荧光分光光度法评价环肽类天然植物提取物对血管紧张素酶的抑制作用

'毕业设计（论文）题目：荧光分光光度法评价环肽类天然植物提取物对血管紧张素酶的抑制作用姓名：学号：所在学院：食品与制药工程学院专业班级：制药工程指导教师：日期： 毕业设计（论文）专用纸摘要人工合成的降血压药物如卡托普利(captopril)，西拉普利(cilazapril)，依那普利(enalapril)，赖诺普利(1isinopri)等药物的临床应用表明，抑制血管紧张素转化酶(ACE)活性能有效地降低血压，但长期使用，耐受性差，常见不良反应，限制了临床使用。中药来源于天然动植物，资源丰富，筛选能有效抑制血管紧张素转化酶(ACE)活性的中药具有重要的现实意义。目的：本实验采用荧光分光光度法，研究天然植物提取物L5、L6、LA、LB对血管紧张素酶的抑制效果，旨在为开发降血压中药提供科学依据。方法：实验采用体外模型，用96孔板代替传统的比色皿，以马尿酰一组氨酰一亮氨酸(Hippuryl-L—histidyl-L—leucine，HHL)为ACE反应底物，产物马尿酸(Hippuficacid，HA)为测定指标，卡托普利为阳性对照，通过检测加入前后物质荧光强度的差异，计算该物质对血管紧张素转化酶(ACE)的抑制率，评价L5、L6、LA、LB对血管紧张素转化酶(ACE)的抑制作用。结论：试验探究的浓度为10-3M、10-7M天然植物提取物L5、L6、LA、LB对血管紧张素转化酶(ACE)有抑制效果。关键词：血管紧张素酶；血管紧张素酶抑制剂；荧光分光光度法；酶活性IV 毕业设计（论文）专用纸AbstractClinicalapplicationofsyntheticbloodpressureloweringdrugssuchascaptopril,cilazapril,enalapril,lisinoprilandotherdrugsindicatedthatinhibitionofangiotensin-convertingenzyme(ACE)activitycouldeffectivelylowerbloodpressure,butlong-termusecancausepoortolerance,commonadversereactions,limitingtheclinicaluse.Chinesemedicineisderivedfromnaturalfloraandfauna,richinresources,screeningChinesemedicinewhichcaneffectivelyinhibitangiotensinconvertingenzyme(ACE)activityhasimportantpracticalsignificance.Objectives:Byfluorescencespectrophotometry,studyontheangiotensin-convertingenzymeinhibitoryactivityofnaturalplantextractsL5,L6,LA,LBeffect,designedtoprovideascientificbasisforthedevelopmentofbloodpressuremedicine.Methods:Inthisstudy,thevitroexperimentalmodelandfluorescencespectrophotometrywereused.Inaddition,insteadofthetraditionalcuvette96-wellplateswereused.WhentheHippuryl-L-histidyl-L-leucinereactedwithACE,Hippuficacidwasproductedastheindicatorsforthedetermination.Captoprilasapositivecontrol,bydetectingthefluorescenceintensitydifferencebeforeandafter.CalculateinhibitionrateandevaluatetheinhibitionofL5,L6,LA,LB.Conclusions:NaturalplantextractsL5,L6,LA,LBcanexertinhibitoryeffectonangiotensinconvertingenzyme(ACE)attheconcentrationof10-3Mand10-7M.Keywords：angiotensin-convertingenzyme；angiotensin-convertingenzymeinhibitors；fluorescencespectrophotometry；activityIV 毕业设计（论文）专用纸目录摘要IAbstractII目录III一引言11.1血管紧张素转化酶及血管紧张素转化酶抑制剂11.1.1肾素-血管紧张素系统及血管紧张素酶的概述11.1.2血管紧张素转化酶的调血压机理21.2酶活性31.2.1酶活力的影响因素31.2.2酶活性和质量测定方法及其评价41.2.3ACEI活性的评价方法51.3天然血管紧张素转化酶抑制剂的研究进展51.4荧光分光光度计61.4.1仪器原理61.4.2影响荧光强度测定的因素7二实验82.1实验材料与仪器82.1.1实验仪器82.1.2实验材料82.1.3实验溶液92.2实验方法102.3实验操作112.3.1ACE/HHL背景检测、ACE酶活检测112.3.2卡托普利抑制效率测定112.3.3样品（L5、L6、LA、LB）抑制活性测定12三结果与讨论13IV 毕业设计（论文）专用纸3.1酶活性对荧光特性物质生成的影响133.2卡托普利对ACE的抑制活性结果测定143.2.1不同浓度的卡托普利对ACE的抑制活性测定143.2.210-3M卡托普利对ACE的抑制活性测定153.2.310-7M卡托普利对ACE的抑制活性测定173.3样品对ACE的抑制活性结果测定173.3.1L5、L6（10-3M）对ACE的抑制活性测定173.3.2L5、L6（10-7M）对ACE的抑制活性测定193.3.3LA、LB（10-7M）对ACE的抑制活性测定213.4反应时间对抑制效果的影响233.5反应体系物质对抑制效果的影响233.6反应体系中抑制剂浓度的确定23四结论与展望25致谢26参考文献27IV 毕业设计（论文）专用纸一引言高血压是一种常见的心血管疾病，它不仅患病率高，而且常引起严重的心、脑、肾等其他疾病，是脑卒中、冠心病、心力衰竭和肾脏疾病主要危险因素[1]。