第十章 紫外分光光度法

'第十章紫外-可见分光光度法第一节光学分析概论一、电磁辐射和电磁波谱1．电磁辐射（电磁波，光）：以巨大速度通过空间、不需要任何物质作为传播媒介的一种能量2．电磁辐射的性质：具有波、粒二向性Ø波动性：Ø粒子性：3．电磁波谱：电磁辐射按波长顺序排列，称~。γ射线→X射线→紫外光→可见光→红外光→微波→无线电波高能辐射区γ射线能量最高，来源于核能级跃迁波长χ射线来自内层电子能级的跃迁光学光谱区紫外光来自原子和分子外层电子能级的跃迁可见光红外光来自分子振动和转动能级的跃迁波谱区微波来自分子转动能级及电子自旋能级跃迁无线电波来自原子核自旋能级的跃迁长二、光学分析法及其分类（一）光学分析法依据物质发射的电磁辐射或物质与电磁辐射相互作用而建立起来的各种分析法的统称~。（二）分类：1．光谱法：利用物质与电磁辐射作用时，物质内部发生量子化能级跃迁而产生的吸收、发射或散射辐射等电磁辐射的强度随波长变化的定性、定量分析方法Ø按能量交换方向分吸收光谱法发射光谱法Ø按作用结果不同分原子光谱→线状光谱分子光谱→带状光谱2．非光谱法：利用物质与电磁辐射的相互作用测定电磁辐射的反射、折射、干涉、衍射和偏振等基本性质变化的分析方法分类：折射法、旋光法、比浊法、χ射线衍射法3．光谱法与非光谱法的区别：Ø光谱法：内部能级发生变化原子吸收/发射光谱法：原子外层电子能级跃迁分子吸收/发射光谱法：分子外层电子能级跃迁Ø非光谱法：内部能级不发生变化仅测定电磁辐射性质改变（三）发射光谱ü例：γ-射线；x-射线；荧光 （四）吸收光谱ü例：原子吸收光谱，分子吸收光谱三、光谱法仪器——分光光度计Ø主要特点：五个单元组成光源---单色器---样品池---检测器---记录装置第二节紫外-可见吸收光谱一、紫外-可见吸收光谱的产生1．分子吸收光谱的产生——由能级间的跃迁引起ü能级：电子能级、振动能级、转动能级ü跃迁：电子受激发，从低能级转移到高能级的过程若用一连续的电磁辐射照射样品分子，将照射前后的光强度变化转变为电信号并记录下来，就可得到光强度变化对波长的关系曲线，即为分子吸收光谱2．分子吸收光谱的分类：分子内运动涉及三种跃迁能级，所需能量大小顺序3．紫外-可见吸收光谱的产生由于分子吸收紫外-可见光区的电磁辐射，分子中价电子（或外层电子）的能级跃迁而产生（吸收能量=两个跃迁能级之差）二、紫外-可见吸收光谱的电子跃迁类型Ø预备知识：ü价电子：σ电子→饱和的σ键π电子不饱和的π键n电子ü轨道：电子围绕原子或分子运动的几率轨道不同，电子所具有能量不同ü基态与激发态：电子吸收能量，由基态→激发态cü成键轨道与反键轨道：σ<πn→σ*>π→π*>n→π*注：ü紫外光谱电子跃迁类型：n—π*跃迁π—π*跃迁ü饱和化合物无紫外吸收ü电子跃迁类型与分子结构及存在基团有密切联系•根据分子结构→推测可能产生的电子跃迁类型；•根据吸收谱带波长和电子跃迁类型→推测分子中可能存在的基团（分子结构鉴定）三、相关的基本概念1．吸收光谱（吸收曲线）：不同波长光对样品作用不同，吸收强度不同以λ~A作图next2．吸收光谱特征：定性依据吸收峰→λmax吸收谷→λmin肩峰→λsh末端吸收→饱和σ-σ跃迁产生3．生色团（发色团）：能吸收紫外-可见光的基团Ø有机化合物：具有不饱和键和未成对电子的基团具n电子和π电子的基团产生n→π*跃迁和π→π*跃迁跃迁E较低ü例：C＝C；C＝O；C＝N；—N＝N—注：当出现几个发色团共轭，则几个发色团所产生的吸收带将消失，代之出现新的共轭吸收带，其波长将比单个发色团的吸收波长长，强度也增强4．助色团：本身无紫外吸收，但可以使生色团吸收峰加强同时使吸收峰长移的基团Ø有机物：连有杂原子的饱和基团ü例：—OH，—OR，—NH—，—NR2—，—X 5．红移和蓝移：由于化合物结构变化（共轭、引入助色团取代基）或采用不同溶剂后吸收峰位置向长波方向的移动，叫红移（长移）。吸收峰位置向短波方向移动，叫蓝移（紫移，短移）。6．增色效应和减色效应增色效应：吸收强度增强的效应减色效应：吸收强度减小的效应7．强带和弱带：εmax>105→强带εmin<103→弱带四、吸收带类型和影响因素1．