紫外-可见分光光度法 中国药品检验标准操作规范 2010年版

'紫外-可见分光光度法1简述紫外-可见分光光度法是通过被测物质在紫外光区或可见光区的特定波长处或一定波长范围内的吸光度，对该物质进行定性和定量分析的方法。本法在药品检验中主要用于药品的鉴别、检查和含量测定。定量分析通常选择物质的最大吸收波长处测出吸光度，然后用对照品或吸收系数求算出被测物质的含量，多用于制剂的含量测定；对已知物质定性可用吸收峰波长或吸光度比值作为鉴别方法；若该物质本身在紫外光区无吸收，而其杂质在紫外光区有相当强度的吸收，或杂质的吸收峰处该物质无吸收，则可用本法作杂质检查。物质对紫外辐射的吸收是由于分子中原子的外层电子跃迁所产生，因此，紫外吸收主要决定于分子的电子结构，故紫外光谱又称电子光谱。有机化合物分子结构中如含有共轭体系、芳香环等发色基团，均可在紫外区（200~400nm）或可见光区（400~850nm）产生吸收。通常使用的紫外-可见分光光度计的工作波长范围为190~900nm。紫外吸收光谱为物质对紫外区辐射的能量吸收图。朗伯-比尔（Lambert-Beer）定律为光的吸收定律，它是紫外分光光度法定量分析的依据，其数学表达式为：A=lg1T=Ecl式中A为吸光度；T为透光率； E为吸收系数；c为溶液浓度；l为光路长度。如溶液的浓度（c）为1%（g/ml），光路长度（l）为1cm，相应的吸光度即为吸收系数，以E表示。如溶液的浓度（c）为摩尔浓度（mol/L），光路长度为1cm时，则相应的吸收系数为摩尔吸收系数，以ε表示。2仪器紫外-可见分光光度计主要由光源、单色器、样品室、检测器、记录仪、显示系统和数据处理系统等部分组成。为了满足紫外-可见光区全波长范围的测定，仪器备有两种光源，即氘灯和碘钨灯，前者用于紫外区，后者用于可见光区。单色器通常由进光狭缝、出光狭缝、平行光装置、色散元件，聚焦透镜或反射镜等组成。色散元件有棱镜和光栅两种，棱镜多用于天然石英或熔融硅石制成，对200～400nm波长光的色散能力很强，对600nm以上波长的光色散能力较差，棱镜色散所得的光谱为非匀排光谱。光栅系将反射或投射光经衍射而达到色散的作用，故常称为衍射光栅，光栅光谱是按波长作线性排列，故为匀排光谱，双光束仪器多用光栅为色散元件。检测器有光电管和光电倍增管两种。紫外-可见分光光度计依据其结构和测量操作方式的不同可分为单光束和双光束分光光度计两种。单光束分光光度计有些仍为手工操 作，即固定在某一波长，分别测量比较空白、样品或参比的透光率或吸光度，操作比较费时，用于绘制吸收光谱图时很不方便，但适用于单波长的含量测定。双光束分光光度计藉扇形镜交替切换光路使分成样品（S）和参比（R）两光束，并先后到达检测器，检测器信号经调制分离成两光路对应新号，新号的比值可直接用记录仪记录，双光束分光光度计操作简单，测量快速，自动化程度高，但作含量测定时，为求准确起见，仍宜用固定波长的测量方式。3紫外-可见分光光度计的检定3.1波长准确度3.1.1波长准确度的允差范围紫外-可见分光光度计波长准确度允许误差，紫外区为±1nm，500nm处±2nm。3.1.2波长准确度检定方法3.1.2.1用低压汞灯检定关闭仪器光源，将汞灯（用笔式汞灯最方便）直接对准进光狭缝，如为双光束仪器，用单光束能量测定方式，采用波长扫描方式，扫描速度“慢”（如15nm/min）、响应“快”、最小狭缝宽度（如0.1nm）、量程0～100%，在200～800nm范围内单方向重复扫描3次，由仪器识别记录各峰值（若仪器无“峰检测”功能，必要时可对指定波长进行“单峰”扫描）。