第十章 紫外可见分光光度法

'第十章紫外-可见分光光度法 概述第一节紫外-可见分光光度法的基本原理和概念第二节紫外-可见分光光度计第三节紫外-可见分光光度法的应用主要内容 概述分光光度法是物质分子对光的选择性吸收而建立起来的分析方法。按物质吸收光的波长不同，可分为可见分光光度法、紫外分光光度法及红外分光光度法。 紫外可见分光光度计的主要应用方面①粮食系统：对维生素A、C、E、K、山梨酸、苯甲酸、棉酸、甲脂、乙酸脂、胡萝卜素、烟酸、总氨基酸等的检测;对微量元素，例如：钾、铁、硒、碘、铜、磷、锰等也可用紫外可见分光光度计检测;特别是对人体有毒有害的微量元素的检测工作中使用更加广泛。 ②标准片测试：计量部门对在用的各类紫外可见分光光度计仪器的杂散光(SL)、光度准确度(PA)等关键性能技术指标的检测，必须用比被检测仪器的档次高的紫外可见分光光度计，测试一块石英片的SL和PA。然后用这块石英片作为二级标准检测被测的紫外可见分光光度计。 ③药检系统：我国和世界很多国家的药典，都明确规定许多药品，一定要用紫外可见分光光度计检测;它是药厂和药检系统必备的检测仪器(工具)。 ④石油工业：石油里一般都含有芳烃杂质，全世界基本上都用紫外可见分光光度计检测。⑤水质监测：水里的氨氮、亚硝酸盐致癌物质，一般都用紫外可见分光光度计检测。⑥环保系统：环境中的有害物质检测、环保材料的检测。 ⑦生命科学领域：蛋白质的测试波长为280nm、核酸的测试波长为260nm、氨基酸的测试波长为230nm、糖类的测试波长218nm、多糖的测试波长206nm等等，生命科学领域的这些物质的测试波长都在紫外区。 ⑧农药及其残留物：例如:粮食(大米、小麦中的氧化稀土)、食品添加剂(5,-鸟苷酸二钠)、蔬菜(亚硝酸盐、甲胺磷、西维因、氨氮、敌敌畏)、瓜果、茶叶等的农残检测，大多用紫外可见分光光度计进行。据美国癌症研究中心报道，人类癌症的90%来自有机物(天然有机和金属有机);其中农残为主。所以紫外可见分光光度计在农残的检测中非常有用。 ⑨渔业(水产品)质量控制：海水、淡水鱼类、贝类、虾类、海蜇类等中的苯、总三卤甲烷、甲苯基三唑、多氯联苯、氟、汞等，一般也是采用紫外可见分光光度计检测。 发展史1815年夫琅和费(J.Fraunhofer)仔细观察了太阳光谱，发现太阳光谱中有600多条暗线，并且对主要的8条暗线标以A、B、C、D…H的符号。这就是人们最早知道的吸收光谱线，被称为“夫琅和费线”。但当时对这些线还不能作出正确的解释。 1859年本生(R．Bunsen)和基尔霍夫(G．Kirchhoff)发现由食盐发出的黄色谱线的波长和“夫琅和费线，；中的D线波长完全一致，才知一种物质所发射的光波长（或频率），与它所能吸收的波长（或频率）是一致的。 1862年密勒(Miller)应用石英摄谱仪测定了一百多种物质的紫外吸收光谱。他把光谱图表从可见区扩展到了紫外区，并指出：吸收光谱不仅与组成物质的基团质有关。接着，哈托莱(Hartolay)和贝利(Balley)等人，又研究了各种溶液对不同波段的截止波长。并发现吸收光谱相似的有机物质，它们的结构也相似。并且，可以解释用化学方法所不能说明的分子结构问题，初步建立了分光光度法的理论基础，以此推动了分光光度计的发展。 1918年美国国家标准局研制成了世界上第一台紫外可见分光光度计（不是商品仪器，很不成熟）。此后，紫外可见分光光度士很快在各个领域的分析工作中得到了应用。 物质对光吸收的定量关系很早就受到了科学家的注意并进行了研究。