R带：由含杂原子的不饱和基团的n→π*跃迁产生üC＝O；C＝N；—N＝N—•E小，λmax250~400nm，εmax<100•溶剂极性↑，λmax↓→蓝移（短移）2．K带：由共轭双键的π→π*跃迁产生ü(—CH＝CH—)n，—CH＝C—CO—•λmax>200nm，εmax>104•共轭体系增长，λmax↑→红移，εmax↑•溶剂极性↑，对于—(—CH＝CH—)n—λmax不变对于—CH＝C—CO—λmax↑→红移3．B带：由π→π*跃迁产生ü芳香族化合物的主要特征吸收带•λmax=254nm，宽带，具有精细结构；•εmax=200•极性溶剂中，或苯环连有取代基，其精细结构消失4．E带：由苯环环形共轭系统的π→π*跃迁产生ü芳香族化合物的特征吸收带•E1180nmεmax>104（常观察不到）•E2200nmεmax=7000强吸收•苯环有发色团取代且与苯环共轭时，E2带与K带合并一起红移（长移）Ø影响吸收带位置的因素：a．溶剂效应：对λmax影响：nextn-π*跃迁：溶剂极性↑，λmax↓蓝移π-π*跃迁：溶剂极性↑，λmax↑红移对吸收光谱精细结构影响next溶剂极性↑，苯环精细结构消失溶剂的选择——极性；纯度高；截止波长<λmaxb．pH值的影响：影响物质存在型体，影响吸收波长第三节基本原理 一、Lamber-Beer定律：吸收光谱法基本定律Ø描述物质对单色光吸收强弱与液层厚度和待测物浓度的关系假设一束平行单色光通过一个吸光物体n取物体中一极薄层Ø讨论：1．Lamber-Beer定律的适用条件（前提）Ø入射光为单色光Ø溶液是稀溶液2．该定律适用于固体、液体和气体样品3．在同一波长下，各组分吸光度具有加和性ü应用：多组分测定二、吸光系数和吸收光谱1．吸光系数的物理意义： 单位浓度、单位厚度的吸光度Ø讨论：1）E=f（组分性质，温度，溶剂，λ）当组分性质、温度和溶剂一定，E=f（λ）2）不同物质在同一波长下E可能不同（选择性吸收）同一物质在不同波长下E一定不同3）E↑，物质对光吸收能力↑,定量测定灵敏度↑→定性、定量依据2．吸光系数两种表示法：1）摩尔吸光系数ε：在一定λ下，C=1mol/L，L=1cm时的吸光度2）百分含量吸光系数/比吸光系数：在一定λ下，C=1g/100ml，L=1cm时的吸光度3）两者关系3．吸收光谱（吸收曲线）：λ~A最大吸收最小吸收特征值→定性依据肩峰末端吸收4．吸光度测量的条件选择：1）测量波长的选择：2）吸光度读数范围的选择：选A=0.2~0.73）参比溶液(空白溶液)的选择：ü注：采用空白对比消除因溶剂和容器的吸收、光的散射和界面反射等因素对透光率的干扰三、偏离Beer定律的因素n依据Beer定律，A与C关系应为经过原点的直线n偏离Beer定律的主要因素表现为以下两个方面:（一）光学因素1．非单色光的影响：üBeer定律应用的重要前提——入射光为单色光n照射物质的光经单色器分光后并非真正单色光n其波长宽度由入射狭缝的宽度为了保证透过光对检测器的响应，必须保证一定的狭缝宽度 n这就使分离出来的光具一定的谱带宽度Ø讨论：入射光的谱带宽度严重影响吸光系数和吸收光谱形状Ø结论：•选择较纯单色光（Δλ↓，单色性↑）•选λmax作为测定波长（ΔE↓，S↑且成线性）2．杂散光的影响：Ø杂散光是指从单色器分出的光不在入射光谱带宽度范围内，与所选波长相距较远Ø杂散光来源：仪器本身缺陷；光学元件污染造成Ø杂散光可使吸收光谱变形，吸光度变值3．反射光和散色光的影响：Ø反射光和散色光均是入射光谱带宽度内的光直接对T产生影响Ø散射和反射使T↓，A↑，吸收光谱变形注：一般可用空白对比校正消除4．非平行光的影响：Ø使光程↑，A↑，吸收光谱变形（二）化学因素nBeer定律适用的另一个前提：稀溶液n浓度过高会使C与A关系偏离定律四、透光率的测量误差——ΔT ü影响测定结果的相对误差两个因素：T和ΔTΔT影响因素：仪器噪音[1）暗噪音2）讯号噪音]1）暗噪音——与检测器和放大电路不确切性有关,与光讯号无关2）讯号噪音——与光讯号有关表明测量误差较小的范围一直可延至较高吸光度区，对测定有利第四节紫外分光光度计1．光源：钨灯或卤钨灯——可见光源350~1000nm氢灯或氘灯——紫外光源200~360nm2．