高血压是现代社会严重威胁人类健康的“头号杀手”。2010年，中国高血压患者已超过2亿，每年还在以l千万人的速度继续增加[2]。因此，研究生产高效安全的降血压药物已经成为国内外科学家积极探索的一项重要课题。目前，临床治疗上主要采用合成类降血压药物，如人工合成的降血压药物如卡托普利(captopril)，西拉普利(cilazapril)，依那普利(enalapril)，赖诺普利(1isinopri)等药物的临床应用表明，其疗效虽好，但长期使用，耐受性差副作用较大，如引起降压过度、泌尿系统病变、持续性咳嗽、味觉失真和血管神经性水肿等[3,4,5,6]。自1965年Ferreira从南美蝮蛇毒液中发现天然ACE抑制剂以来，很多研究者在寻找天然ACE抑制剂方面进行了大量探索。近十多年来，我国在这方面的研究逐渐活跃并开始深入[7]。人们试图从自然界中找寻天然的ACE活性抑制剂。中药来源于天然动植物，资源丰富[8]，筛选能有效抑制ACE活性的中药具有重要的现实意义。1.1血管紧张素转化酶及血管紧张素转化酶抑制剂1.1.1肾素-血管紧张素系统及血管紧张素酶的概述肾素-血管紧张素系统（renin-angiotensinsystem，简称为RAS）或肾素-血管紧张素-醛固酮系统（renin-angiotensin-aldosteronesystem,简称为RAAS）是一个激素系统。当大量失血或血压下降时，这个系统会被启动，用以协助调节体内的长期血压与细胞外液量（体液平衡）。血管紧张素转化酶（angiotensin．convertingenzyme，ACE）是一种二价二肽羧基金属肽酶[9]，在肾素-血管紧张素（RAS）系统中起着重要作用。当血压降低时，肾脏分泌肾素。肾素催化血管紧张素原水解产生血管紧张素I。血管紧张素I基本没有生物学活性，而是经血管紧张素转化酶（angiotensin．convertingenzyme，ACE）剪切C-末端两个氨基酸残基而形成血管紧张素II。血管紧张素II具有高效的收缩血管作用，从而使血压升高；血管紧张素II也能刺激肾上腺皮质分泌醛固酮。醛固酮能促进肾脏对水和钠离子的重吸收，继而增加体液容量，升高血压。27 毕业设计（论文）专用纸过度激活的肾素-血管紧张素-醛固酮系统是产生高血压的原因之一。下面几类药物可用于抑制肾素-血管紧张素系统：血管紧张素转化酶抑制剂；血管紧张素II受体拮抗剂；肾素抑制剂。血管紧张素转化酶因催化血管紧张素I转化为血管紧张素II和使具有舒张血管或降低血压作用的舒缓激肽（BK，bradykinin)失活这两种功能而成为治疗高血压、心力衰竭、2型糖尿病和糖尿病肾病等疾病的理想靶点。血管紧张素转化酶抑制剂能减少血管紧张素II的生成，并增加缓激肽的活性。1.1.2血管紧张素转化酶的调血压机理血管紧张素转化酶（angiotensin．convertingenzyme，ACE）广泛存在于肺、肾、脑、眼球、小肠、胎盘等组织的血管内皮细胞或上皮细胞及血浆、尿等体液中[10]。该酶由一条多肽链构成，N末端为苏氨酸，C末端为丙氨酸，需要阴离子激活，其中Cl-为最有效的激活剂，等电点在4.5左右[11,12]，人肺组织和血清中ACE分子量为140,000-150,000[13]。杨严俊等从兔肺提取ACE并进行特异性研究表明，酶活随温度升高而上升，至37℃达到最大，超过则开始下降。在37℃时，反应体系pH在7-9稳定性最高，其中最适pH为8.3[14]。该酶具有广泛的底物专一性，除作用于血管紧张素I外，还与含不同C末端氨基酸的肽底物起反应，如舒缓激肽、脑啡肽、P物质等[10]，能被金属螯合剂、重金属盐和特定肽类所抑制。ACE在人体肾素-血管紧张素系统（renin-angiotensinsystem，简称为RAS）和激肽释放酶-激肽系统（Kallikerin-kininsystem,简称为KKS）中，对血压调节起着重要作用，见图1-1。RAS和KKS是一对血压调节方面相互拮抗的体系，二者平衡才能维持血压正常。在RAS系统中，肾素能水解血管紧张素原释放出血管紧张素I，经ACE作用去掉其末端的二肽(Histidyl-L—leucine，His-Leu)生成血管紧张素II，它作用于血管壁上的受体使周围小动脉、血管平滑肌收缩，同时刺激醛固酮分泌，促进人体肾脏对Na+、K+的重吸收，引起钠储量和血容量的增加，从而导致血压升高。在KKS系统中，一些激肽如舒缓激肽能扩张毛细血管，增加其通透性，使血压下降。而ACE在该系统中能使舒缓激肽失去C末端的Phe-Arg或Ser-Pro，从而使激肽失活，引起血压升高[7,10,11]。由此可见，ACE活力升高则破坏了两个系统的平衡，使血压升高。因此，抑制ACE活性对降血压有着关键作用。血管紧张素转化酶抑制剂(ACEI)对实验性高血压动物及高血压患者有明显降压作用。在降压时不引起反射性心率增快，不出现水钠潴留现象，也不易产生耐药性。