皮埃尔·布格（PierreBouguer）和约翰·海因里希·朗伯（JohannHeinrichLambert）分别在1729年和1760年阐明了物质对光的吸收程度和吸收介质厚度之间的关系；1852年奥古斯特·比尔（AugustBeer）又提出光的吸收程度和吸光物质浓度也具有类似关系，两者结合起来就得到有关光吸收的基本定律——布格－朗伯－比尔定律，简称比尔－朗伯定律。 朗伯德国数学家 布格法国数学家、地球物理学家、大地测量学家和天文学家。他也以“造船工程之父”之名为人所知。 随后，人们开始重视研究物质对光的吸收，并试图在物质的定性、定量分析方面予以使用。因此，许多科学家开始研究以比耳定律为理论基础的仪器装置。经过一个漫长的时期后，美国Beckman公司于1945年，推出世界上第一台成熟的紫外可见分光光度计商品仪器。从此，紫外可见分光光度计的仪器和应用开始得到飞速发展。 概述一、紫外-可见分光光度法：是研究物质在紫外-可见光区(200~800nm)分子吸收光谱的分析方法。可见光区400~760nm；紫外光区200~400nm。二.紫外—可见分光光度法的特点（1）灵敏度较高：灵敏度可达10-5~10-7g/mL（2）选择性较好：多组分共存溶液中，无需化学分离即可测定（3）准确度高：仪器设备较好，相对误差一般为0.5%（4）用途广泛：既可定性分析，又可定量分析 三、紫外—可见吸收光谱(一)紫外—可见吸收光谱的产生：1.分子吸收光谱物质分子内部三种运动形式：（1）电子绕原子核的运动；（2）原子在其平衡位置附近的相对振动；（3）分子本身绕其重心的转动。 分子的总能量可以认为等于这三种运动能量之和。即：分子中各种不同运动状态都具有一定的能级,具有三种不同能级：电子能级——电子绕原子核的运动；E=1~20eV振动能级——原子在其平衡位置上的振动E=0.05~1eV转动能级——分子整体绕其重心的转动。E=0.005~0.05eV 如果用△E电子，△E振动以及△E转动表示各能级差，则：由分子中的电子能级、振动能级和转动能级跃迁产生的光谱称分子吸收光谱。 2．分子吸收光谱的分类：分子内运动涉及电子能级、振动能级和转动能级三种跃迁能级，对应的波谱区范围如下：∆E电约为1~20eVλ为1240~60nm紫外、可见光区(电子)100~800nm∆E振约为0.5~1eVλ为25~1.25㎛(中)红外区(振动)2.5~50m∆E转约为10-4~0.05eVλ为1.25cm~25㎛（远）红外区(转动)50~1990m 若用一连续辐射的电磁波照射分子，将照射前后光强度的变化转变为电信号（吸光度），并记录下来，然后以波长λ为横坐标，以吸光度A为纵坐标，就可以得到光强度变化对波长的关系曲线图——分子吸收光谱图。 吸收曲线与最大吸收波长max①同一种物质对不同波长光的吸光度不同。如KMnO4在400nm吸收少，在525nm吸收最大，吸光度最大处对应的波长称为最大吸收波长λmax②不同浓度的同一种物质，其吸收曲线形状相似,λmax不变。而对于不同物质，它们的吸收曲线形状和λmax则不同。③吸收曲线可以提供物质的结构信息，并作为物质定性分析的依据之一。 3．紫外-可见吸收光谱的产生由于分子吸收紫外-可见光区的电磁辐射，分子中电子能级的跃迁而产生。（吸收能量=两个跃迁能级之差） 第一节紫外-可见分光光度法的基本原理和概念一、电子跃迁类型紫外—可见吸收光谱是分子中的价电子在不同的分子轨道之间跃迁而产生的。价电子：σ电子→饱和的σ键π电子→不饱和的π键n电子→孤对电子(非成键的)COHnpsH 轨道:电子围绕分子或原子运动的几率分布。