盐酸萘乙二胺分光光度法测定肉制品中的亚硝酸盐

'盐酸萘乙二胺分光光度法测定肉制品中的亚硝酸盐姓名：班级：食品科学学号：一目的要求1通过实验强化对紫外—可见分光光度法定量分析原理的理解；2了解以紫外—可见分光光度法为基础的检测方法的建立思路；3直观了解紫外—可见分光光度计的结构；4掌握紫外－可见吸收光谱的测定方法；5掌握利用标准曲线法进行定量分析的方法。二实验原理亚硝酸盐在食品生产中用作发色剂和防腐剂，允许用于肉及肉制品的生产加工中，使得肉与肉制品呈现良好的色泽。其呈色机理是，亚硝酸盐与肌肉中的乳酸作用产生亚硝酸，而亚硝酸不稳定易分解产生一氧化氮，然后一氧化氮与肌红蛋白结合产生红色的亚硝基肌红蛋白，使肉制品产生稳定的红色。但是过量的亚硝酸盐能够引起高铁血红蛋白症，导致组织缺氧，还可使血管扩张、血压降低。在酸性条件下，亚硝酸盐可与对氨基苯磺酸通过重氮化反应定量生成重氮盐，该重氮盐可进一步与盐酸萘乙二胺通过偶联反应生成紫红色偶氮染料，在特定波长处产生较强吸收：；通过测定该偶氮染料在特定波长下的吸光度，利用朗伯-比尔定律（A=KLc）可确定样品中亚硝酸盐的质量浓度。采用标准曲线法进行定量分析时，可对亚硝酸盐标准溶液系列进行上述反应，通过测定该系列的吸光度，利用excel回归标准曲线，得到浓度和吸光度的关系，再将样品中亚硝酸盐测得的吸光值带到方程中算出其中亚硝酸盐的浓度。三仪器与试剂1仪器CaryEclipse型紫外-可见分光光度计；BS124S电子分析天平。2试剂亚铁氰化钾[K4Fe(CN)6·3H2O]、乙酸锌[Zn(CH3COO)2·2H2O]、硼砂[Na2B4O7·10H2O]、对氨基苯磺酸、盐酸萘乙二胺，均为分析纯试剂。四实验步骤1试剂配制亚铁氰化钾溶液：称取106.0g亚铁氰化钾，溶解于水后稀释至1000mL。 乙酸锌溶液：称取220.0g乙酸锌，加30mL冰乙酸溶于水，稀释至1000mL。饱和硼砂溶液：称取5.0g硼砂，溶解于100mL热水中，冷却后备用。对氨基苯磺酸溶液：称取0.4g对氨基苯磺酸，溶解于100mL20%的盐酸中，置棕色瓶中摇匀，避光保存，其浓度为4g/L。盐酸萘乙二胺溶液：称取0.2g盐酸萘乙二胺，溶解于100mL水中,，混匀后置棕色瓶中，避光保存，其浓度为2g/L。亚硝酸钠标准储备溶液：精密称取0.1000g已于硅胶干燥器中干燥24h的亚硝酸钠，用蒸馏水溶解移入500mL容量瓶中，稀释至刻度，混匀。此溶液亚硝酸钠含量为200μg/mL。亚硝酸钠标准使用液：临用前吸取亚硝酸钠标准储备溶液5.00mL置于100mL容量瓶中，加水稀释至刻度，此溶液亚硝酸钠含量为10.0μg/mL。2标准溶液系列和样品制备标准溶液系列制备：吸取亚硝酸钠标准使用液0、2.5、5、10、15、20、25mL于50mL具塞比色管中，分别加入2mL对氨基苯磺酸溶液，混匀后静置3～5min，再分别加入1mL盐酸萘乙二胺溶液，加水至刻度，混匀静置15min后测定，制成的标准溶液浓度系列为0、0.5、1、2、3、4、5μg/mL。样品制备：称取5.0g经绞碎混匀的样品，将其置于50mL烧杯中，加入12.5mL硼砂饱和溶液，搅拌均匀，用约300mL70℃左右的水将样品转移入500mL容量瓶中，置沸水浴中加热15min后，取出冷却至室温，然后边转动边加入5mL亚铁氰化钾溶液，摇匀后再加入5mL乙酸锌溶液以沉淀蛋白质，加水至刻度，混匀（0.01g/ml），放置0.5h，除去上层脂肪后将清液用滤纸过滤，弃去初滤液约30mL，收集滤液备用。吸取40mL滤液于50mL具塞比色管中，加入2mL对氨基苯磺酸溶液，混匀后静置3～5min，再加入1mL盐酸萘乙二胺溶液，加水至刻度，混匀静置15min后测定(0.008g/ml)。