可见紫外外分光光度法

'第二章紫外-可见分光光度分析法 颜色的产生白光(太阳光)：由各种单色光组成的复合光吸光光度法的基本原理 能复合成白光的两种颜色的光叫互补色光。物质所显示的颜色是吸收光的互补色。 光的波长λ(cm)、频率γ(Hz)，它们与光速c的关系是：一、光的基本性质在真空介质中，光速为2.9979×1010cm/s。单个光子能吸收或发射能量时，能量E与上述三要素的关系是：E－－光子的能量；h－－普朗克常数（6.625×10－34J·s） 二、能级与跃迁分子中的电子总是处在某一运动状态中，每一种状态都具有一定的能量，属于一定能级。当它得到时，电子由于受到光、热、电等的激发，得到适当的能量，从一个能级转移到另一个能级，称为跃迁。 分子能级跃迁分子能级跃迁较原子能级跃迁更为复杂。分子内部除了电子运动状态外，还有核间的相对运动，即核的振动和分子围绕着重心的转动。振动能变化、转动能变化以及电子运动能量变化 有色溶液的颜色为什么会有深浅？ 1、同一种物质对不同波长的光吸收能力是否存在差异？2、不同的物质对相同波长的光的吸收是否存在差异？分子只会选择吸收满足能级差能量的波长各种分子内部结构不同，分子的能级也千差万别，各种能级之间的间隔也互不相同，这样就决定了它们对不同波长的光线的选择性吸收。 吸收曲线改变通过某一吸收物质的入射光的波长，并记录某物质在每一波长处的吸光度（A），然后以波长为横坐标，以吸光度为纵坐标作图，这样的谱图称为该物质的吸收光谱或吸收曲线。反映了它在不同的光谱区域内吸收能力的分布，可以从波形，波峰的强度、位置及数目来了解物质内部信息 叶绿素的结构和吸收光谱 吸收曲线的讨论（1）同一种物质对不同波长光的吸光度不同。吸光度最大处对应的波长称为最大吸收波长λmax（2）不同浓度的同一种物质，其吸收曲线形状相似λmax不变。（3）而对于不同物质，它们的吸收曲线形状不同。（4）不同浓度的同一种物质，在某一定波长下吸光度A有差异，在λmax处吸光度A的差异最大。（5）吸光度具有加和性，A=A1+A2+A3+……。 三、比色法通过显色反应，比较待测溶液与标准溶液颜色的深浅来确定待测物质的含量为比色法。目视比色法光电比色法分子吸收分光光度法（分光光度分析法） 分光光度分析法是以物质对光的选择性吸收为基础的分析方法。根据物质所吸收光的波长范围不同紫外分光光度法可见分光光度法 几乎所有的无机离子和许多有机化合物可以用分光光度法进行测定。如微生物培养基中的氮、磷以及各种微量元素的测定。通常，待测物质的含量1～10－5％时，能够用分光光度法准确测定。所以它主要用于测定微量组分。 分光光度分析法：基于发射的电磁辐射与待测物质相互作用后所产生的辐射信号与物质组成及结构关系所建立起来的分析方法。光源单色器样品检测器 1、一般光分析法均包含三个基本过程；（1）能源提供能量；（2）能量与被测物之间的相互作用；（3）产生信号。2、选择性测量，不涉及混合物分离（不同于色谱分析）；3、涉及大量光学元器件。基本特点： 第二节紫外可见分光光度计 仪器紫外-可见分光光度计 一、基本组成generalprocess光源单色器样品室检测器显示1.光源在整个紫外光区或可见光谱区可以发射连续光谱，具有足够的辐射强度、较好的稳定性、较长的使用寿命。可见光区：钨灯作为光源，其辐射波长范围在320～2500nm。紫外区：氢、氘灯。发射185～400nm的连续光谱。 2.单色器（波长选择器）将光源发射的复合光分解成单色光并可从中选出一任波长单色光的光学系统。①入射狭缝：光源的光由此进入单色器；②准光装置：透镜或返射镜使入射光成为平行光束；③色散元件：将复合光分解成单色光；棱镜或光栅；④聚焦装置：透镜或凹面反射镜，将分光后所得单色光聚焦至出射狭缝；⑤出射狭缝。 光栅和棱镜分光原理 3.样品室样品室放置各种类型的吸收池（比色皿）和相应的池架附件。吸收池主要有石英池和玻璃池两种。在紫外区须采用石英池，可见区一般用玻璃池。4.