分光光度法分析生物农药05菇类蛋白多糖水剂

'第45卷第9期农药Vol.45,No.92006年9月AgrochemicalsSep.2006农药分析-分光光度法分析生物农药0.5%菇类蛋白多糖水剂李楠1陈沛然1白一平2肖玉梅1(1.中国农业大学应用化学系北京1000942.北京燕化永乐农药有限公司北京102488)摘要采用常规的蒽酮-硫酸显色和茚三酮显色分光光度法对新型糖蛋白类生物农药0.5%菇类蛋白多糖水剂的有效成分醇溶糖类和糖蛋白及氨基酸含量进行了分析在文献的基础上改进优化实验方法最终筛选确定了比较理想的分析条件方法的准确性较高相对标准偏差分别为3.21%和3.50%醇溶醣类的平均回收率均达到96%~99%糖蛋白和氨基酸的回收率达到92%~96%此方法简便准确回收率高精密度好常用于其它天然物质中类似成分的测定也可用于0.5%菇类蛋白多糖水剂的质量控制和生产工艺研究用本方法分析这类生物农药的方法尚未见报道关键词0.5%菇类蛋白多糖水剂醇溶糖类a-氨基酸分光光度法中图分类号TQ450.7文献标识码A文章编号1006-0413(2006)09-0608-03Spectrophotometricdeterminationofamushroomderivedproteinamylose0.5%solubleconcentratebiopesticideLINan1,CHENPei-ran1,BAIYi-ping2,XIAOYu-mei1(1.DepartmentofAppliedChemistry,ChinaAgriculturalUniversity,Beijing100094,China;2.BeijingYanhuaYonglePesticideCo.,Ltd.,Beijing102488,China)Abstract:Aspectrophotometricmeasurementwasusedtodeterminetheactiveingredientsofanewlydevelopedmushroomderivedproteinamylosebiologicalpesticide.Determinationmethodswereimprovedbasedontheliteratureandoptimizationexperiments,resultinginmethodologythatprovidedexcellentanalyticalconditionsandhighaccu-racywithrelativestandarddeviationsof3.21and3.50%.Polysacchariderecoveryaveraged96to99%.Glycoproteinsandaminoacidrecoverywas92to96%.Themethodwasconvenient,accurate,andprecise,withhighrecoveries,andisoftenusedindeterminationofothersimilarnaturalsubstancesaswellasbeingusefulinqualitycontrolandproductionmethodologyresearchforamushroomderivedproteinamylose0.5%solubleconcentrate,althoughthislatterusehasnotbeenpreviouslyreported.Keywords:mushroomderivedproteinamylase0.5%solubleconcentrate;polysaccharide;a-aminoacid;spectrophotometry生物源农药因其对环境友好对人畜低毒活性较的蒽酮-硫酸显色法和茚三酮显色法进行分析具体测强而受到研发部门和使用单位的青睐这类农药的研制定的项目为醇溶糖类含量与糖结合的蛋白质与游和使用在我国也已经开展起来[1-4]0.5%菇类蛋白多糖水离氨基酸的含量剂(商品名称抗毒丰原名抗毒剂1号)系生物农药0.5%菇类蛋白多糖水剂为近年来开发生产的新型农该农药集防治营养促生长于一体可获得防治病药用分光光度法对这类农药的有效成分进行分析尚未毒病害增产增收的综合效益具有抑制病毒感染增见报道强植株抗性提高作物产量和产品品质等功效主要用1蒽酮-硫酸法测定醇溶糖[5-6]于番茄甜(辣)椒大白菜西瓜菜豆马铃薯1.1仪器与药品大蒜花生烟草及花卉等病毒病害的防治该产品722型分光光度计LDZ4-0.8A型离心机冰箱分安全可靠对人畜无毒副作用对植物无残毒对环析天平(精确到0.0001g)无水乙醇(A.R.)