轨道不同,电子所具有的能量也不同。分子轨道:σ成键轨道和σ*反键轨道π成键轨道和π*反键轨道n非键轨道sp*s*RKE,BnpE 成键轨道—反键轨道,非键轨道。它们的能级高低为：σ<π200nm的光)，但是当它们与生色团相连时，就会发生n—π共轭作用，从而使电子跃迁的能量下降,增强生色团的生色能力,会使生色团的吸收峰向长波方向移动，并且增加其吸光度。 如苯环的一个氢原子被一些基团取代后，苯环在254nm处的吸收带的最大吸收位置和强度就会改变。化合物取代基苯254300氯苯264320溴苯262325苯酚2731780苯甲醚2722240 由于化合物的结构改变,如发生共轭作用、引入助色团,以及溶剂改变等,使最大吸收波长λmax和吸收强度发生变化:7.红移和蓝移λmax向长波方向移动称为红移，向短波方向移动称为蓝移(紫移)。 1）共轭体系的存在----红移如CH2=CH2的-*跃迁，max=165~200nm；而1,3-丁二烯，max=217nm2)引入助色团：红移如:取代基为含孤对电子-OH、-OR、-NH2、-Cl、-Br的助色团。 3)溶剂效应。溶剂的极性不同也会引起某些化合物的吸收带红移或蓝移，这种作用称为溶剂效应。n→π*跃迁发生在含有杂原子的不饱和化合物中，吸收峰随溶剂极性增加而向短波方向移动，即产生蓝移。 正己烷CHCl3CH3OHH2Oπ→π*λmax/nm230238237243n→π*λmax/nm329315309305亚异丙酮的溶剂效应π→π*跃迁可以发生在任何具有不饱和键的有机化合物分子中，吸收峰随溶剂极性增加向长波方向移动，即产生红移。 8.增色效应和减色效应由于化合物的结构改变或其它效应,使吸收强度增加的效应称为增色效应；使吸收强度减弱的效应称为减色效应。9.强带和弱带：摩尔吸光系数εmax>104→强带εmin<102→弱带 三、吸收带及其分子结构的关系(一)吸收带吸收带(absorptionband):在紫外光谱中，吸收峰在光谱中的波带位置。根据电子及分子轨道的种类，可将吸收带分为四种类型。1.R吸收带2.K吸收带3.B吸收带4.E吸收带 1.R带从德文Radikal(基团)得名为n→π*跃迁引起的吸收带。如羰基－CO－,－NO2、－CHO等，其特点为吸收强度弱，ε＜100，吸收峰波长一般在270nm以上；2.K带从德文Konjugation(共轭作用)得名为π→π*跃迁引起的，如共轭双键。该吸收带的特点为吸收峰很强，ε＞104，最大吸收峰位置一般在217～280nm。共轭双键增加，λmax向长波方向移动，εmax也随之增加； 例：λmax1-己烯1771041.5-己二烯1782×1041.3-己二烯2172.1×1041.3.5-己三烯2584.3×104K吸收带是共轭分子的特征吸收带，可用于判断共轭结构 3.B带从德文Benzenoid(苯的)得名为芳香化合物(包括杂环芳香化合物)的特征吸收带。这是由于π→π*跃迁和苯环的振动重叠引起的。 苯蒸气在230～270nm处出现精细结构的吸收光谱，称为苯的多重吸收带或精细结构吸收带。B吸收带的精细结构常用来辨认芳香族化合物。在极性溶剂中或苯环上有取代基时，复杂的B吸收带简化，精细结构消失，出现一宽峰，中心在256nm，ε＝220。 是由苯环结构中三个乙烯的环状共轭系统的跃迁所产生的。分为E1和E2吸收带，其中E1在185nm附近，ε=47000，E2在204nm，ε=7900，均为强吸收。