用于检定紫外-可见分光光度计的汞灯谱线波长：237.83、253.65、275.28、296.73、302.15、313.16、334.15、365.02、365.48、366.33、404.66（紫色）、435.83（蓝色）、546.07（绿色）、576.96（黄色）及579.07nm。 3.1.2.2用仪器固有的氘灯检定本法主要用于日常工作中波长准确度的核对。取单光束能量测定方式，测量条件同上述低压汞灯的方法，对486.02nm及656.10nm二单峰进行方向重复扫描3次。3.1.2.3用氧化钬玻璃检定将氧化钬玻璃放入样品光路，参比光路为空气，按测定吸收光谱图方法测定。校正自动记录仪器时，应考虑记录仪的时间常数，测定样品与校正时取同一扫描速度。氧化钬玻璃在279.4、287.5、333.7、360.9、418.7、460.0、484.5、536.2及637.5nm波长处有尖锐的吸收峰，可供波长检定用。氧化钬玻璃因制造的原因，每片氧化钬的吸收峰波长有差异，另外，在放置过程中也会发生波长漂移，因此需定期由计量部门校验。3.1.2.4用高氯酸钬溶液检定本法可供没有单光束测定功能的双光束紫外分光光度计波长准确度检定用。高氯酸钬溶液的配制方法：取10%高氯酸为溶剂，加入氧化钬（Ho2O3）配成4%溶液即得。高氯酸钬溶液较强的吸收峰波长为241.13、278.10、287.18、333.44、345.47、361.31、416.28、451.30、485.29、536.64、640.52nm。如果是双光束扫描仪器，但不是数据贮存型的（指是直接将信号描记于记录纸上），记录的波长可能因记录笔滞后而非真实波长，为了准确测定，建议采用定点检定而不是扫描方式。3.2吸光度准确度 精密称取在120℃干燥至恒重的基准重铬酸钾约60mg，置1000ml量瓶中，用0.005mol/L硫酸液溶解并稀释至1000ml，用配对的1cm石英池，以0.005mol/L硫酸液为空白，在235、257、313、350nm分别测定吸光度，然后换算成E，测得值应符合表1中规定的允差范围。表1分光光度法允差范围波长吸收强度吸收系数E允差范围235最小124.5123.0～126.0257最大144.0142.8～146.2313最小48.647.0～50.3350最大106.6105.5～108.5分辨率、基线平直度、稳定度、绝缘电阻等项检定，按现行国家技术监督局“双光束紫外-可见分光光度计检定规程”检定，应符合有关项下的规定。日常使用中，对以上两项，即波长和吸光度准确度应根据需要随时检查。3.3杂散光的检查可按表2所列的试剂和浓度，配制成水溶液，置1cm石英池中，在规定的波长处测定透光率，应符合表2中规定。表2杂散光的检查及限度试剂浓度（%，g/ml）测定用波长（nm）透光率（%）碘化钠1.00220<0.8亚硝酸钠5.00340<0.84样品测定操作方法4.1吸收系数测定（性状项下）按各品种项下规定的方法配制供试品溶液，在规定的波长处（参见5.8项）测定其吸光度，并计算吸收系数，应符合规定范围。 4.2鉴别及检查按各品种项下的规定，测定供试品溶液的最大及最小吸收波长，有的并须测定其在最大吸收波长与最小吸收波长处的吸光度比值，均应符合规定。