不同作用强度的ACEI，因其药物结构及药代动力学方面存在差异，在降压作用出现的快慢、作用维持的时间上可呈现不同。研究表明，ACEI的降压作用机制其一是，抑制循环及局部组织中的ACE。由于抑制循环中的ACE，血浆中血管紧张素II和醛固酮浓度降低，从而使血管扩张血容量降低，这是用药初期外周阻力降低、血压下降的主要原因。ACEI对局部组织（血管壁、脑、肾等）中的ACE也有抑制作用，且与局部组织中的ACE27 毕业设计（论文）专用纸结合较持久，对酶的抑制作用也较长，这与ACEI的长期降压作用有关。图1-1ACE在血压调控系统中的作用1.2酶活性1.2.1酶活力的影响因素1.2.1.1pH值大部分酶的活力受其环境pH值的影响，在一定pH值下，酶促反应有最大速率，高于或低于此值，反应速率都会下降，通常称此pH值为酶促反应的最适pH值。强酸强碱会影响酶蛋白的构象，甚至使酶变性而失活。当pH值改变不很强烈时，酶虽然不变性，但活力会受影响。pH值影响分子中其他一些基团的解离，这些基团的离子化状态与酶的专一性及酶分子中活力中心的构象有关。1.2.1.2温度每一种酶都有一个最适温度，即使酶发挥最大催化效应的温度。酶的最适温度不是特征物理常数，而与酶的作用时间、酶浓度、底物、酶活剂和抑制剂等因素有关。最适温度会随作用时间的改变而改变，作用时间长，酶的最适温度就低；作用时间短，酶的最适温度较高。27 毕业设计（论文）专用纸1.2.1.3激活剂凡是能提高酶活性的物质都称为激活剂，其中大部分是离子或小分子有机化合物。（1）金属离子。金属离子对酶的作用有两种，一是作为酶的辅因子起作用，二是作为激活剂起作用。作为激活剂起作用的有K+、Na+、Mg2+、Zn2+、Fe2+和Ca2+等，其中Mg2+是多种激酶和合成酶的激活剂。（2）阴离子。在一般浓度下，阴离子的激活作用并不明显。Cl-、Br-有激活作用，但Br-激活作用比较弱。1.2.1.4抑制剂酶在不变性的情况下，由于必需基团或活性中心化学性质的改变而引起的酶活性降低或丧失，成为抑制作用（inhibition）。能引起这种抑制作用的物质称为酶的抑制剂（inhibitor）。研究抑制剂对酶的作用是非常重要的，很多药物是酶的抑制剂，通过对病原体内某些酶的抑制作用或改变体内某些酶的活性而发挥其治疗功效，了解酶的抑制作用是阐明药物作用机制和设计研究新药的重要途径。1.2.2酶活性和质量测定方法及其评价1.2.2.1酶活性测定方法（1）按反应时间分类法：定时法：通过测定酶反应开始后某一时间段内（t1到t2）产物或底物浓度的总变化量来求酶反应初速度的方法，称为两点法（其中t1往往取反应开始的时间）。在酶反应一定时间后，通过加入强酸、强碱、蛋白沉淀剂等，使反应完全停止，所以也叫中止反应法。连续监测法：又称为动力学法或速率法、连续反应法。在酶反应过程中，用仪器监测某一反应产物或底物浓度随时间的变化所发生的改变，通过计算求出酶反应初速度。平衡法：通过测定酶反应开始至反应达到平衡时产物或底物浓度总变化量来求出酶活力的方法，又叫终点法。（2）按监测方法分类：分光光度法；旋光法；荧光法；电化学方法；化学反应法；核素测定法；量热法。1.2.2.2酶质量测定法：27 毕业设计（论文）专用纸随着免疫技术的发展，出现了利用酶的抗原性，通过抗原、抗体反应来直接测定酶的质量，直接用质量单位（ng/ml、µg/L）来表示酶含量的高低，所得结果的诊断价值高。用免疫学方法比测定酶活性方法的优点是灵敏度和特异性高，且不受体液中其他物质的影响，特别是抑制剂和激活剂的影响，当血液中有酶抑制剂存在，或因基因缺陷，合成了无活性的酶蛋白时，可以测出灭活的酶蛋白量，有利于疾病诊断和科学研究。1.2.3ACEI活性的评价方法ACEI的评价方法主要有体内试验和体外检测两种。体外检测法目前大都采用Cushman[15]等建立的方法或做相应修改。其主要原理是ACE在pH8.3、37℃及Cl-激发条件下，能水解马尿酰组氨酰亮氨酸(Hippuryl-L—histidyl-L—leucine，简称为HHL)产生马尿酸(Hippuficacid，HA)，该物质在288nm处有最大光吸收，产生马尿酸的量与ACE活性成正比。测定时，在ACE和HHL反应体系中加入抑制剂，以未加抑制剂的为对照，反应结束后用乙酸乙酯分别萃取出各体系中的马尿酸，蒸干乙酸乙酯并用水溶解后在288nm下测吸光值，将两者吸光值的差值与对照系的吸光值相比，计算出抑制率，作为ACE抑制剂的活性[16,17]。体内试验主要是动物实验和临床实验。动物实验一般以自发性高血压鼠(SponianeouslyHypertensiveRat，简称SHR)为研究对象，通过饲喂或静脉注射ACE抑制剂，测量试验前后SHR的血压变化来衡量抑制活性的大小[18]。根据饲喂次数，可将实验分为短期实验和长期实验。短期试验只测一次性口服ACEI前后的血压变化;长期实验是每天饲喂一次或每周一次连续几周甚至十几周，连续观察SHR的收缩压变化。临床实验主要通过选择若千位临界高血压患者和轻微高血压患者，连续测量各人血压得到平均值作为基本值。而后随机分成两组，一组每日食用一定剂量的ACEI，另一组作对照，测两组患者血压变化差异进行酪蛋白源血管紧张素转换酶抑制肤制备及分离纯化研究统计分析[19]。一般来说，体外检测法方便、快捷，条件较易达到，稳定性也较好，已经成为国内外研究者主要采用的方法。但在生物体中，ACE抑制肤的抑制效果可能跟体外检测结果相差较大。这是因为ACE抑制剂摄入体内，经蛋白酶水解后可能变成降血压活性更高的片段，也有可能被水解成降血压活性较低或几乎没有活性的片段[20]。因此，测定ACE抑制剂活性可以采用体外检测和体内试验，但要得到降血压的实际效果，必须进行体内试验检测。由于体内试验方法条件要求较高，实验操作繁琐，且饲喂周期较长，给检测带来诸多不便，目前一般在前期研究中多以体外检测为主，在产品研发后期才采用体内试验。