度与吸光值(Abs)的拟合直线图由图4可以看出,在-100~g/mL的蛋白质浓度范围内,吸光值与蛋白质浓度呈线性相关,线性方程为Y=0.0119x一0.0574,相关系数R=O.997,检测时间为2min,可以用于样品中蛋白质的快速检测.3结论蛋白质的定性,定量分析在食品检验,临床分析,疾病诊断,生物化学等学科领域中应用广泛,它的测定方法有很多种,但对其进行快速定量分析的研究较少.本研究基于蛋白质与考马斯亮蓝G一250间的快速显色反应,其生成物的吸光值与样品中蛋白质浓度成比例,建立了蛋白质的光学分析技术,反应时间2min,实现了样品中蛋白质含量的快速定量检测,选择性高,可有效区分真假蛋白质.参考文献: 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methodslJj.JournalofFoodCompositionandAnalysis,2003,16:507—516.(下转第35页)]j]j]j]J1J]j]j]J]Jl23456789rlrlrlrlrlrlrlr●LrL第4期郭家瑞,等:用响应面法优化灰树花菌丝体多糖微波提取工艺的研究35[10][11](7):159—162.彭彪,王梅英,陈绍军,等.正交试验优化岩茶黄酮微波提取工艺[J].食品研究与开发,2008,29(2):15—18.BoxGEP,HunterWG.Staticsforexpefi—ments:Anintroductiontodesign,dataanalysisandmodelbuilding[M].NewYork:Wiley,1990.[12]PareJRJ.Microwave—assistednaturalprod—uctsextraction:U.S,5002784[P].1991—03.0PTIMIZAT10N0FMICR0WAVE—ASSISTEDEXTRACTIONC0NDIT10NS0FMYCELIUMP0LYSACCHARIDESFR0MG册职DⅣDDBYRESPONSESURFACEMETH0D0LOGYGUOJia—rui,WANGWei—guo,LIPeng,CUIYu-jia(SchoolofBioengineering,HenanUniversityofTechnology,Zhengzhou450001,China)Abstract:Onthebasisofsinglefactorexperiments,weoptimizedthemicrowave-assistedextractionconditionsofmyceliumpolysaccharidesfromCrifolafrondosabyresponsesurfacemethodology(RSM),andcomparedtheresultswiththatofthewaterextractionmethod.Theresultsshowedthattheoptimalextractionconditionsof microwave—assistedextractionmethodwereasfollows:microwavepower570.21W.extractiontime6.91minandliquid—to—materialratio40.29:1(:),extractiontwice;theactualextractionratewas11.30%,whichhasasmallrelativeerrorincomparisontothepredictivevalue(11.33%);andthepolysaccharideextractionrateofthemicrowave-assistedextractionmethodwaslargerthanthatofthewaterextractionmethodbyfourtimes.Keywords:Crifolafrondosa;myceliumpolysaccharides;microwave—assistedextraction;responsesurfaceanalysis(上接第29页)RESEARCHONRAPIDDETERMINAT10NOFPR0TEINC0NTENTBYSPECTROPH0T0METRICMETH0DHEBao-shan,WANGDan,ZUOChun—yah,WANGJin—shui(1.SchoolofFoodScienceandTechnology,HenanUniversityofTechnology,Zhengzhou450052,China;2.SchoolofBiotechnologyEngineering,HenanUniversityofTechnology,Zhengzhou450001,China)Abstract:Basedonthespectrophotometrydetectiontechnique,weestabilishedarapidanalysismethodfordeterminingtheproteincontentinsamples.Intheexperiment,theproteininthesamplesquicklyreactedwithcoomassiebrilliantblueG一250togenerateacoloredcombination,theabsorptionvalueofthecombinationatthemaximumabsorptionwavelengthof610nmwasproportionaltotheproteinconcentrationinthesamples,withthelinearrangeof0to100~g/mLandlinearcoefficiencyof0.997.Themethodcompletedin2minutes.andcouldbeusedfortherapiddeterminationofproteincontentinsamples. Keywords:spectrophotometry;protein;coomassiebrilliantblueG-250;rapiddetermination'