分光光度法测定富锗人参细胞中锗的含量

'中国药科大学学报172JournalofChinaPharmaceuticalUniversity1996,27(3):172～174分光光度法测定富锗人参细胞中锗的含量12陈齐戴春雷王宇新2(中国药科大学组织培养研究室,中药制剂学教研室,南京210038)摘要应用胶束增溶分光光度法测定了在含Ge-132或GeO2MS培养基上生长的富锗人参细胞中锗的含量,结果表明锗的含量远高于栽培人参。所建方法的线性范围为0.08～0.80μg/ml,锗的平均回收率为99.34%,RSD=1.20%(n=7)。关键词锗;胶束增溶分光光度法;人参;细胞;含量测定研究表明微量元素不仅为人体生长发MS培养基上培养的人参细胞。育所必需,而且对疾病具有特异的治疗效2方法与结果果,已日渐受到人们的重视。其中,锗(Ger-manium,Ge)对人体有着独特的保健、治疗2.1样品处理[1～4]功效,亦越来越受到关注。对于在多种将收集培养45d的人参细胞以蒸馏水材料中锗的测定方法研究已有了许多报反复冲洗,甩干(转速为2000r/min),重复[5]道,但尚未见到对含锗培养基培养的富锗多次,直至洗去细胞表面存在的锗。干细胞人参(PanaxginsengC.A.Meyer)细胞培置60℃干燥后粉碎成末,置干燥器内备用。养物中锗的测定研究的报道。本研究探讨了2.2标准液及试剂的配制用胶束增溶分光光度法(锗与苯基荧光酮-锗标准液:精密称取Ge-132标准品适溴化十六烷基三甲基铵络合)测定人参细胞量,置于小锥形瓶中,加浓HNO35ml,在培养物中锗的含量,拟建立简便而快速的测190±5℃油浴,加热消化至近干,取出,加定人参细胞培养物中锗含量的方法。H2O20.5ml再加热至近干,取出,放冷至室温,加40%NaOH液数滴,加水微热使其1仪器、试剂与材料溶解后转移至100ml容量瓶中,定容后使离心甩干机,AF-1型电热干燥箱(东台成为每1ml相当于20μg的Ge。电器厂),万能粉碎机(河北黄骅齐家务科学1%CTAB水溶液:将CTAB适量放入仪器厂),722型分光光度计(上海第三分析水中,加热溶解后,趁热过滤,备用。仪器厂)。有机锗(carboxyethylgermanium0.03%PF无水乙醇溶液:将PF适量sesquioxide,Ge-132;江苏省卫生防疫站提溶于无水乙醇及H2SO4(1∶6)溶液中,用无供);溴化十六烷基三甲胺(cetyltrimethyl-水乙醇稀释到500ml,摇匀,放置一夜,过滤ammoniumbromide,CTAB;北京医药站分后使用。[6]装);苯基荧光酮(phenylfuone,PF;上海染2.3测定条件料化工十四厂);其余试剂均为分析纯。富锗2.3.1测定波长的确定精密称取不含人参细胞为本室在含有Ge-132或GeO2的Ge的培养基培养的人参细胞粉末适量,共2收稿日期1995-10-081本校1995年本科毕业生 3期陈齐等:分光光度法测定富锗人参细胞中锗的含量173份,分置小锥形瓶中,其中1份精确加入Ge-测定条件,每隔一定时间对同一测定液进行132标准液1.0ml,另1份则精确加水1.0测定,结果表明,在同一条件下A值在1～3ml,然后分别加浓HNO35ml,按锗标准液h内稳定,故实验应控制在3h之内完成。消化方式分别处理后,过滤并各自定容至2.4标准曲线的制备100ml,摇匀,分别吸取2.0ml,分置50ml精密吸取锗标准液0.2,0.4,0.8,1.2,容量瓶中,依次分别加入H2SO4(1∶1)101.6,2.0ml分置50ml容量瓶中,按上述测ml,1.0%CTAB5ml,0.03%PF5ml,加定条件依次加入H2SO4(1∶1),1%CTAB,水稀释至刻度,摇匀,以试剂作空白,在波长0.03%PF,定容后,在540nm处测定吸收400～600nm之间扫描,其结果见图1。可见值,计算出回归方程为:A=0.8843C+Ge-PF-CTAB络合物的最大吸收峰在5350.0215,r=0.9999,线性范围在0.08～0.80nm处,而空白试剂的最大吸收峰在460nmμg/ml。处;为避免空白试剂拖尾吸收对测定的影2.5锗的回收率实验响,选择540nm为测定波长。精密称取不含Ge的培养基培养的人参细胞粉末适量,按锗标准液项下消化处理;其中7份分别依次精密加入锗标准液,另1份则不加;再按标准曲线项下步骤进行测定。测得Ge回收率如表1所示。Tab1.Recoverytestofgermanium(n=7)-Added(μg)Found(μg)Recovery(%)x(%)RSD(%)0.00--99.341.2010.119.9398.2220.2220.0198.9630.3329.6497.7340.4340.56100.3250.5449.9598.83Fig1.Visiblespectrumofcomplexcompoundandreagents60.6561.39101.22Ⅰ.reagentsⅡ.complexcompound101.09100.7499.652.3.2PF浓度对吸收值的影响在相同的Ge浓度条件下,加入2～10ml不同量的2.6样品测定0.03%PF溶液后进行测定,结果吸收值变分别精密称取含不同浓度Ge-132培养化不明显,故本实验中0.03%PF的用量定基和GeO2培养基培养的人参细胞粉末适为5ml。