1.3天然血管紧张素转化酶抑制剂的研究进展目前，国内研究比较成熟的是茶多酚对ACE活性的抑制和降压机理。本实验采用体外模型[9]，以马尿酰一组氨酰一亮氨酸(Hippuryl-L—histidyl-L—27 毕业设计（论文）专用纸leucine，HHL)为ACE反应底物，产物马尿酸(Hippuficacid，HA)为测定指标，卡托普利为阳性对照，研究中药提取物及活性部位抑制ACE的效果，旨在为开发降血压中药提供科学依据。因此，如何有效预防高血压成为人们共同面对的挑战。相关研究证明，血压升高与血管紧张素转化酶(angiotensin．convertingenzyme，ACE)有着密切的关联，ACE是一种含锌的羧二肽酶，能够将血管紧张素I转化成强有力的血管收缩剂——血管紧张素II，同时还能降解具有舒张血管或降低血压作用的舒缓激肽（BK，bradykinin)。可见ACE在升高人体血压过程中发挥非常关键的作用。因此，研究血管紧张素转化酶抑制剂（ACEI）成为心血管系统药物研究的一大热点。近20年来人们主要是从各种食品中寻找降血压肽，通过体外测定和动物实验来评价血管紧张素转化酶（ACE）抑制活性的大小，证明它们的降血压作用。目前，ACEI活性检测主要包括体外检测和体内检测(动物降血压试验)。体外检测模型简单，快速、准确，重复性高，在初期的研究和工艺筛选过程中，往往使用体外检测。因此，选择一种快速高效、准确可靠的体外检测方法是ACEI类药物研究过程中要首先解决的问题。由于传统方法需要先提取出马尿酸，操作繁琐，耗时，检测结果误差难以控制。许多研究者对这一方法进行了改进，利用HPLC或高效毛细管电泳等方法定量检测马尿酸，无须提取步骤，提高了检测的准确性，灵敏度和重现性也较好，但样品前处理及检测过程耗时，需消耗大量有机溶剂或缓冲溶液，检测成本较高[21]。本研究采用微量法直接测定ACEI活性，省去了萃取步骤，简化实验操作，用96孔板代替传统的比色皿，用荧光分光光度计，试剂用量少，大幅提高了检测速度和精密度，建立了一种方便快捷、试剂用量少、经济实用的检测方法。1.4荧光分光光度计1.4.1仪器原理用于测量荧光/磷光/发光的LS45/55是由图1-2所示的五个主要部件组成的：光源、激发光单色器、样品池、发光单色器及检测器。由光源发出的光经激发光单色器得到所需要的激发光波长。如其强度为I0，通过样品池后，由于一部分光能被荧光物质吸收，其透射光强度减为It。荧光物质被激发后，将发射荧光。为了消除入射光和散射光的影响，荧光的测量通常在与激发光成直角的方向进行。为了消除可能共存的其他光纤的干扰，如由激发光所产生的反射光、瑞利散射光和拉曼光，以及为将溶液中的杂质所发生的荧光滤去，以获得所需要的荧光，在样品池和检测器之间设置了发光单色器，荧光作用于检测器上，得到了相应的电信号，经放大后再记录下来。27 毕业设计（论文）专用纸图1-2LS45/55荧光/磷光/发光分光光度计的原理图1.4.2影响荧光强度测定的因素1.4.2.1激发光照射有一些荧光物质若受到强光照射，会发生分解而导致荧光强度（F）减弱。所以，荧光分光光度计通常在激发光单色器后装配有光闸，在测定时才打开光闸让激发光照射样品。1.4.2.2温度温度升高，荧光效率下降，荧光强度（F）减弱。（因为温度升高，增加分子间碰撞机会而使能量消耗掉）1.4.2.3pH值pH值能改变某些荧光物质的电子构型从而影响荧光强度。所以，有时需要pH缓冲液控制pH值在适当范围内。1.4.2.4溶剂有些溶剂会使荧光效率下降，也可能带来干扰荧光。27 毕业设计（论文）专用纸二实验2.1实验材料与仪器2.1.1实验仪器表2-1实验仪器仪器名称厂家型号转移脱色摇床其林贝尔仪器制造TS-8电热恒温培养箱上海精宏DNP-90224℃冰箱青岛海尔DW-40W100微量分析旋转工作台天津市兰标电子科技——pH计Mettler-ToledoDELTA320电子天平奥豪斯AR1140微量移液器Eppendorf10-1000µL2-20µL0.2-2µL电热恒温鼓风干燥箱重庆银河CS101-2AB2.1.2实验材料表2-2实验材料药品名称厂家规格氯化钠国药集团化学试剂分析纯氢氧化钠上海实验试剂分析纯硼酸国药集团化学试剂分析纯邻苯二甲醛国药集团化学试剂化学纯二甲亚砜国药集团化学试剂分析纯卡托普利——化学对照品HHLSigma——27 毕业设计（论文）专用纸2.1.3实验溶液2.1.3.1硼酸钠缓冲液（1）称量:分别称取3.019g硼酸、2.191g氯化钠固体，转移至100ml干燥小烧杯中。（2）溶解:加入蒸馏水约至80ml，用玻璃棒搅拌或旋转加热促溶。（3）调pH。测得pH0=3.72，用100-1000μl移液枪移取氢氧化钠浓溶液，边滴加边搅拌，至pH=8.3。（4）减压抽滤。收集滤液至量筒。（5）定容:用蒸馏水定容至100ml。（6）转移:将量筒中100ml硼酸钠缓冲液转移至100ml贮液瓶内，室温放置。2.1.3.2邻苯二甲醛（1）移取1ml二甲亚砜（DMSO）于2ml离心管中。（2）称取0.020g邻苯二甲醛，转移至上述离心管中。（3）用锡纸包裹，封口纸封口，室温避光保存。2.1.3.35mMHHL反应液（1）准备洁净干燥的100ml烧杯、100ml贮液瓶。（2）配置25mM氢氧化钠溶液。称取0.0467gNaOH(s)，加入到100ml烧杯中，加蒸馏水至20ml左右，搅拌促溶，在量筒中定容至46.7ml，得到46.7ml25mMNaOH溶液。（3）移取800μl25mMNaOH溶液于1.5ml离心管中，称取0.0085gHHL于其中，得到800μl25mMHHL贮液。（4）在微量旋转工作台上旋转促溶，并用滤膜过滤器过滤。（5）将25mMHHL贮液与硼酸钠缓冲液按1:4（600μl:2400μl）的比例混合，配置成3000μl5mMHHL反应液。