4.E带图苯在乙醇中的紫外吸收光谱 小结：R带n→π*弱吸收K带π→π*强吸收共轭B带π→π*中吸收E带π→π*强吸收例:在一些含有>C=O、—N=N等基团的分子中,由n—π*跃迁产生的吸收带称为()A.K吸收带B.E吸收带C.B吸收带D.R吸收带苯环 (三)各种常见有机化合物紫外吸收光谱1.饱和烃及其取代衍生物饱和烃类：分子中只含有键，因此只能产生*跃迁，最大吸收峰一般小于150nm，已超出紫外可见分光光度计的测量范围。饱和烃的取代衍生物：如卤代烃，其卤素原子上存在n电子，可产生n*的跃迁。n*的能量低于*。其相应的吸收波长小于200nm。直接用烷烃和卤代烃的紫外吸收光谱分析这些化合物的实用价值不大。但是它们是测定紫外吸收光谱的良好溶剂。例：己烷、氯仿。 2.不饱和烃及共轭烯烃(A)非共轭不饱和烯烃除含有键外，还含有键，它们可以产生*和*两种跃迁。*跃迁的能量小于*跃迁。例如，在乙烯分子中，*跃迁最大吸收波长为180nm左右。C=C生色基团，但→*200nm。max=177nm （B）共轭烯烃*在不饱和烃类分子中，当有两个以上的双键共轭时，随着共轭系统的延长，*跃迁的吸收带将明显向长波方向移动，吸收强度也随之增强。共轭双键愈多，红移愈显著，甚至产生颜色。在共轭体系中，*跃迁产生的吸收带又称为K带。 3.羰基化合物Y=H,R→*150-160nm（K）n→*275-295nm（R）C=O基团可产生n*、n*、*三个吸收带，n*吸收带又称R带，落于近紫外或紫外光区，R带吸收较弱（εmax<100） 4.苯及其衍生物苯有三个吸收带，是由→*与苯环振动能级跃迁叠加引起；也称精细结构吸收带E1带：180nm（MAX=60，000）；E2带：204nm（MAX=8，000）；B带：255nm（MAX=200）。当苯环上有取代基时，苯的三个特征谱带都会发生显著的变化，其中影响较大的是E2带和B谱带，B带简化，E2红移。 取代基不同，变化程度不同，可由此鉴定各种取代基例：λmaxB带λmaxE2苯254204甲苯262208苯酚271213苯甲酸272230 四、影响吸收带的主要因素溶剂效应：溶剂除了影响吸收峰位置外,还影响吸收强度及光谱形状,所以一般应注明所用溶剂。由n-*跃迁产生的吸收峰，随溶剂极性增加，发生蓝移；由-*跃迁产生的吸收峰，随溶剂极性增加，发生红移。 ——溶剂极性C=O的溶剂效应n→*跃迁：蓝移；；→*跃迁：红移；；吸收带max(正己烷)max(氯仿)max(甲醇)max(水)*230238237243n*329315309305 非极性极性nnpnp非极性极性n→*→*在n→*跃迁中,基态的极性大,n电子与极性溶剂之间形成较强的氢键,使基态能量降低大于反键轨道与极性溶剂相互作用所降低的能量,因而跃迁所需能量变大,故蓝移;→*跃迁中,激发态的极性大,因而激发态与极性溶剂之间相互作用所降低能量降低大于基态与极性溶剂相互作用所降低的能量,因而跃迁所需能量变小,红移。 溶剂的选择由于溶剂对电子光谱图影响很大，因此，在吸收光谱图上或数据表中必须注明所用的溶剂。与已知化合物紫外光谱作对照时也应注明所用的溶剂是否相同。在进行紫外光谱法分析时，必须正确选择溶剂。选择溶剂时注意下列几点：（1）溶剂应能很好地溶解被测试样，所成溶液应具有良好的化学和光学稳定性。（2）在溶解度允许的范围内，尽量选择极性较小的溶剂。（3）溶剂在样品的吸收光谱区应无明显吸收。 五、朗伯－比耳定律朗伯(Lambert)和比耳(beer)分别于1760年和1852年研究了光的吸收与有色溶液液层的厚度及溶液浓度的定量关系，奠定了分光光度分析法的理论基础。