溴甲酚绿分光光度法测定牛血清白蛋白

'溴甲酚绿分光光度法测定牛血清白蛋白第28卷第9期2009年9月分析试验室ChineseJournalofAnalysisVo1.28.No.92【x)9—9溴甲酚绿分光光度法测定牛血清白蛋白严志红,朱明芳,唐睿,仇志坤(广东药学院药科学院,广州510006)摘要:在pH3.3的Britton—Robinson(B—R)缓冲溶液中,对溴甲酚绿(BCG)与牛血清白蛋白(BSA)相互作用的吸收光谱进行了初步研究.结果表明:BCG与BSA作用在室温下能迅速结合成复合物,并且随着BSA的浓度增大,在444Bin处的吸收峰降低,618r.rr.处吸收峰升高并红移至628lqln.在此波长下测定其复合物的吸光度,其吸光度的增加值(△ 溴甲酚绿分光光度法测定牛血清白蛋白第28卷第9期2009年9月分析试验室ChineseJournalofAnalysisVo1.28.No.92【x)9—9溴甲酚绿分光光度法测定牛血清白蛋白严志红,朱明芳,唐睿,仇志坤(广东药学院药科学院,广州510006)摘要:在pH3.3的Britton—Robinson(B—R)缓冲溶液中,对溴甲酚绿(BCG)与牛血清白蛋白(BSA)相互作用的吸收光谱进行了初步研究.结果表明:BCG与BSA作用在室温下能迅速结合成复合物,并且随着BSA的浓度增大,在444Bin处的吸收峰降低,618r.rr.处吸收峰升高并红移至628lqln.在此波长下测定其复合物的吸光度,其吸光度的增加值(△ 溴甲酚绿分光光度法测定牛血清白蛋白第28卷第9期2009年9月分析试验室ChineseJournalofAnalysisVo1.28.No.92【x)9—9溴甲酚绿分光光度法测定牛血清白蛋白严志红,朱明芳,唐睿,仇志坤(广东药学院药科学院,广州510006)摘要:在pH3.3的Britton—Robinson(B—R)缓冲溶液中,对溴甲酚绿(BCG)与牛血清白蛋白(BSA)相互作用的吸收光谱进行了初步研究.结果表明:BCG与BSA作用在室温下能迅速结合成复合物,并且随着BSA的浓度增大,在444Bin处的吸收峰降低,618r.rr.处吸收峰升高并红移至628lqln.在此波长下测定其复合物的吸光度,其吸光度的增加值(△ 溴甲酚绿分光光度法测定牛血清白蛋白第28卷第9期2009年9月分析试验室ChineseJournalofAnalysisVo1.28.No.92【x)9—9溴甲酚绿分光光度法测定牛血清白蛋白严志红,朱明芳,唐睿,仇志坤(广东药学院药科学院,广州510006)摘要:在pH3.3的Britton—Robinson(B—R)缓冲溶液中,对溴甲酚绿(BCG)与牛血清白蛋白(BSA)相互作用的吸收光谱进行了初步研究.结果表明:BCG与BSA作用在室温下能迅速结合成复合物,并且随着BSA的浓度增大,在444Bin处的吸收峰降低,618r.rr.处吸收峰升高并红移至628lqln.在此波长下测定其复合物的吸光度,其吸光度的增加值(△ 溴甲酚绿分光光度法测定牛血清白蛋白第28卷第9期2009年9月分析试验室ChineseJournalofAnalysisVo1.28.No.92【x)9—9溴甲酚绿分光光度法测定牛血清白蛋白严志红,朱明芳,唐睿,仇志坤(广东药学院药科学院,广州510006)摘要:在pH3.3的Britton—Robinson(B—R)缓冲溶液中,对溴甲酚绿(BCG)与牛血清白蛋白(BSA)相互作用的吸收光谱进行了初步研究.结果表明:BCG与BSA作用在室温下能迅速结合成复合物,并且随着BSA的浓度增大,在444Bin处的吸收峰降低,618r.rr.处吸收峰升高并红移至628lqln.在此波长下测定其复合物的吸光度,其吸光度的增加值(△ )与BSA的质量浓度在8～260/~g/mL范围内呈良好的线性关系(r=0.9996),检出限为4g/mL.该方法应用于鲜奶粉和液态纯牛奶样品中总蛋白的测定,回收率分别为92.7%,95.5%,结果与考马斯亮蓝G250法基本一致.关键词:溴甲酚绿;分光光度法;牛血清白蛋白中图分类号:0657.3文献标识码:A文章编号:1000—072(】(2009)O9—082—03蛋白质的定量分析是生命科学和临床医学及食品营养学中的重要课题,目前的测定方法有紫外.