可见及紫外分光光度法测定中药复方总黄酮的比较研究

'可见及紫外分光光度法测定中药复方总黄酮的比较研究　　摘要：目的研究并比较可见分光光度法及紫外分光光度法测定中药复方总黄酮含量。方法可见分光光度法以芦丁为参照品，显色剂为NaNO2-Al（NO3）3-NaOH体系，在510nm波长处测定吸光度，计算中药复方总黄酮含量；紫外分光光度法以芦丁为参照品，在359nm波长处测定吸光度，计算中药复方总黄酮含量。结果可见分光光度法扫描曲线有较大差异，吸收峰红移，在510nm处吸光度值最大。紫外分光光度法扫描曲线在紫外光谱图上显示两个吸收峰，在359nm处吸光度值最大，500～800nm处无吸收峰；可见分光光度法测定的中药复方总黄酮含量比紫外分光光度法的测定值高，含量高低成正比。结论采用NaNO2-Al（NO3）3-NaOH体系可见分光光度法稳定中药复方总黄酮方法可靠，是测定中药复方总黄酮含量的理想方法。　　关键词：可见分光光度法；紫外分光光度法；中药复方；总黄酮；含量　　紫外-可见分光光度法具有稳定性好、准确度高、仪器设备操作简单等优点，常被应用与植物中黄酮含量的测定[1-3]。NaNO2-Al（NO3）3-NaOH体系则是药典中广泛应用的总黄酮含量测定法。本文采用可见分光光度法及紫外分光光度法测定白头翁汤加减复方总黄酮的含量，通过比较直接测定法与显色测定法，为中药复方总黄酮含量测定提供参考依据。 　　1资料与方法　　1.1仪器设备紫外-可见光分光光度计（UV-BluestarPlus，北京莱伯泰科仪器有限公司）；分析电子天平（AUW120D，日本津岛公司）；台式低速多管架自动平衡离心机（TD5A-WS，长沙湘仪离心机仪器有限公司）；微量移液器（印pendorf，德国）；超声波清洗器（SB-5200DTN，宁波新芝生物科技股份有限公司）；隔膜真空泵（GM-0.5B，天津市津腾实验设备有限公司）；雷磁酸度计PH计（PHSJ-4A，上海精密科学仪器公司）；常规玻璃仪器。　　1.2试药芦丁为参照品（批号：100080-20070，质量分数92.5%，中国药品生物制品检定所，供含量测定用）。甲醇、乙醇（分析纯，天津市光复精细化工研究所），纯化水、自制超纯水。中药成分为甘草、白头翁、秦皮、南山楂、粉葛根、车前子、黄连、藿香、地榆、白芍，购自安徽沪谯中药饮片厂（生产许可证号：皖Y20050027，批号：060904）。　　1.3方法　　1.3.1样品制备白头翁汤加减复方以甘草、白头翁、秦皮、南山楂、粉葛根、车前子、黄连、藿香、地榆、白芍=1：3：2：4：3：2：115：3：3：2配制。弄成碎末，加水2次煎熬后提取，浓缩，添加乙醇致含醇量为65%，离心去掉沉淀后蒸干，添加甲醇溶解，离心，取上清液加甲醇定容到原药材量1：1。　　1.3.2参照品溶液制备取芦丁参照品12mg，精密称取，置于50ml瓶中，加70%乙醇溶解并稀释到刻度，得质量浓度为0.24mg/ml的芦丁参照品溶液。 　　1.3.3紫外-可见分光光度法扫描与标准曲线制备　　1.3.3.1可见分光光度法精密称定芦丁参照品溶液1.00ml、2.00ml、3.00ml、4.00ml、5.00ml、6.00ml分别置25ml容量瓶中，均加水到6.00ml；加5%的NaNO2溶液1.00ml，摇匀，放置6min；加10%的Al（NO3）3溶液1.00ml，摇匀，放置6min；加4%的NaOH溶液10.00ml，再加水到刻度，摇匀，放置15min。以相应试剂为空白，在400～800nm范围内进行光谱扫描，得510nm处为可见最大吸收峰。