(一)光的选择性吸收与物质颜色的关系：(二)郎伯—比尔定律：(三)偏离比尔定律的因素 (一)光的选择性吸收与物质颜色的关系：1．可见光的颜色和互补色：在可见光范围内，不同波长的光的颜色是不同的。平常所见的白光是一种复合光，它是由各种颜色的光按一定比例混合而得的。利用棱镜等分光器可将它分解成红、橙、黄、绿、青、蓝、紫等不同颜色的单色光。白光除了可由所有波长的可见光复合得到外，还可由适当的两种颜色的光按一定比例复合得到。能复合成白光的两种颜色的光叫互补色光。 单色光:单一波长的光。复合光:由不同波长的光组合而成的光。光的互补:若两种不同颜色的单色光按一定的强度比例混合得到白光，那么就称这两种单色光为互补色光，这种现象称为光的互补。单色光、复合光、光的互补 2、物质的颜色与吸收光的关系：当白光照射到物质上时，如果物质对白光中某种颜色的光产生了选择性的吸收，则物质就会显示出一定的颜色。物质所显示的颜色是吸收光的互补色。/nm颜色互补光400-450紫黄绿450-480蓝黄480-490绿蓝橙490-500蓝绿红500-560绿红紫560-580黄绿紫580-610黄蓝610-650橙绿蓝650-760红蓝绿 白光绿黄　　　　青橙色　　　　　　青蓝红　　　　　蓝紫例如，当一束白光（复合光）通过硫酸铜溶液时，水合铜离子中的电子发生跃迁，选择性的吸收复合光中的黄光，其他颜色的光不被吸收而透过溶液，故溶液呈现出黄色的互补色——蓝色。我们通常见到的有色物质，都是由于他们吸收了可见光的部分光，呈现出吸收光颜色的互补色。 (二)朗伯-比尔定律设入射光强度为I0，吸收光强度为Ia,透射光强度为It，则I0=Ia+It1、吸光度和透光率入射光I0透射光It 吸光度:为透光率倒数的对数，用A表示，即A=lg1/T=lgI0/It透光率：透光率为透过光的强度It与入射光强度I0之比，用T表示：即T=It/I0T取值为0.0%~100.0%全部吸收T=0.0%全部透射T=100.0% A=K·b·c定义：当一束单色光通过含有吸光物质的溶液后，溶液的吸光度A与吸光物质的浓度c及吸收层厚度成正比式中比例常数κ与吸光物质的本性，入射光波长及温度等因素有关。c为吸光物质浓度，b为透光液层厚度。朗伯-比尔定律是紫外-可见分光光度法的理论基础。2.朗伯-----比耳定律 (1)成立条件：1)样品溶液因素：上式仅在稀溶液成立；2)仪器因素：上式仅适用于单色光。(2)吸光系数1)定义：吸光物质在一定λ下单位浓度及单位厚度时的吸光度。意义：衡量显色反应灵敏度物理量，衡量物质对光吸收能力的量。 2)影响因素：物质本性、溶剂、入射光波长①不同物质的特征常数。②同一物质，不同溶剂中吸光系数不同；③λ不同，吸光系数不同；④入射光为单色光才适用光的吸收定律。 ①吸光系数当b以cm，c以g/L为单位，κ称为吸光系数，用a表示。A=acba的单位为L/(g.cm)3)种类：吸光系数a（浓度为g/L）摩尔吸光系数ε（浓度为mol/L）比吸光系数E1%1cm（浓度为g/100mL）它表示物质的浓度为1g/L，液层厚度为1cm时，溶液的吸光度。 当b以cm，c以mol/L为单位，κ称为摩尔吸光系数，用ε表示。A=εcbε的单位为L/mol.cm，它表示物质的浓度为1mol/L，液层厚度为1cm时，溶液的吸光度。②摩尔吸光系数③比吸光系数(或百分吸光系数)比吸光系数是指百分含量为1%，b为1cm时的吸光度值，用表示。表示物质的浓度为1g/100mL，液层厚度为1cm时，溶液的吸光度。 