葡萄糖(A.R.)境无污染98%硫酸(A.R.)(以上试剂均由北京化工厂生产)无水乙经实验证实该农药的主要有效成分是真菌糖类和醚(A.R.北京化学试剂公司生产)蒽酮(A.R.中国医糖蛋白根据农业部实验室确认该药品中糖类的含药上海化学试剂公司生产)0.5%菇类蛋白多糖水剂(由量可以通过其中醇溶糖类的含量表达蛋白质的含量北京燕化永乐农药有限公司开发生产)可以通过其中氨基酸的含量表达本实验测定样品中1.2方法和步骤的真菌多糖(分子式为(CHO)(CHO)RNH6126n6105n2糖与蒽酮的硫酸溶液共热生成具有醌式结构的黄绿色其中RNH代表挂在多糖上的蛋白质片断)采用常规2收稿日期2005-10-08修返日期2005-11-21作者简介李楠中国农业大学理学院应用化学系教授E-maillinan@cau.edu.cn 第9期李楠等分光光度法分析生物农药0.5%菇类蛋白多糖水剂609或蓝绿色化合物颜色强度与含糖量成正比用分光光2茚三酮法测定蛋白质与氨基酸含量[7]度法比色测定样品中的蛋白质与氨基酸在水合茚三酮抗坏血酸1.2.1标准溶液的制备作用下呈蓝紫色用分光光度法测定其含量蒽酮-硫酸溶液将0.1g蒽酮溶于100ml98%硫酸中2.1仪器与药品(现用现配)722型分光光度计20ml具塞刻度比色管分析天葡萄糖标准溶液称取250mg干燥的葡萄糖移入平水合茚三酮正丁醇乙二醇异丙醇冰醋250ml容量瓶中用蒸馏水定容配制成1mg/ml浓度的酸(以上试剂均为A.R.级由北京化工厂生产)亮氨酸溶液用移液管移取10ml上述溶液于100ml容量瓶中(A.R.上海康达氨基酸厂)乙酸钠(A.R.北京刘李店用蒸馏水稀释至刻度摇匀化工厂)抗坏血酸(A.R.上海政翔化学试剂研究所)1.2.2样品的处理正丙醇(A.R.北京化学试剂公司)称取1.000g样品(精确至0.002g)于10ml离心管中2.2标准溶液的配制加入3ml乙醇摇匀置于(41)冰箱中醇析12h2.2.1乙酸-乙酸钠缓冲溶液的配制醇析后以2500r/min离心5min分离上清液沉淀再用称取乙酸钠54.4g加入100ml无氨蒸馏水在电炉乙醇冲洗3次用乙醚冲洗1次并离心每次用量3ml上加热至沸使体积蒸发至原体积的一半冷却后加入离心后各次上清液合并倒入瓷蒸发皿中弃去沉淀30ml冰乙酸用无氨蒸馏水稀释至100ml蒸发皿中的溶液在80水浴上蒸干逐尽多余的乙醇和乙2.2.2水合茚三酮溶液的配制醚蒸干的含糖的残留物用5ml50左右的蒸馏水溶称取0.6g水合茚三酮加入15ml正丙醇搅动使解冷却至室温后转入20ml比色管中用少量水洗净其溶解再加入30ml正丁醇60ml乙二醇最后加入蒸发皿洗涤液全部转入比色管中最后稀释至刻9ml缓冲溶液混匀处于棕色瓶中置于冰箱中保存度摇匀备用有效期7d1.2.3标准曲线的绘制2.2.310%异丙醇溶液的配制吸取葡萄糖标准溶液0.20.40.60.81.0ml量取10ml异丙醇加入到90ml无氨蒸馏水中摇匀分别注入20ml比色管中用蒸馏水补充至2ml沿管2.2.40.3%抗坏血酸溶液配制壁加入5ml蒽酮硫酸溶液不要摇动每一支试管加入称取150mg抗坏血酸溶于50ml无氨蒸馏水中随试剂后立即置于冰水中待在所有样品中加完试剂后用随配再逐一摇匀随即将试管迅速全部放入沸水中加热3min后取出并迅速用流动水冷却显色液以10mm光2.2.5亮氨酸标准溶液的配制径比色皿在波长620nm处以蒸馏水作为空白试验测称取干燥过的亮氨酸标准品0.0500g(精确到0.0002g)定并记录各吸光值以葡萄糖含量为横坐标吸光度溶于10%异丙醇中再用该异丙醇溶液稀释至100ml取为纵坐标绘制工作曲线获得回归方程和相关系此溶液10ml用无氨蒸馏水稀释到50ml摇匀数y=0.0011x+0.014R2=0.99622.2.6标准曲线的绘制分别吸取标准氨基酸溶液00.40.60.81.01.2.4样品测定吸取待测液0.6ml(5次重复)于20ml比色管中用蒸1.2ml分别置于20ml刻度试管中用无氨蒸馏水补足到2.0ml加入3ml水合茚三酮试剂0.1ml0.3%抗坏血馏水补充到2.0ml加蒽酮试剂5ml然后按照1.2.3方法操作比色测定记录吸光度通过回归方程计算或在标酸溶液摇匀置于沸水中加热15min然后迅速取准曲线上查出含糖量出置于冷水中冷却并摇动当待测液呈紫色时用60%(v/v