检测器利用光电效应将透过吸收池的光信号变成可测的电信号，常用的有光电池、光电管或光电倍增管。5.结果显示记录系统检流计、数字显示、微机进行仪器自动控制和结果处理 二、分光光度计的类型1.单光束简单，价廉，适于在给定波长处测量吸光度或透光度，一般不能作全波段光谱扫描，要求光源和检测器具有很高的稳定性。2.双光束自动记录，快速全波段扫描。可消除光源不稳定、检测器灵敏度变化等因素的影响，特别适合于结构分析。仪器复杂，价格较高。 3.双波长将不同波长的两束单色光(λ1、λ2)快束交替通过同一吸收池而后到达检测器。产生交流信号。无需参比池。△=1～2nm。两波长同时扫描即可获得导数光谱。 A原理 双光束光度计动画示意动画 双波长光度计光路示意图 四、光的吸收定律1.朗伯—比耳定律布格(Bouguer)和朗伯(Lambert)先后于1729年和1760年阐明了光的吸收程度和吸收层厚度的关系。1852年比耳(Beer)又提出了光的吸收程度和吸收物浓度之间也具有类似的关系。A∝c 朗伯定律：A=K2*L 比尔定律：A=K3*C 透过光的强度It；与入射光的强度Io比之比称为透光度或透光率，用T表示。T＝It/Io 朗伯-比尔定律的表达式A＝lg（I0/It)=kLc式中A：吸光度；描述溶液对光的吸收程度；L：液层厚度(光程长度)，通常以cm为单位；c：溶液的摩尔浓度，单位mol·L－１；k：摩尔吸光系数，单位L·mol－１·cm－１；或:A＝lg（I0/It)=aLcc：溶液的浓度，单位g·L－１a：吸光系数，单位L·g－１·cm－１a与k的关系为：a=k/M（M为摩尔质量） 透光度透过度T:描述入射光透过溶液的程度:T=It/I0吸光度A与透光度T的关系:A＝－lgT朗伯—比耳定律是吸光光度法的理论基础和定量测定的依据。应用于各种光度法的吸收测量；摩尔吸光系数k在数值上等于浓度为1mol/L、液层厚度为1cm时该溶液在某一波长下的吸光度；吸光系数a(L·g-1·cm-1）相当于浓度为1g/L、液层厚度为1cm时该溶液在某一波长下的吸光度。 2.摩尔吸光系数k的讨论（1）吸收物质在一定波长和溶剂条件下的特征常数，可作为定性鉴定的参数；（2）不随浓度c和光程长度L的改变而改变。在温度和波长等条件一定时，k仅与吸收物质本身的性质有关，与待测物浓度无关；（3）同一吸收物质在不同波长下的k值是不同的。在最大吸收波长λmax处的摩尔吸光系数，常以kmax表示。kmax表明了该吸收物质最大限度的吸光能力，也反映了光度法测定该物质可能达到的最大灵敏度。 摩尔吸光系数的讨论（4）kmax越大表明该物质的吸光能力越强，用光度法测定该物质的灵敏度越高。k>105：超高灵敏；k=(6～10）×104：高灵敏；k<2×104：不灵敏。（5）k在数值上等于浓度为1mol/L、液层厚度为1cm时该溶液在某一波长下的吸光度。 3.偏离朗伯—比耳定律的原因标准曲线法测定未知溶液的浓度时，发现：标准曲线常发生弯曲（尤其当溶液浓度较高时），这种现象称为对朗伯—比耳定律的偏离。引起这种偏离的因素（两大类）：（1）物理性因素，即仪器的非理想引起的；（2）化学性因素。 （1）物理性因素难以获得真正的纯单色光。朗—比耳定律的前提条件之一是入射光为单色光。分光光度计只能获得近乎单色的狭窄光带。复合光可导致对朗伯—比耳定律的正或负偏离。非单色光、杂散光、非平行入射光都会引起对朗伯—比耳定律的偏离，最主要的是非单色光作为入射光引起的偏离。 非单色光作为入射光引起的偏离假设由波长为λ1和λ2的两单色光组成的入射光通过浓度为c的溶液，则：A1＝lg（Ｉo1/Ｉt1）＝k1LcA2＝lg(Ｉo2/Ｉt2）＝k2Lc故：式中：Ｉo1、Ｉo2分别为λ1、λ2的入射光强度；Ｉt1、Ｉt2分别为λ1、λ2的透射光强度；k1、k2分别为λ1、λ2的摩尔吸光系数；因实际上只能测总吸光度A总，并不能分别测得A1和A2，故 A总＝lg（Ｉo总/Ｉt总)＝lg(Io1+Ｉo2)/(Ｉt1+Ｉt2）＝lg(Io1+Ｉo2)/(Ｉo110-k1Lc+Ｉo210-k2Lc）令：k1-k2＝；设：Ｉo1＝Ｉo2A总＝lg(2Io1)/Ｉt1(1＋10-kLc）＝A1+lg2-lg(1＋10-kLc)讨论:因实际上只能测总吸光度A总，并不能分别测得A1和A2，故： 讨论:A总=A1+lg2-lg(1＋10－kLc)(1)=0；即：k1=k2=k则：A总＝lg（Ｉo/Ｉt）＝kLc(2)k≠0若k<0；即k20,lg(1＋10kLc)值随c值增大而增大，则标准曲线偏离直线向c轴弯曲，即负偏离；反之，则向A轴弯曲，即正偏离。 