小结:吸光系数的几种表示方法C---mol/Lε---摩尔吸光系数L·mol–1·cm-1C--g/La---吸光系数L·g–1·cm-1C--g/100mLE1%1cm---比吸光系数100mL·g–1·cm-1、E1%1cm之间的相互换算： 例:氯霉素(M为323.15)的水溶液在278nm处有吸收峰,设用氯霉素纯品配制100mL含有2.00mg的溶液,以1.00cm厚的吸收池在278nm处测得的透光率为24.3%,则求其和值。=-lgT/bc=-lg24.3%/0.002=0.614/0.002=307=0.1M=0.1×323.15×307=9920 摩尔吸光系数吸光物质的特征常数ε(λ)；在最大吸收波长λmax处，常以εmax表示。εmax越大表明该物质的吸光能力越强，测定的灵敏度越高。ε＞104，为强吸收，是灵敏的。 (3)吸光度A的加和性若溶液中含有不止一种吸光物质，则总吸光度等于各个组分吸光度之和：A=A1+A2+..........+An 例:1.朗伯-比尔定律的积分表达式为lgI0/It=εbc，在利用光度计进行实际测定中，I0是指入射光强度，It是指透过光强度。2.用紫外-可见分光光度法测定某化合物的含量，当其浓度为Cmol/L时，透光率为T，当其浓度由C变为0.5Cmol/L时，在同样测定条件下，其透光率应为（C）A.T3/2B.T2C.T1/2D.T1/33.在某波长处，用2.0cm的比色皿，测得某试液的透光度为60%，若改用1.0cm的比色皿，则原试液的透光度应为（D）A.0.11B.0.22C.0.66D.0.77 (三)、偏离朗伯-比耳定律的因素Lambert–Beer定律的前提条件之一是入射光为单色光。但实际上难以获得真正意义上的纯单色光。分光光度计只能获得近乎单色的狭窄光普通带。复合光可导致对朗伯-比耳定律的正或负偏离。1.00.50AC正偏离负偏离 1.光学因素(1)非单色光引起的对吸光定律的偏离对吸收光谱而言，b和c固定，随波长变化的情况，单一波长，固定；不同波长，不同。因此，非单色光将导致对吸光定律的偏离。 （2）杂散光是指从单色器分出的光不在入射光谱带宽度范围内，与所选波长相距较远。杂散光来源：仪器本身缺陷；光学元件污染造成。 2.溶液本身的化学和物理因素引起的偏离(1)溶液介质不均匀引起的实际样品的混浊，蒸馏水中的微生物，存在散射以及共振发射等，均可引起吸光质点的吸光特性变化。会引起对朗伯-比耳定律的偏离。(２)浓度的限制　　稀溶液所有的吸光质点之间不发生相互作用；假定只有在稀溶液(C<10-2mol/L)时才基本符合。当溶液浓度C>10-2mol/L时，吸光质点间可能发生缔合等相互作用，直接影响了对光的吸收。 (３)化学偏离恒定的化学环境铬酸盐或重铬酸盐溶液中存在下列平衡：CrＯ42-＋2H＋=Cr2Ｏ72-＋H2Ｏ黄色橙色λmax=375nmλ1max=350nmCrＯ42-、Cr2Ｏ72-的吸光性质不同，即ε(λ)不同。此时溶液pH对测定有重要影响。 第三节紫外-可见分光光度计 光电比色法一、主要部件的性能与作用基本结构:0.575光源单色器吸收池检测器显示光源→单色器→吸收池→检测器→信号显示系统↑样品 1．光源：2．单色器：包括狭缝、准直镜、色散元件棱镜——对不同波长的光折射率不同色散元件光栅——利用衍射和干涉钨灯或卤钨灯——可见光源350~1000nm氢灯或氘灯——紫外光源200~360nm 3．吸收池：玻璃——能吸收UV光，仅适用于可见光区石英——不能吸收紫外光，适用于紫外和可见光区要求：匹配性（对光的吸收和反射应一致）4．