2.1.3.410μg/mlACE（1）移取297μl硼酸钠缓冲液于1.5ml离心管中。（2）移取3μl1（U/mg）/mL的ACE溶于297μl硼酸钠缓冲液中，得到300μl10μg/mlACE。（3）旋转促溶，-20℃保藏。27 毕业设计（论文）专用纸2.1.3.5卡托普利溶液（1）称取0.0010g卡托普利于10ml离心管中。（2）移取5ml硼酸钠缓冲液于其中，旋转促溶，得到5ml10-3M卡托普利溶液。（3）移取1μl10-3M卡托普利溶液于2ml离心管中，加入99μl硼酸钠缓冲液，旋转混匀，得到100μl10-5M卡托普利溶液。（4）其他浓度（10-7，10-9，10-11M）的卡托普利溶液依照此法，逐级稀释得到。2.2实验方法本实验中，体外检测方法采用荧光分光光度法，用96孔板代替传统的比色皿。检测原理：通过加入血管紧张素I的模拟底物马尿酰组氨酰亮氨酸HHL，在一定条件下与ACE作用，ACE可酶解HHL生成马尿酸(Hippuficacid，HA)和二肽(Histidyl-L—leucine),二肽(Histidyl-L—leucine，His-Leu)是具有荧光特性的物质。加入ACEI后，抑制了His–Leu的生成，荧光强度（F）也随之降低。通过检测加入前后物质荧光强度的差异，计算该物质对ACE的抑制率。ACE+HHL→马脲酸+His-Leu卡托普利实验方案如下：阳性对照组ACE+HHL检测F硼酸钠缓冲液液阴性对照组ACE+HHL检测F卡托普利硼酸钠缓冲液硼酸钠缓冲液空白对照组+检测FL5/L6实验组ACE+HHL检测FL5/L6硼酸钠缓冲液硼酸钠缓冲液+检测F27 毕业设计（论文）专用纸2.3实验操作37℃，10min预热2.3.1ACE/HHL背景检测、ACE酶活检测（1）95μl硼酸钠缓冲液+10μl10μg/mlACE37℃，10min预热60μl5mMHHL+40μl硼酸钠缓冲液37℃，10min预热60μl5mMHHL+30μl硼酸钠缓冲液+10μl10μg/mlACE（2）各加入加入5μl邻苯二甲醛，避光室温反应10min。（3）在Ex=395nm，10*10，Em=460nm处检测30min内荧光强度变化。2.3.2卡托普利抑制效率测定（1）阳性对照组10-3M；10-5M；10-7M；10-9M；10-11M卡托普利溶液各5μl+5μl10μg/mlACE反应37℃，15min反应37℃，30min+60μl5mMHHL反应37℃，30min反应37℃，15min阴性对照组5μl硼酸钠缓冲液+5μl10μg/mlACE+60μl5mMHHL空白对照组10-3M；10-5M；10-7M；10-9M；10-11M卡托普利溶液各5μl+5μl硼酸钠缓冲液反应37℃，15min反应37℃，30min+60μl5mM硼酸钠缓冲液（2）各加入加入5μl邻苯二甲醛，避光室温反应10min。（3）在Ex=395nm，10*10，Em=460nm处检测30min内荧光强度变化。27 毕业设计（论文）专用纸2.3.3样品（L5、L6、LA、LB）抑制活性测定（1）阳性对照组10-3M；10-5M；10-7M；10-9M；10-11M样品溶液各5μl+5μl10μg/mlACE反应37℃，15min反应37℃，30min+60μl5mMHHL反应37℃，15min反应37℃，30min阴性对照组5μl硼酸钠缓冲液+5μl10μg/mlACE+60μl5mMHHL空白对照组10-3M；10-5M；10-7M；10-9M；10-11M样品溶液各5μl+5μl硼酸钠缓冲液反应37℃，30min反应37℃，15min+60μl5mM硼酸钠缓冲液（2）各加入加入5μl邻苯二甲醛，避光室温反应10min。（3）在Ex=395nm，10*10，Em=460nm处检测30min内荧光强度变化。27 毕业设计（论文）专用纸三结果与讨论3.1酶活性对荧光特性物质生成的影响取10μlACE（3μl1（U/mg）/mL的ACE溶于297μl硼酸钠缓冲液（pH=8.3，含375mol/LNaCl））10μg/ml于平底96孔板，加入60μl5mM底物HHL，用30μl硼酸钠缓冲液（pH=8.3，含375mol/LNaCl）补充到总体积100μl，平行设置三个样，于37℃保温10min。各加入加入5μl邻苯二甲醛，避光室温反应10min。在Ex=395nm，10*10，Em=460nm处检测30min内荧光强度变化。结果见图3-1和图3-2。图3-13.12背景及酶活检测（Ⅰ酶）图3-23.15背景及酶活检测（Ⅱ酶）27 毕业设计（论文）专用纸由图3-1可见，使用I酶时，30min内检测到其与底物反应后的荧光强度随时间推移升高，FL值在4~9范围内变化。由图3-2可见，使用II酶时，30min内检测到其与底物反应后的荧光强度随时间推移升高，FL值在12~15范围内变化。因此，不同活性的酶与底物反应后荧光强度有差异，活性高的酶与底物反应后所检测到的荧光强度也较高。3.2卡托普利对ACE的抑制活性结果测定3.2.1不同浓度的卡托普利对ACE的抑制活性测定取用I酶和I卡托普利，卡托普利浓度为10-3M、10-5M、10-7M、10-9M、10-11M。采用卡托普利与酶预反应30min后加底物HHL反应15min，HHL用量60μl，按照实验方案设置阳性对照组、阴性对照组和空白对照组。在Ex=395nm，10*10，Em=460nm处检测30min内荧光强度变化。结果见图3-3。图3-3不同浓度卡托普利对ACE抑制活性的测定由图3-3可见，b曲线为阴性对照，阳性对照组中，抑制效果a3＞a5＞a2＞a4＞a1，即10-7＞10-11M＞10-5M＞10-9＞10-3M。