4.3含量测定4.3.1对照品比较法按各品种项下规定的方法，分别配制供试品溶液和对照品溶液，对照品溶液中所含被测成分的量应为供试品溶液中被测成分标量的100%±10%以内，用同一溶剂，在规定的波长处测定供试品溶液和对照品溶液的吸光度。4.3.2吸收系数法按各品种项下配制供试品溶液，在规定的波长及该波长±2nm处测定其吸光度，按各该品种在规定条件下给出的吸收系数计算含量。4.3.3计算分光光度法按《中国药典》规定，计算分光光度法一般不宜用于含量测定，对于少数采用计算分光光度法的品种，应严格按各品种项下规定的方法进行。用本法时应注意：有一些吸光度是在待测成分吸收曲线的上升或下降陡坡处测定，影响精度的因素较多，故应仔细操作，尽量使供试品和对照品的测定条件一致。若该品种不用对照品，如维生素A测定法（见《中国药典》附录），则应在测定前对仪器作仔细的校正和检定。4.3.4比色法供试品本身在紫外-可见光区没有强吸收，或在紫外光区虽有吸收但为了避免干扰或提高灵敏度，加入适当的显色剂，使反应产物的最大吸收移至可见光区。 用比色法测定时，由于显色时影响显色深浅的因素较多，应取供试品与对照品或标准品同时操作。除另有规定外，比色法所用的空白系指同体积的溶剂代替对照品或供试品溶液，然后依次加入等量的相应试剂，并用同样方法处理。当吸光度和浓度关系不呈良好线性时，应取数份梯度量对照品溶液，用溶剂补充至同一体积，显色后测定各份溶液的吸光度，然后以吸光度与相应的浓度绘制标准曲线，再根据供试品的吸光度在标准曲线上查得其相应的浓度，并求出其含量。5注意事项5.1试验中所用的量瓶和移液管均应经检定校正、洗净后使用。5.2使用的石英吸收池必须洁净。当吸收池中装入同一溶剂，在规定波长测定各吸收池的透光率，如透光率相差在0.3%以下者可配对使用，否则必须加以校正。5.3取吸收池时，手指拿毛玻璃面的两侧。装样品溶液的体积以池体积的4/5为度，使用挥发性溶液时应加盖，透光面要用擦镜纸由上而下擦拭干净，检视应无残留溶剂，为防止溶剂挥发后溶质残留在池子的透光面，可先用蘸有空白溶剂的擦镜纸擦拭，然后再用干擦镜纸拭净。吸收池放入样品室时应注意每次放入方向相同。使用后用溶剂及水冲洗干净，晾干，防尘保存，吸收池如污染不易洗净时可用硫酸发烟硝酸（3：1V/V）混合液稍加浸泡后，洗净备用。如用铬酸钾清洁液清洗时，吸收池不宜在清洁液中长时间浸泡，否则清洁液中的铬酸钾结晶会损坏吸收池的光学表面，并应充分用水冲洗，以防铬酸钾吸附于吸收池表面。 5.4含有杂原子的有机溶剂，通常均具有很强的末端吸收。因此，当作溶剂使用时，它们的使用范围均不能小于截止使用波长。例如甲醇、乙醇的截止使用波长为205nm。另外，当溶剂不纯时，也可能增加干扰吸收。因此，在检查所用的溶剂在供试品所用的波长附近是否符合要求，即将溶剂置1cm石英吸收池中，以空气为空白（即空白光路中不置任何物质）测定其吸收光度，溶剂和吸收池的吸光度应符合表3规定。表3以空气为空白测定溶剂在不同波长处的吸光度的规定波长范围（nm）220～240241～250251～300300以上吸光度≤0.40≤0.20≤0.10≤0.05每次测定时应采用同一厂牌批号，混合均匀的同批溶剂。5.5称量应按药典规定要求。配制测定溶液时稀释转移次数应尽可能少，转移稀释时取容积一般不少于5ml。含量测定时供试品应称取2份，如为对照品比较法，对照品一般也应称取2份。吸收系数检查也应称取供试品2份，平行操作，每份结果对平均值的偏差应在±0.5%以内。作鉴别或检查可取样品1份。