检测器：检测器的功能是检测信号、测量单色光透过溶液后光强度变化的一种装置光电池光电管光电倍增管二极管阵列检测器光电倍增管:是检测微弱光最常用的光电元件，它的灵敏度比一般的光电管要高200倍，因此可使用较窄的单色器狭缝，从而对光谱的精细结构有较好的分辨能力。 5．记录装置：讯号处理和显示系统它的作用是放大信号并以适当方式指示或记录下来。常用的信号指示装置有直读检流计、电位调节指零装置以及数字显示或自动记录装置等。很多型号的分光光度计装配有微处理机，一方面可对分光光度计进行操作控制，另一方面可进行数据处理。 二、紫外-可见分光光度计的类型按其光学系统可分为单波长分光光度计和双波长分光光度计。1.单波长单光束分光光度计目前国内广泛采用721型分光光度计。具有结构简单、价格低廉、操作方便、维修也比较容易，适用于常规分析。 单波长单光束分光光度计0.575光源单色器吸收池检测器显示 2.单波长双光束分光光度计：国产710型、日立UV-340型等。双光束方法因光束几乎同时通过样品池和参比池，因此可消除光源不稳产生的误差-----提高测量的精确度。 单波长双光束分光光度计比值光源单色器吸收池检测器显示光束分裂器 经单色器分光后经反射镜分解为强度相等的两束光，一束通过参比池，一束通过样品池。光度计能自动比较两束光的强度，此比值即为试样的透光率，经对数变换将它转换成吸光度并作为波长的函数记录下来。双光束分光光度计一般都能自动记录吸收光谱曲线。由于两束光同时分别通过参比池和样品池，还能自动消除光源强度变化所引起的误差。 3.双波长分光光度计：国产WFZ800-5型、岛津UV-260型优点：是可以在有背景干扰或共存组分吸收干忧的情况下对某组分进行定量测定。特点：是利用吸光度差值定量消除干扰和吸收池不匹配引起的误差 3．双波长分光光度计由同一光源发出的光被分成两束，分别经过两个单色器，得到两束不同波长（1和2）的单色光，利用切光器使两束光以一定的频率交替照射同一吸收池 1为选好的测定波长，一般为待测物质的max2为选好的参比波长，一般为待测物质的min测得的是样品在两种波长1和2处的吸光度之差A，A为扣除了背景吸收的吸光度A=A1-A2=（K1-K2）CL优点：（1）大大提高了测定准确度，可完全扣除背景（2）可用于微量组分的测定（3）可用于混浊液和多组分混合物的定量测定 一、纯度检查二、定性分析三、定量分析四、有机物结构辅助推断五、比色法第四节紫外吸收光谱的应用单组分的定量方法多组分的定量方法 一、纯度检查如果一化合物在紫外区没有吸收峰，而其中的杂质有较强吸收，就可方便地检出该化合物中的痕量杂质。例如：要检定甲醇或乙醇中的杂质苯，可利用苯在254nm处的B吸收带，而甲醇或乙醇在此波长处几乎没有吸收。 二、定性分析max,max：化合物特性参数，可作为定性依据；有机化合物紫外吸收光谱：反映结构中生色团和助色团的特性，不完全反映整个分子特性；结构确定的辅助工具；（一）制作试样的吸收曲线并与标准紫外光谱对照；max，max都相同，可能是一个化合物；标准谱图库：46000种化合物紫外光谱的标准谱图«Thesadtlerstandardspectra,Ultraviolet»与标准吸收光谱谱图的比较时注意：相同化学环境与测量条件 三、定量分析（一）单组分的定量方法依据：朗伯-比耳定律当入射光波长一定时，待测溶液的吸光度A与其浓度（c）和液层厚度（b）成正比，即吸光度：A=bc1．吸光系数法2．对照法3．标准曲线法（为摩尔吸光系数） 1.吸光系数法根据A=K·b·c,若b和k已知,即可根据测得的A求出被测物的浓度。