量,分置于小锥形瓶中,加入浓HNO35ml2.3.3酸度对吸收值的影响在反应液中于190±5℃油浴中进行消化至近干后,加入加入6～16ml不同量的H2SO4(1∶1),其余H2O20.5ml,再加热至近干,取出,冷至室条件同“2.3.1”项下进行测定,观察H2SO4温,加40%NaOH液数滴,加水溶解过滤,对吸收值的影响,结果影响不大,因此本实并定量转移至100ml容量瓶中,定容。验确定H2SO4(1∶1)的加入量为10ml。精密吸取上述溶液2.0ml,置50ml容2.3.41%CTAB用量对吸收值的影响量瓶中,按测定条件下依次加入H2SO4(1∶按“2.3.1”项下操作,只是用不同量1%1)、1%CTAB、0.03%PF无水乙醇液,加水CTAB进行测定,结果1%CTAB液加入量稀释至刻度;同上操作。测定结果见表2。含在2～8ml时吸收值稳定,故本实验选用5Ge-132和含GeO2培养基培养的人参细胞[2,7,8]ml的加入量。中的Ge含量均比已报道的栽培人参中2.3.5测定时间与吸收值的关系按上述的含量要高。 174中国药科大学学报27卷Tab2.AssayofGeincellsfromA(mediacontainingGe-同样也会使消化不完全或产生炭化;这些因132)andB(mediacontainingGeO2)(n=5)素都将影响测定结果;故消化温度选择190ContentofGe(μg/g)AB±5℃,时间为20min。560.5092.476)本实验建立的Ge-PF-CTAB胶束增715.65276.122325.35735.67溶分光光度法测定富锗人参细胞培养物中427.742030.41锗的方法具有灵敏、简便、经济、快速的特点,较其它方法(如等离子原子吸收法,化学3讨论发光淬灭法等)在仪器上要求更低、更经济。1)CTAB在较低温度下(约15℃以下)的溶解度较低,易析出结晶。此时可将参考文献CTAB在水浴上加热,溶解后应用。在加入1庞志功,汪宝琪,蔚金建.用化学发光粹灭法测定人参CTAB水溶液时必须注意沿壁加入,否则易中微量锗.药物分析杂志,1990,10(5):300引起气泡,不易于定容。2卫永第,安占元,丁长江等.涂钼石墨管无火焰原子吸2)因PF溶液是用无水乙醇作溶剂,而收法测定人参中锗的含量.中草药,1991,22(4):1633鲍长利,程信良,刘春华等.甲基异丁酮-N,N-二甲基无水乙醇极易挥发,所以应采取及时加塞和甲酰胺萃取石墨炉原子吸收法测定植物样品中微量低温贮存等方法,以免造成浓度不同从而导锗.分析化学,1992,20(4):429致误差。4郭军华,方挺,徐卓立等.石墨炉原子吸收法测定生3)因细胞中的有机锗经HNO3消化物体液中有机锗.光谱学与光谱分析,1993,13(3):57后,消化产物中有部分难溶的GeO5陈青川,杨惠芬.锗的光度分析进展.光谱实验室,2产生。而1994,11(6):25GeO2溶于碱溶液,故加入40%NaOH液溶6张德良,许洪沛.锗的胶束增溶分光光度法.分析化解后进行转移,这样效果好。学,1975,3(3):2034)CTAB和PF等试剂在配制后,应在7隋喜云,王子树.同位素稀释-火花源质谱法分析人参短期内使用,否则将会影响测定结果。样品中微量元素.分析化学,1991,19(8):9175)实验中发现,若消化温度超过8蔡君峰,赵恒,孙劲彦等.富锗人参的研制.人参研究,1994,2:33210℃,锗将会挥发;若低于170℃,细胞内的锗则消化不完全;而消化时间过短或过长,DeterminationofGermaniuminPanaxginsengCellsEnrichedGermaniumbyMicellarSolubilizingSpectrophotometry1ChenQi,DaiChunlei,WangYuxin1DivisionofTissueCulture,DepartmentofPharmaceuticsofChineseMateriaMedica,ChinaPharmaceuticalUniversity,Nanjing210038AbstractArapidandsimpledeterminationofgermaniuminPanaxginsengcellsenrichedgermaniumwasexaminedbymicellarsolubilizingspectrophotometry.CellsdeterminatedweregrownonMSmediacontain-ingGe-132orGeO2.Linearityofthemethodrangedfrom0.08～0.80μg/ml.Averagerecoveryofgermani-umwas99.34%,andRSD=1.20%(n=7).AmountofGeincellsdescribedabovewashigherthanthatcultivativePanaxginseng.KeywordsGermanium;Micellarsolubilizingspectrophotometry;Panaxginseng;Cell;Assay'