5.6供试品溶液的浓度，除各品种项下已有注明者外，供试品溶液的吸光度以在0.3～0.7之间为宜，吸光度读书在此范围误差较小，并应结合所用仪器吸光度线性范围，配制合适的读数浓度。5.7 选用仪器的狭缝谱带宽度应小于供试品吸收带半高宽的10%，否则测得的吸光度值会偏低，或以减小狭缝宽度时供试品溶液的吸光度不再增加为准，对于《中国药典》紫外分光光度法测定的大部分品种，可以使用2nm缝宽，但当吸收带的半高宽小于20nm时，则应使用较窄的狭缝，例如青霉素钾及钠的吸光度检查需用1nm缝宽或更窄，否则其264nm的吸光度会偏低。5.8测定时除另有规定者外，应在规定的吸收峰±2nm处，再测几点的吸光度，以核对供试品的吸收峰位置是否正确，并以吸光度最大的波长作为测定波长，除另有规定外吸光度最大波长应在该品种项下规定的波长加减2nm以内，否则应考虑试样的同一性、纯度以及仪器波长的准确度。5.9用于制剂含量测定时，应注意供试液与对照液的PH值是否一致，如PH值对吸收有影响，则应调溶液的PH值一致后再测定吸光度。6结果计算6.1对照品比较法可根据供试品溶液及对照品溶液的吸光度与对照品溶液的浓度以正比法算出供试品溶液的浓度，再计算含量。C样品=A样品×C对照/A对照式中A为吸光度值；C为测试液浓度（以mg/ml计）6.2吸收系数法《中国药典》规定的吸收系数，系指E，即在指定波长时，光路长度为1cm，试样浓度换算为1%(g/ml)时的吸光度值，故应先求被测样品的E值，再与规定的E值比较，可计算出供试样品的含量。E样品=Ac×l式中A为供试品溶液测得的吸光度值； c为供试品溶液的百分浓度，即100ml中所含溶质的克数（g/ml）；l为吸收池的光路长度（cm）供试品的含量%=E1cm样品1%E1cm标准1%×100式中E1cm样品1%为根据前式计算出的供试品吸收系数；E1cm标准1%为药典或药品标准中规定的吸收系数。7吸收系数测定法本法主要用于新品种的吸收系数测定。7.1测定方法取精制样品精密称取一定量，使样品溶液配成吸光度读数在0.6～0.8之间，置1cm吸收池中，在规定波长处按5.8项的规定测出吸光度读数，然后再用同批溶剂将溶液稀释1倍，使吸光度在0.3～0.4之间，再按上述方法测定。样品应同时测定2份，同一台仪器测定的2份结果，对平均值的偏差应不超过±0.3%，否则应重新测定。测定时，先按仪器正常灵敏度测试，然后再减小狭缝测定，直到减小狭缝吸光值不增加为止，取吸光度不改变的数据。再用4台不同型号的仪器复测。吸收系数可根据朗伯-比尔定律求算，以下例说明。已知某化合物的分子量287，用乙醇配成浓度为0.0030%的溶液，在波长297nm处，用1cm石英池，测得吸光度为0.6139，求E1cm1%值及摩尔吸收系数e值。E1cm1%297nm=A/cl=0.6140.0030×1=205e=A/cl=0.6140.0030×1000100287×1=5874 7.2测定注意事项7.2.1样品应为精制品，水分或干燥失重应另取样测定并予以扣除。7.2.2所用的容量仪器及分析天平应经过检定，如有相差应加上校正值。7.2.3测定所用的溶剂，其吸光度应符合规定。吸收池应于临用时配对或作空白校正。7.2.4称取样品时，其称量准确度应按《中国药典》规定要求。7.2.5所用的分光光度计应经过严格检定，特别是波长准确度和吸光度精度要进行校正。要注明测定时的温度。修订人：周静远（天津市药品检测所）凌大奎（北京市药品检测所）'