c=A/kck(或)可以从手册或文献中查到,这种方法称绝对法。例:维生素B12的水溶液在361nm处的值是207,盛于1cm吸收池中,测得溶液的吸光度为0.414,则溶液浓度为:C=A/(b)=0.414/(207×1)=0.0020g/100mL 2.对照法：在一定条件下，配制标准溶液和样品溶液，在λmax下测A标准溶液As=κbCs被测溶液Ax=κbCxCx=CsAx/As注意：Cs与Cx大致相当 3.标准曲线法12345样品标液C1C2C3C4C5CXAA1A2A3A4A5AXAλCXAX 例如：芦丁含量测定标准曲线法 0.710mg/25mL芦丁含量测定 （二）多组分的定量方法测量依据——吸光度的加和性：(一)两组分吸收光谱不重叠（互不干扰）在处测定组分a,在处测组分b,如: (二)两组分吸收光谱部分重叠：测A1→b组分不干扰→可按单组分定量测 (三)两组分吸收光谱完全重叠——混合样品测定1.解线性方程组法过程： 例:紫外-可见光分光度法可用于混合物的分析,其定量依据是:吸光度的加和性如图设a、b的浓度分别为ca和cb，在入射光波长为2时的摩尔吸收系数分别为2(a)和2(b)，则在使用2.0cm的比色皿时，在2测得的总吸光度为:22aca+22bcb 四、有机化合物结构辅助推断1.可获得的结构信息（1）在210～250nm波长范围内有强吸收峰，则可能含有2个共轭双键；若在260～350nm波长范围内有强吸收峰，则说明该有机物含有3个或3个以上共轭双键。（2）若在2５0～300nm波长范围内有中等强度的吸收峰则可能含苯环，假设有精细结构的话，可能是苯环的特征吸收。了解共轭程度，对不饱和化合物的异构体进行判别 （3）若在270～350nm波长范围内有低强度吸收峰,（n→π*跃迁），则可能含有羰基。（4）若在200～750nm波长范围内无吸收峰，则可能是直链烷烃、环烷烃或仅含一个双键的烯烃等。 五比色法(一)显色反应及反应条件的选择1.显色反应：待测组分转变成有颜色（能吸收）的化合物。常用的显色反应：配位反应、氧化还原反应。 2.显色反应的要求：(1)选择性好，干扰小(2)灵敏度高，ε大(3)有色化合物组成恒定(4)有色化合物性质稳定(5)有色化合物与显色剂之间的颜色差较大 3．显色反应条件的选择（1）显色剂用量：过量，改变产物组成；过少，色淡，降低A。 （2）酸度：①对显色剂颜色有影响，②对显色反应的影响，③对待测组分存在状态的影响。显色剂弱酸，参与配位反应④选最佳酸度：选A-pH曲线平坦值部分对应的pH。 （3）显色温度：绘制A-T（℃）曲线。（4）显色时间：作A-t（min）曲线（5）干扰离子：消除干扰方法：①加入配位掩蔽剂。②加入氧化剂和还原剂。③选择适宜的显色条件。④分离干扰离子。 (二)参比溶液的选择参比溶液是用于调节仪器工作零点的，若选择不适当，对测量读数的影响较大。1.溶剂空白当试液、试剂、显色剂均无色时，用蒸馏水作参比溶液；2.试剂空白如果显色剂或其他试剂略有色，可用不含待测组分的试剂溶液作参比溶液。 3.试样空白如果试样中有色，显色剂无色时，可用试样溶液作参比溶液；如果试样中有色,显色剂也略有色时，可在试液中加入适当掩蔽剂，将待测组分掩蔽后，再加入显色剂，以此溶液作参比溶液。 在特种钢工业生产中,铬基合金钢中微量镁的测定常用铬黑T(EBT)显色的方法,EBT本身为蓝色,与Mg2+配合后化合物显红色,在制作工作曲线测定微量Mg时,应选用的参比溶液是_______________________。含EBT的溶液（试剂空白）'