该结果与文献研究结论[22]不一致，差别较大，分析可能的原因是I酶或I卡托普利放置时间太久，活性有所改变。3.2.210-3M卡托普利对ACE的抑制活性测定取用酶（II）分别与卡托普利卡（I）和卡托普利（II）反应，卡托普利浓度为10-3M。采用卡托普利与酶预反应60min后加底物HHL反应30min，HHL用量40μl，按照实验方案设置阳性对照组、阴性对照组和空白对照组。在Ex=395nm，10*10，Em=46027 毕业设计（论文）专用纸nm处检测30min内荧光强度变化。表3-110-3M卡托普利（I）对ACE酶抑制活性的测定time阳性对照阴性对照空白对照抑制率010.86510.6963.180-0.022311.98611.9743.311-0.001613.20213.2243.3480.002914.11114.1643.3650.0051215.13515.1473.4380.0011515.97616.0783.5540.008表3-210-3M卡托普利（II）对ACE酶抑制活性的测定time阳性对照阴性对照空白对照空底板抑制率05.92850.5566.6092.794101.55%36.12251.8786.7382.733101.36%66.20353.5206.6432.697100.94%96.17855.5226.7552.698101.18%126.23057.0396.7452.653101.02%156.25558.6476.8062.659101.06%图3-410-3M卡托普利（I）对ACE酶的抑制活性测定27 毕业设计（论文）专用纸图3-510-3M卡托普利（II）对ACE酶抑制活性的测定由图3-4可见，阴性对照和10-3M卡托普利的阳性对照组曲线基本重合，基本没有显示出抑制效果。而图3-5显示出很明显的抑制效果，由此，结合图3-3可以判断，卡托普利（I）已经变性失活。新鲜配置的10-3M卡托普利对ACE有明显的抑制作用。3.2.310-7M卡托普利对ACE的抑制活性测定取用酶（II）和卡托普利（II），卡托普利浓度为10-7M。采用卡托普利与酶预反应120min后加底物HHL反应60min，HHL用量60μl，按照实验方案设置阳性对照组、阴性对照组和空白对照组。在Ex=395nm，10*10，Em=460nm处检测30min内荧光强度变化。表3-310-7M卡托普利对ACE酶抑制活性的测定time卡托普利阴性对照空白对照空底板抑制率016.39526.9302.7102.03743.50%320.69640.0842.5802.05951.70%624.80852.7722.3191.84655.42%929.70265.4272.3111.94056.60%1234.45175.1462.2481.92955.82%1538.57284.0352.1561.88155.52%27 毕业设计（论文）专用纸图3-610-7M卡托普利对ACE酶抑制活性的测定由图3-6和表3-3可见，10-7M卡托普利对ACE酶抑制活性比较明显，达50%左右。3.3样品对ACE的抑制活性结果测定3.3.1L5、L6（10-3M）对ACE的抑制活性测定取用酶（II）分别与样品反应，L5、L6浓度为10-3M。采用样品与酶预反应60min后加底物HHL反应30min，HHL用量40μl，按照实验方案设置阳性对照组、阴性对照组和空白对照组。在Ex=395nm，10*10，Em=460nm处检测30min内荧光强度变化。表3-410-3ML5对ACE酶抑制活性的测定timeL5阴性对照空白对照空底板抑制率017.98722.7723.7703.31125.18%319.86525.1563.3723.18824.29%622.31128.0943.2513.10323.28%924.44530.7263.0883.03122.72%1226.63733.3442.9882.89922.10%1528.63935.7223.0572.88421.68%27 毕业设计（论文）专用纸图3-710-3ML5对ACE酶抑制活性的测定表3-510-3ML6对ACE酶抑制活性的测定timeL6阴性对照空白对照空底板抑制率019.92725.5523.6563.38525.69%322.68929.3823.3643.20825.72%626.08133.3153.1593.13123.99%929.25537.2053.0272.97423.26%1232.06440.7912.9242.92823.04%1535.46244.5072.9052.93321.74%图3-810-3ML6对ACE酶抑制活性的测定27 毕业设计（论文）专用纸由图3-7、图3-8和表3-4、表3-5可见，10-3ML5、L6对ACE酶有抑制作用，均为23%左右，二者比较而言，L6的抑制作用略强。3.3.2L5、L6（10-7M）对ACE的抑制活性测定取用酶（II）分别与样品反应，L5、L6浓度为10-7M。采用样品与酶预反应120min后加底物HHL反应60min，HHL用量60μl，按照实验方案设置阳性对照组、阴性对照组和空白对照组。在Ex=395nm，10*10，Em=460nm处检测30min内荧光强度变化。