以空白试剂为参照，将6个标准品溶液分别在510nm下测定吸光度，得回归方程A=0.00988C+0.00523，r=0.9997。芦丁浓度在9.6～57.6mg/L范围线性关系佳。　　1.3.3.2紫外分光光度法精密称定芦丁参照品溶液0.10ml、0.20ml、0.40ml、0.60ml、0.80ml、1.00ml于5ml容量瓶中，均加甲醇到刻度，摇匀。以甲醇作为空白试剂参照，在400～800nm范围内进行光谱扫描，得359nm处为紫外最大吸收峰。以空白试剂为参照，将6个标准品溶液分别在359nm下测定吸光度，得回归方程A=0.02503C+0.02367，r=0.9995。芦丁浓度在4.8～48mg/L范围线性关系佳。　　1.3.4紫外-可见分光光度法测定中药复方总黄酮含量　　1.3.4.1可见分光光度法精密称定复方样品1.00ml置于10ml容量瓶中，加甲醇到刻度，再取1.50ml置于25ml容量瓶中，加水到6.00ml，加5%的NaNO2溶液1.00ml，摇匀，放置6min；加10%的Al（NO3）3溶液1.00ml，摇匀，放置6min；加4%的NaOH溶液10.00ml，再加水到刻度，摇匀，放置15min。平行测定吸光度3次，仪器自动计算样品总黄酮含量。 　　1.3.4.2紫外分光光度法精密称定复方样品1.00ml置于10ml容量瓶中，再取1.50ml置于25ml容量瓶中，均加甲醇到刻度，摇匀。平行测定吸光度3次，仪器自动计算样品总黄酮含量。　　2结果　　2.1两种扫描曲线比较可见分光光度法扫描曲线：芦丁参照品溶液添加NaNO2-Al（NO3）3-NaOH体系显色后，在碱性环境下铝离子与黄酮化合物形成稳定有色金属络合物，吸收光谱的曲线有较大差异，吸收峰红移，在510nm处吸光度值最大。紫外分光光度法扫描曲线：按照黄铜的结构特点，在紫外光谱图上显示两个吸收峰，在359nm处吸光度值最大，500～800nm处无吸收峰。　　2.2两种测定法比较比较可见分光光度法与紫外分光光度法测定全方与缺药方中的黄酮含量，如表1所示。结果表明，可见分光光度法测定的中药复方总黄酮含量比紫外分光光度法测定值高，含量高低成正比。　　3讨论　　可见-紫外分光光度法的研究已经得到广泛认可，它在单一成分的测定中具有稳定性好、精密度高等优势[4]，而对于成分较多的药品，因为受到仪器设备、数据自动处理等因素限制，采用NaNO2-Al（NO3）3-NaOH体系可见分光光度法进行含量测定更为理想[5]。白头翁汤加减复方成分较多，在提取和制备过程中可能会产生各种化学反应，黄酮类化合物在紫外区间的吸光度值有变化，添加Al（NO3）3显色剂后在碱性环境下可与黄酮组成血红色螯合物，在510nm形成新的吸收峰，以测定黄酮含量。　　参考文献： 　　[1]王东升，张世栋，苗小楼，等.紫外分光光度法测定淫羊藿中总黄酮的含量[J].安徽农业科学，2013（17）：7471-7472.　　[2]范华锋，赵士权，查河霞.紫外分光光度法测定保健食品中总黄酮的方法改进[J].中国卫生检验杂志，2011（4）：827-828.　　[3]林君红，叶珍珍，崔升淼.紫外分光光度法测定康丽胶囊中总黄酮的含量[J].广东药学院学报，2012（6）：619-622.　　[4]王静，薛培凤，赵子龙，等.紫外分光光度法测定蒙药玉簪花中总黄酮的含量[J].内蒙古医科大学学报，2013（2）：93-95.　　[5]邾枝花，黄平.紫外分光光度法测定黄蜀葵花总黄酮片中总黄酮的含量[J].北方药学，2012（10）：3-4.　　编辑/哈涛'