可见分光光度法,荧光法,化学发光法_】.],电化学法[3等,其中因分光光度法简单,快速,重现性好等优点而受到人们关注.常用的光度法在反应时间,选择性,灵敏性及重现性等方面各有优缺点.溴甲酚绿(BCG)是一种应用较广泛的蛋白质染色剂.本文基于牛血清白蛋白(BSA)与BCG在酸性介质和室温条件下迅速结合成复合物,建立了测定蛋白质的简便,快速,选择性好的分析方法.1实验部分1.】仪器与试剂PHS一25数显酸度计(上海仪器仪表公司);紫外可见分光光度计(uvl101,上海天美科学仪器公司);BSA(德国默克公司,广州泽元贸易公司分装,纯度:98.0%,2mg/mL);BCG(天津天心精细化工开发中心,1.14×10mol/L);Britton—Robin—SOB缓冲溶液(pH3.3),牛奶粉(安怡,恒天然乳品公司);鲜牛奶(伊利,内蒙古伊利公司);其它试剂均为分析纯;水为二次去离子水.1.2实验方法取一定量的BSA标准溶液于25mL容量瓶中,依次准确加入7mL1.14×10mol/LBCG和3mLpH3.3的Britton—Robinson缓冲溶液,以水定容,静置12min.以相应的试剂空白为参比,在室温下用1ClTI比色皿在波长628Bin处测定其△ 4.2结果与讨论2.1吸收光谱BCG与BSA形成的复合物的吸收光谱(见图1).在pH3.3时,试剂BCG本身的吸收峰在444llll”l处.而从BCG-BSA吸收光谱中得知,随着BSA的浓度增大,图中444nIn处的吸收峰不断下降,并蓝移至416nm;而618DAB吸收峰升高并红移至628nln.由于受BSA微环境的影响,BCG分子巾具有疏水性质的苯环通过疏水相互作用与BSA分子疏水空腔结合,使BCG与BSA生成了复合物l5.实验采用的测定波长为628nm.收稿日期:2008—08—1l;修订13期:2008—10—24作者简介:严志红(1977一),男,讲师;E-mail:yzhxsp@yahoo.coin.cn一82—第28卷第9期2009年9月分析试验室ChineseJournalofAnalysisLaboratoryVo1.28.No.920o9—9|/nm图1复合物在不同浓度的BSA存在时的吸收光谱FiglUV-Visspectraofthecomplexinthepresenceofdif-ferentconcentrationsofBSACB(=3.2×10～mol/L,pH3.3曲线1～4:cBsA=0,2,20,200~g/mL2.2pH对结合反应的影响溶液的酸度是影响BSA与BCG结合反应的重要因素.实验考察了不同缓冲体系:B—R,Tris.HC1,HAC—NaAc,NH3H2O-NH,C1,Na2HPO4一№H2PO4等缓冲体系对结合反应的影响.结果发现:在B—R缓冲溶液中pH3.2～3.5之间的吸光度最大且保持基本不变.实验采用B—R缓冲溶液(pH3.3)为底液.2.3BCG的用量固定BSA为200~g/mL.通过改变试剂BCG的用量,以对应试剂空白为参比,考察了BCG用量对该结合反应的影响.结果表明:随着BCG用量的增大,该体系的吸光度逐渐增大,当用量在6.58.0mL,浓度为1.14X10mol/LBCG时体系的吸光度较大且基本不变,但当用量大于8.0mL时,体系的吸光度下降.实验选用7m1J1.14X10mol/LBCG作BSA的用量标记试剂.2.4离子强度的影响用NaC1溶液为代表进行离子强度的试验,结果表明:随着NaC1的浓度增大吸光度则相应地减小,当其浓度小于0.1mol/L时对试验结果没有影响.这可能是由于盐离子与水分子的作用 机会增大,破坏了牛血清白蛋白分子表面的水化层,使蛋白质的溶解度降低,减少了BCG与BSA作用的机会』.离子强度的影响,也进一步说明了BCG与BSA之间主要是通过静电作用结合的.2.6精密度及反应的稳定性按实验方法对标准溶液(ID跚=200eg/mL)进行10次平行测定并计算其相对标准偏差,吸光度的平均值为0.356,RSD%为2.6%;体系在12min后趋于稳定,并在6h内体系的吸光度值没有较大变化,故显色时间设定为12min.2.7标准曲线在最佳实验条件下,吸光度的增加值(△)与BSA的质量浓度在8～260l-tg/mL(r=0.9996)呈线性关系,回归方程为△ =1.74p一0.0035,检测限为4/~g/mL(S/N=3).2.8干扰实验在最佳试验条件下考察了多种金属离子(包括Mn2,Ca2,K,Cu2,Ni2,C()2,Na,Fe3),葡萄糖,柠檬酸,水杨酸等对200/~g/mLBSA测定的影响(见表1).