表3-610-7ML5对ACE酶抑制活性的测定timeL5阴性对照空白对照空底板抑制率016.97726.9302.4682.03740.69%322.59540.0842.2392.05946.21%628.06452.7721.7831.84648.46%933.74865.4271.8001.94049.79%1239.41175.1461.7781.92948.71%1544.55684.0351.6591.88147.93%图3-910-7ML5对ACE酶抑制活性的测定27 毕业设计（论文）专用纸表3-710-7ML6对ACE酶抑制活性的测定timeL6阴性对照空白对照空底板抑制率017.78826.9302.4712.03737.38%324.44140.0842.4382.05941.55%630.34752.7722.1771.84644.32%938.74165.4272.2211.94042.22%1245.19875.1462.1491.92941.03%1551.52284.0351.9681.88139.62%图3-1010-7ML6对ACE酶抑制活性的测定由图3-9、图3-10和表3-6、表3-7可见，10-7ML5、L6对ACE酶抑制活性比较明显，L5的抑制作用约为47%，L6的抑制作用约为41%，二者比较而言，L5的抑制作用略强。3.3.3LA、LB（10-7M）对ACE的抑制活性测定取用酶（II）分别与样品反应，LA、LB浓度为10-7M。采用样品与酶预反应120min后加底物HHL反应60min，HHL用量60μl，按照实验方案设置阳性对照组、阴性对照组和空白对照组。在Ex=395nm，10*10，Em=460nm处检测30min内荧光强度变化。27 毕业设计（论文）专用纸表3-810-7MLA对ACE酶抑制活性的测定timeLA阴性对照空白对照空底板抑制率022.38126.9302.5822.03718.68%331.22740.0842.3552.05923.47%639.16952.7722.1351.84626.86%948.75865.4272.1521.94026.34%1256.86675.1462.0381.92925.00%1563.79884.0351.9541.88124.66%图3-1110-7MLA对ACE酶抑制活性的测定表3-910-7MLB对ACE酶抑制活性的测定timeLB阴性对照空白对照空底板抑制率020.92226.9302.2322.03724.32%330.61840.0842.0002.05924.85%640.66252.7721.5391.84623.64%950.39365.4271.7041.94023.59%1259.22475.1461.7061.92921.68%1566.96284.0351.6921.88120.73%27 毕业设计（论文）专用纸图3-1210-7MLB对ACE酶抑制活性的测定由图3-11、图3-12和表3-8、表3-9可见，10-7MLA、LB对ACE酶有抑制作用，LA的抑制作用约为24%，LB的抑制作用约为23%，二者比较而言，LA的抑制作用略强。3.4反应时间对抑制效果的影响为了能准确测出ACEI的抑制活性，本试验在针对时间条件上进行了多次试验。由表3-2和图3-5可见，“60min+30min”的时间模式下，10-3M卡托普利对ACE的抑制率达101%，而由图3-6和表3-3可见，当反应时间更改为“120min+60min”时，10-7M卡托普利对ACE酶抑制率50%左右。由图3-7、图3-8和表3-4、表3-5可见，“60min+30min”的时间模式下，10-3ML5、L6对ACE酶有抑制作用，均为23%左右，由图3-9、图3-10和表3-6、表3-7可见，“120min+60min”的时间模式下，10-7ML5对ACE的抑制率约为47%，10-7ML6对ACE的抑制率约为41%。说明为了使其充分反应，试验过程中应适当延长反应时间。3.5反应体系物质对抑制效果的影响27 毕业设计（论文）专用纸要能准确测出ACE正抑制活性，必须控制反应体系中ACE、HHL、ACEI等反应物浓度在合适范围内，确定合适的反应体系。目前国内外不少研究者在制定ACEI抑制活性体外检测法时，一般忽略HHL对反应体系荧光强度的影响。而由图3-1和图3-2可见，HHL的荧光强度FL在体系中保持较高的值，可能会影响试验结果的准确性。若抛开时间因素来看，由表3-2和图3-5可见，当HHL用量为40μl时，10-3M卡托普利对ACE的抑制率为101%，而由图3-6和表3-3可见，当HHL用量为60μl时，10-7M卡托普利对ACE酶抑制率为50%左右。由图3-7、图3-8和表3-4、表3-5可见，当HHL用量为40μl时，10-3ML5、L6对ACE酶有抑制作用，均为23%左右，由图3-9、图3-10和表3-6、表3-7可见，当HHL用量为60μl时，10-7ML5对ACE的抑制率约为47%，10-7ML6对ACE的抑制率约为41%。根据数据之间的相关性，可以设想，在后续工作中控制HHL的用量为变量，进行深入探究。3.6反应体系中抑制剂浓度的确定文献研究表明，ACEI浓度不同，其抑制能力也不同。浓度增加，则抑制能力增强[22]。本次试验过程中，在对不同浓度抑制剂对ACE抑制作用的影响的研究没有完善，实验结果不理想。如图3-3，因为用久置的ACE酶（I）和卡托普利（I）研究不同浓度卡托普利对ACE抑制活性时，结果显示即10-7M＞10-11M＞10-5M＞10-9＞10-3M，显然该结果与文献研究结论出入较大。而后续试验中，由图3-7、图3-8和表3-4、表3-5可见，10-3ML5、L6对ACE酶的抑制率均为23%左右，由图3-9、图3-10和表3-6、表3-7可见，10-7ML5对ACE的抑制率约为47%，10-7ML6对ACE的抑制率约为41%。但由于在这两个浓度的试验中，同时改变了时间和HHL的用量，所以若要说明问题，还需要后续严格控制单一变量，进行进一步探究。27 毕业设计（论文）专用纸四结论与展望实验结果表明以马尿酰组氨酰亮氨酸HHL为模拟底物，用荧光分光光度法检测加入样品前后物质荧光强度的差异，可以得出天然植物提取物10-3M、10-7M的L5、L6、LA、LB对血管紧张素转化酶均有一定抑制作用。