单色器：包括狭缝、准直镜、色散元件棱镜——对不同波长的光折射率不同色散元件分出光波长不等距光栅——衍射和干涉分出光波长等距3．吸收池：玻璃——能吸收UV光，仅适用于可见光区石英——不能吸收紫外光，适用于紫外和可见光区ü要求：匹配性（对光的吸收和反射应一致）4．检测器：将光信号转变为电信号的装置光电池光电管光电倍增管二极管阵列检测器5．记录装置：讯号处理和显示系统类型：1．单光束分光光度计：ü特点：•使用时来回拉动吸收池→移动误差 •对光源要求高•比色池配对2．双光束分光光度计：ü特点：•不用拉动吸收池，可以减小移动误差•对光源要求不高•可以自动扫描吸收光谱3．双波长分光光度计ü特点：•利用吸光度差值定量•消除干扰和吸收池不匹配引起的误差第五节定性和定量分析一、定性分析（一）定性鉴别定性鉴别的依据→吸收光谱的特征吸收光谱的形状吸收峰的数目吸收峰的位置（波长）吸收峰的强度相应的吸光系数1．对比吸收光谱的一致性同一测定条件下，与标准对照物谱图或标准谱图进行对照比较2．对比吸收光谱的特征值3．对比吸光度或吸光系数的比值：ü例：（二）纯度检查和杂质限量测定1．纯度检查（杂质检查）1）峰位不重叠：找λ→使主成分无吸收，杂质有吸收→直接考察杂质含量2）峰位重叠：主成分强吸收，杂质无吸收/弱吸收→与纯品比较，E↓杂质强吸收>>主成分吸收→与纯品比较，E↑，光谱变形2．杂质限量的测定：ü例：肾上腺素中微量杂质——肾上腺酮含量计算2mg/mL-0.05mol/L的HCL溶液，λ310nm下测定规定A310≤0.05即符合要求的杂质限量≤0.06% 二、定量分析（一）单组分的定量方法1．吸光系数法（绝对法）ü例：维生素B12的水溶液在361nm处的百分吸光系数为207，用1cm比色池测得某维生素B12溶液的吸光度是0.414，求该溶液的浓度（见书P201例1）ü解：ü例：精密称取B12样品25.0mg，用水溶液配成100ml。精密吸取10.00ml，又置100ml容量瓶中，加水至刻度。取此溶液在1cm的吸收池中，于361nm处测定吸光度为0.507，求B12的百分含量？（见书P61例2）ü解：ü例：Ø解： 2．标准曲线法3．对照法：外标一点法ü注：当样品溶液与标准品溶液的稀释倍数相同时ü例：维生素B12的含量测定精密吸取B12注射液2.50mL，加水稀释至10.00mL；另配制对照液，精密称定对照品25.00mg，加水稀释至1000mL。在361nm处，用1cm吸收池，分别测定吸光度为0.508和0.518，求B12注射液注射液的浓度以及标示量的百分含量（该B12注射液的标示量为100μg/mL）见书P203例题Ø解：1）对照法2）吸光系数法（二）多组分的定量方法 Ø三种情况：1．两组分吸收光谱不重叠（互不干扰）两组分在各自λmax下不重叠→分别按单组分定量2．两组分吸收光谱部分重叠λ1→测A1→b组分不干扰→可按单组分定量测Caλ2→测A2→a组分干扰→不能按单组分定量测Ca3．两组分吸收光谱完全重叠——混合样品测定1)．解线性方程组法n步骤：2)．等吸收双波长法n步骤： Ø消除a的影响测bØ消去b的影响测aü注：须满足两个基本条件•选定的两个波长下干扰组分具有等吸收点•选定的两个波长下待测物的吸光度差值应足够大3)．系数倍率法ü前提：干扰组分b不成峰形无等吸收点ü步骤：b曲线上任找一点→λ1另一点→λ2ü优点：同时将待测组分和干扰组分放大信号K倍，提高了待测组分测定灵敏度练习：1．取咖啡酸，在165℃干燥至恒重，精密称取10.00mg，加少量乙醇溶解，转移至200mL 容量瓶中，加水至刻度线，取此溶液5.00mL，置于50mL容量瓶中，加6mol/L的HCL4mL，加水至刻度线。取此溶液于1cm比色池中，在323nm处测定吸光度为0.463，已知该波长处的，求咖啡酸百分含量（见书后P215题16）解：2．精密称取0.0500g样品，置于250mL容量瓶中，加入0.02mol/LHCL溶解，稀释至刻度。准确吸取2mL，稀释至100mL。以0.02mol/LHCL为空白,在263nm处用1cm吸收池测定透光率为41.7%，其摩尔吸光系数为12000，被测物分子量为100.0，试计算263nm处和样品的百分含量。（见书后P215题17）解：'