)乙醇稀释至10ml混匀用10mm光径比色1.2.5回收率实验皿在波长580nm下测定其吸光度值5次重复以取已知多糖含量的样品1.0g(精确到0.0001g)加入吸光度为纵坐标以氨基酸含量为横坐标绘制氨基酸葡萄糖标准品0.005g(精确到0.0001g)5次重复分别标准曲线获得回归方程和相关系数y=0.0093x-0.0106以1.2.2和1.2.4方法进行样品处理和含量测定获得数据R2=0.9936后计算回收率2.2.7样品测定1.2.6准确性实验称取样品0.500g(精确至0.0001g)用无氨蒸馏水稀取样品5份分别以上述1.2.2和1.2.4方法进行测定释至50ml摇匀待测获得数据后计算标准偏差RSD值 610农药Agrochemicals第45卷取上述待测液0.6ml置于20ml具塞刻度比色管中3表4氨基酸添加回收率实验结果次重复用无氨蒸馏水补充到2.0ml摇匀然后按照2.2.6的方法进行比色测定记录吸光度在标准曲线上查出氨基酸的含量2.2.8回收率实验取已知氨基酸含量的样品0.5g(精确到0.0001g)加抗坏血酸用量的确定茚三酮显色法测定氨基酸的入亮氨酸标准品0.0015g(精确到0.0001g)5次重复分含量时所使用的抗坏血酸溶液浓度由传统方法的0.1%别以2.2.7方法进行样品处理和含量测定获得数据后计改为0.3%结果表明抗坏血酸溶液的浓度增大后算回收率灵敏度明显提高标准曲线线性关系更好2.2.9准确率实验实验过程中测定体系中如果有游离氨或NH+离子4取样品5份分别以2.2.7方法进行含量测定获得存在都可能影响测定导致测定结果偏大因此实验中数据后计算标准偏差RSD值所用蒸馏水应为无氨蒸馏水以排除干扰3结果与讨论用此方法对17批样品进行了分析醇溶糖含量在3.1醇溶糖分析结果与讨论0.46%~0.82%之间绝大部分样品含量在0.40%~0.60%之蒽酮显色法测定糖含量的实验其准确性实验中间氨基酸含量最低为0.1%最高为1.46%绝大部RSD为3.21%(n=5)结果表明该测定方法重现性良分样品含量在0.25%~0.40%之间好(见表1)根据要求0.5%菇类蛋白多糖水剂中醇溶性多糖的表1蒽酮-硫酸法测定醇溶糖类准确性实验结果含量应在0.5%以上蛋白与氨基酸的含量应在0.3%以上实验中所用样品的来源为生产厂家进行生产工艺调试过程中的产品由于产品批次不同生产工艺有所变动各批次产品的有效成分含量也有所变化方法的回收率实验结果实验得到的回收率为实验结果表明此方法简便准确回收率高97.93%RSD为1.34%(n=5)(见表2)精密度好可用于0.5%菇类蛋白多糖水剂的质量控制和表2醇溶糖类添加回收率实验结果生产工艺研究参考文献[1]杜小凤,徐建明,王伟中,等.植物源农药研究进展[J].农药,2000,39(11):8-10.[2]杜顺堂,朱明军,梁世中.生物农药多杀菌素的研究进展[J].农药,2005,44(10):441-444.[3]徐汉虹,张志祥,查友贵.中国植物性农药开发前景[J].农药,蒽酮显色法测定糖的加热过程其时间宜控制在2003,42(3):1-9.3~5min加热时间过长易导致溶液变灰暗或灰黑测[4]金林红,宋宝安,杨松,等.天然产物抗植物病毒剂国内外研得吸光度值偏低此外蒽酮-硫酸溶液用量在5ml时究进展[J].农药,2003,42(4):10-12.[5]陈耀祖.有机分析[M].北京:高等教育出版社,1981:369.最适宜若用量过大可能导致溶液变为暗红色且结果[6]李绍平,黄赵刚.蒽酮-硫酸法测定亮菌糖浆中多糖的含量[J].不呈线性中草药,2002,33(3):233-234.3.2蛋白质与氨基酸分析结果与讨论[7]刘黎.氨基酸混合体系的PLS分光光度法测定[J].化学研究与应用,1999,11(6):646-649.茚三酮法测定氨基酸含量的实验其准确性实验责任编辑夏彩云中RSD为3.50%(n=5)结果表明该测定方法重现农药残留实现微生物降解性良好(见表3)日前由福建安溪县农业与茶果局和南京农业大学合表3茚三酮法测定蛋白质与氨基酸含量准确性实验结果作的茶园土壤和茶树农药残留微生物降解菌剂试验取得成功效果明显农药残留微生物降解菌剂是由南京农业大学历经16年研究创造出来的新型生物修复新技术主要通过应用微生物含有的一些酶类来降解土壤与农作物中方法的回收率实验结果实验得到的回收率为的农药残留对土壤中滴滴涕和植株上的溴氰菊酯等农药94.61%RSD为1.70%(n=5)(见表4)残留起到高效的降解作用有效改善土壤品质(ZP)'