新鲜配置的10-3M卡托普利对ACE的抑制作用明显，抑制率达101%左右，10-7M卡托普利对ACE酶抑制活性比较明显，达50%左右。10-3ML5、L6对ACE酶有抑制作用，均为23%左右，二者比较而言，L6的抑制作用略强。10-7ML5、L6对ACE酶抑制活性比较明显，L5的抑制作用约为47%，L6的抑制作用约为41%，二者比较而言，L5的抑制作用略强。10-7MLA、LB对ACE酶有抑制作用，LA的抑制作用约为24%，LB的抑制作用约为23%，二者比较而言，LA的抑制作用略强。在整个探究过程中，由于前期客观因素的限制，如试验所用的ACE酶以及药品卡托普利的存量不新鲜、不充足，所以前期花费一段时间进行酶活性测定、卡托普利活性测定。加之可供试验的时间不充裕，很多探究还不够深入。在后续试验过程中，为了使其充分反应，试验过程中应适当延长反应时间。而为了进一步确定合适的反应体系，可以根据已有数据之间的相关性，在后续工作中控制HHL的用量为变量，进行深入探究。此外，由于在本次探究的两个浓度的试验中，同时改变了时间和HHL的用量，所以若要准确得出结论，还需要后续严格控制单一变量，进行进一步探究。最后，由于客观时间的限制，本次试验没有根据上述研究确定的方法，在不同时间进行多次试验，所以后续探究过程中应该对方法的重复性进行测定。该方面的深入研究有望获得天然产物来源的环肽类血管紧张素转化酶抑制剂，对开发和应用中药提取物及活性部位抑制ACE具有指导意义，为开发降血压中药提供科学依据。27 毕业设计（论文）专用纸致谢毕业论文暂告收尾，这也意味着我在湖北工业大学的四年的学习生活既将结束。回首过往，自己一生最宝贵的时光能在这样的校园之中，能在众多学富五车、才华横溢的老师们的熏陶下度过，实是荣幸之极。在这四年的时间里，我在学习上和思想上都受益非浅。这除了自身努力外，与各位老师、同学和朋友的关心、支持和鼓励是分不开的。在这里，我要重重感谢我的论文指导老师谢老师和研究生赵格宁师姐，从最初的定题，到资料收集，到开始实验到写作、修改，她们给了我耐心的指导和无私的帮助。此外，还要感谢在大学四年中帮助过我的所有人，感谢老师们的悉心教导，以及帮助过我、并且共同奋斗四年的大学同学们，能够顺利完成论文，是因为一路上有你们。再次衷心地感谢所有在毕业设计中曾经帮助过我的良师益友，以及在设计中被我引用或参考的论著的作者。27 毕业设计（论文）专用纸参考文献[1]卫生部心血管病防治研究中心、中国高血压联盟:《中国高血压防治指南》.[2]卫生部、科技部、国家统计局:《中国居民营养与健康现状》，2004，10.[3]曹晓钢，于刚，叶小利等.中药提取物及活性部位抑制血管紧张素转化酶活性的研究[J]食品与药品，2009,11(1):20-23.[4]肖国豪，蔡福喜．血管紧张素转换酶抑制剂的副作用[J]．医学综述，1998。4(s)：432435．[5]袁源．血管紧张素转化酶抑制剂的临床常见不良反应[J]．锦州医学院学报，1998，19(6)：34-35．[6]FeidmanHA,GiodsteinI,HatzichristonDG,etal.Impotenceandpsychosocialcorrelates:resultsofthemassachusettsmaleagingstudy[J].JournalofUrology,1994,151:54-61.[7]夏镇波.酪蛋白源血管紧张素转换酶抑制肤制备及分离纯化研究[D].南京：南京农业大学食品科学系，2008:1.[8]丁林生，孟正木.中药化学[M]．南京：东南大学出版社，2005：l，[9]程艳霞，任昉，何林.血管紧张素转化酶抑制剂体外筛选模型的建立[R].成都：四川大学华西医院，地奥集团制药有限公司药物研究所，2004：590-591.[10]]ErdosEG,skidgelRA.TheangiotensinI-convertingenzyme[J].LabInvest，1987，56:345-348.[11]JohnstonJI，FranzVL.Renin-angiotensinsystem:adualtissueandhormonalsystemforcardiovascularcontrol[J].JHyertens1992，10:13-26.[12]陈吉球.血管紧张素转换酶[J].桂林医学院学报，1997，10(l):131-134.[13]SteveBR，FemandezA，KneerC，CerdaJJ，PhillipsMI，WbodwardER.Huxnanintestinalbrushborderangiotensin-eonvertingeenzymeactivityanditsinhibitionbyantihypertensiveramiPril[J].Gastroenierology，1988，98:942-944.[14]杨严俊，李进伟.兔肺血管紧张素转换酶的分离提取及特性研究[J1.食品与发酵工业，2003，8:53-56.[15]CushmanDW，CheungHS.SpectrophotometricassayandpropertiesoftheangiotensinI-convertingenzyrneofrabbitlung[J].BiochemPharmacol，1971，20:1637-1648.[16]吴琼英，马海乐，骆琳等.高效液相色谱法测定血管紧张素转换酶抑制剂的活性.色谱，2005，23(1):79-81.[17]徐榕榕，陶冠军，李进伟等.高效液相色谱测定血管紧张素转换酶抑制肤的活性[J].河南工业大学学报(自然科学版)，2005，26(4):18-21.27 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