3测定用1cm吸收池，对显色后的标准溶液系列最高浓度的溶液进行300-700nm范围内紫外—可见吸收光谱扫描，并从该光谱中确定最大吸收峰的波长。用1cm吸收池，以空白调节零点，于特定波长下测定标准溶液系列的吸光度峰值，每个标准溶液重复测定3次，记录吸光度数据；用同样条件测定样品溶液的吸光度，每个样品重复3次，记录样品吸光度数据。4实验结束后，按要求关好仪器。五结果处理（见后面）1对记录的标准溶液系列中的每一个标准溶液的3次吸光度求平均值，对该系列的吸光度平均值和浓度值进行线性回归，获得标准曲线方程A=a+bC中的a和b。该项工作亦可利用仪器的功能在仪器上完成。2对测定的样品溶液的3次吸光度求平均值，将该值代入A=a+bC中，得到样品的结果，根据样品的取样量计算出肉制品中亚硝酸盐以mg/kg为单位的含量。该项工作亦可利用仪器的功能在仪器上完成。六注意事项1该方法是通过衍生反应将亚硝酸盐转化为有色物质后再行测定的，因此要严格控制反应条件，以确保反应都能得到最大产率。 2所用吸收池的空载透过率要一致，避免由此带来测定误差。3样品和标准溶液系列要现测现配。七实验结果以下使我们测得的图谱：取各标准溶液系列的峰值吸收并做线性回归：浓度μg/ml吸光值A00.164210.52.2278911.0678123.1757833.90212542.84012510肴肉10.22136肴肉21.04639 按标准溶液做线性回归得到方程：将肴肉两个样品测得的吸光值带到线性回归方程求取其中亚硝酸盐含量：；样品制备液浓度为0.008g/ml,则肴肉样品中亚硝酸盐的含量（以mg/kg计）：八思考题1、朗伯比尔定律的使用条件？答：(1)入射光为平行单色光且垂直照射。　　(2)吸光物质为均匀非散射体系。　(3)吸光质点之间无相互作用。　　(4)辐射与物质之间的作用仅限于光吸收,无荧光和光化学现象发生。2、比色皿的材质分别适合对哪个光区进行检测？答：比色皿的材质主要有石英、熔凝硅石和光学玻璃。玻璃比色皿：由普通硅酸盐光学玻璃制成，对紫外线几乎全部吸收,吸光度非常大。只能用于350nm至2000nm的可见及近红外光谱区域。 石英比色皿：由石英或熔熔硅石制成，对绝大部分光谱的吸光度都小得多。低于350nm的光谱（紫外）的工作区必须使用的石英比色皿，也可用于可见光区域。3、标准溶液、空白溶液、参比溶液的区别？答：已知准确浓度的溶液，在光度测量中一系列的标准溶液常通过用标准溶液绘制工作曲线或作计算标准叫做标准溶液（通过线性回归的处理来计算位置溶液的浓度）。参比溶液又称空白溶液，测量时用作比较的、不含被测物质但其基体尽可能与试样溶液相似的溶液。在进行光度测量时,利用参比溶液来调节仪器的零点,可以消除由于吸收池壁及溶剂对入射光的反射和吸收带来的误差,并扣除干扰的影响。4、在样品处理步骤中，加入含有硼砂的热水的作用是什么？答：硼砂溶入水中，即被水解为等量的硼酸与硼酸二氢钠，起缓冲溶液作用。溶液pH约为9.18，即碱性。在碱性下处理样品有几方面作用，1、锌盐沉淀蛋白质时，要求在碱性。2、碱性下处理肉制品，脂肪被皂化，减少样品被脂肪包裹，使亚硝基根更易提取到水溶液中，3、溶液在碱性下亚硝基根以离子存在，易溶且稳定，如溶液偏酸性，则形成亚硝酸，在加热下容易挥发，也易分解，造成损失。另外用热水是加速亚硝酸溶解，使之提取完全。5、在样品处理步骤中，加入亚铁氰化钾和乙酸锌的作用是什么？答：乙酸锌和亚铁氰化钾是是蛋白质的沉淀剂，这两种试剂形成白色的氰亚铁酸锌沉淀，能使溶液中的蛋白质共同沉淀下来。6、为什么亚硝酸盐测定不采用直接测定其自身最大吸收波长处吸光度的方法来进行？答：因为重氮产物与盐酸萘乙二胺偶合生成红色的纯净偶氮染料最大吸收波长为538nm，而实际实验中由于各种因素的影响，可能导致最大吸收波长偏离538nm，若此时采用最大吸收波长处吸光度，会将影响因素放大，影响实验准确性。'