测定的相对误差均在±5%以内,况且实际样品测定时需将样品稀释,故实际样品测定时可以不考虑共存物的干扰.表1各种共存物对BSA的影响Tab.1Effectofvariouscoexistingsubstancesonthedeter.rnin~ationofBsA2.9样品分析用本法与经典的考马斯亮兰法(CBBG-250)相比较,对牛奶粉,盒装鲜牛奶样品中总蛋白进行平行测定(见表2).结果表明:本方法与临床方法测定结果基本一致,回收率符合生化分析的要求,测定结果的重现性较好.～R3一第28卷第9期2009年9月分析试验室ChineseJoumalofAnalysisLaboratoryVn1.28.No.920o9—9表2样品的测定及回收率实验Tab.2Determinationresultsofsamplesandrecoverytest(n=5)参考文献[1]赵长容,刘保生,张红医.光谱学与光谱分析,2005,25(1):92[2]玄光善,吴效楠,李玉平.光谱实验室,2005,22(4):861[3]韩英强,罗登柏.分析仪器,2004,12(2):27[4]翟红林,贾润萍,陈兴国.兰州大学,2006,42(6):69[5]马贵斌,高飞,任斌知等.化学,1995,53(12):1193[6]商志才,易平贵,俞庆森等.物理化学,2001,l7(1):48[7]陈德军,卢雁,张锁江等.河南师范大学,2004,32(1):123DeterminationofbovineserumalbuminbyspectrophotometrywithbromocresolgreenYANZhi-hong,ZHUMing-fang,TANGRuiandOIUZhi-kun(DepartmentofPharmacy,GuangdongPhannaceuti—calCollege,Guangzhou510006),FenxiShiyanshi,2009,28(9):82～84Abstract:Theabsorptionspectrumofthecomplexofbromocresolgreen(BCG)andbovineseI3dnlalbumin(BSA)wasstudiedpreliminarilyintheBritton—Robinson(B—R)buffersolution(pH3.3).TheresultsshowedthatBCGandBSAcouldreactwitheachotherandthepeakintensityat444Binreduced.thepeakintensityat618nlTlincreasedandthepeakshiftedto628nln.TheabsorbanceofthecomplexwaslinearlyproportionaltotheBSAconcentrationintherangeof8～260#g/mL,andthelimitofdetectionWas4~g/mL.Themethodissimple,fast,andithashighselectivityandsensitivity.TheproposedmethodWasappliedtothedeterminationofthetotalproteininthefreshmilkpowderandliq?uidmilksampleswithsatisfactoryresults.Theexperimentalresultsareroughlyidenticalwiththeresultsobtainedbytheeoomassiebrilliantbl1leG250.Keywords:Bromocresolgreen;Spectrophotometry;BovineselMnlalbumin----——84----——'