讨论:A总=A1+lg2-lg(1＋10－kLc)(3)｜k｜很小时，即k1≈k2：可近似认为是单色光。在低浓度范围内，不发生偏离。若浓度较高，即使｜k｜很小，A总≠Ａ1，且随着c值增大，A总与A1的差异愈大，在图上则表现为A—c曲线上部(高浓度区)弯曲愈严重。故朗伯—比耳定律只适用于稀溶液。(4)为克服非单色光引起的偏离，首先应选择比较好的单色器。此外还应将入射波长选定在待测物质的最大吸收波长且吸收曲线较平坦处。 (2)化学性因素朗—比耳定律的假定：所有的吸光质点之间不发生相互作用；假定只有在稀溶液(c<10-2mol/L)时才基本符合。当溶液浓度c>10－2mol/L时，吸光质点间可能发生缔合等相互作用，直接影响了对光的吸收。故：朗伯—比耳定律只适用于稀溶液。溶液中存在着离解、聚合、互变异构、配合物的形成等化学平衡时。使吸光质点的浓度发生变化，影响吸光度。例：铬酸盐或重铬酸盐溶液中存在下列平衡：CrO42-＋2H＋=Cr2O72-＋H2O溶液中CrO42-、Cr2O72-的颜色不同，吸光性质也不相同。故此时溶液pH对测定有重要影响。 4、吸光度的加和性当溶液中含有多种对光产生吸收的物质，且各组分间不存在相互作用时，则该溶液对光的总吸光度等于每一成分的吸光度之和。使多组分定量测定成为可能 紫外-可见分光光度法中条件的选择 一、显色反应的选择1.选择显色反应时，应考虑灵敏度高、选择性高、生成物稳定、显色剂在测定波长处无明显吸收，两种有色物最大吸收波长之差：“对比度”，要求△>60nm。2.配位显色反应当金属离子与有机显色剂形成配合物时，通常会发生电荷转移跃迁，产生很强的紫外—可见吸收光谱。 3.氧化还原显色反应某些元素的氧化态，如Mn（Ⅶ）、Cr（Ⅵ）在紫外或可见光区能强烈吸收，可利用氧化还原反应对待测离子进行显色后测定。例如：钢中微量锰的测定，Mn2＋不能直接进行光度测定2Mn2＋＋5S2O82-＋8H2O=2MnO4＋+10SO42-＋16H+将Mn2＋氧化成紫红色的MnO4＋后，在525nm处进行测定。 4.显色剂无机显色剂：硫氰酸盐、钼酸铵、过氧化氢等几种。有机显色剂：种类繁多偶氮类显色剂：本身是有色物质，生成配合物后，颜色发生明显变化；具有性质稳定、显色反应灵敏度高、选择性好、对比度大等优点，应用最广泛。偶氮胂Ⅲ、PAR等。三苯甲烷类：铬天青S、二甲酚橙等 二、显色反应条件的选择1.显色剂用量吸光度A与显色剂用量CR的关系会出现如图所示的几种情况。选择曲线变化平坦处。2.反应体系的酸度在相同实验条件下，分别测定不同pH值条件下显色溶液的吸光度。选择曲线中吸光度较大且恒定的平坦区所对应的pH范围。3.显色时间与温度实验确定4.溶剂一般尽量采用水相测定， 三、共存离子的消除1.加入掩蔽剂选择掩蔽剂的原则是：掩蔽剂不与待测组分反应；掩蔽剂本身及掩蔽剂与干扰组分的反应产物不干扰待测组分的测定。例：测定Ti4＋，可加入H3PO4掩蔽剂使Fe3+(黄色)成为Fe(PO４)23-(无色)，消除Fe3+的干扰；又如用铬天菁S光度法测定Al3+时，加入抗坏血酸作掩蔽剂将Fe3+还原为Fe2+，消除Fe3+的干扰。2.选择适当的显色反应条件3.分离干扰离子 四、测定条件的选择1.选择适当的入射波长一般应该选择λmax为入射光波长。如果λmax处有共存组分干扰时，则应考虑选择灵敏度稍低但能避免干扰的入射光波长。 2.选择合适的参比溶液为什么需要使用参比溶液？测得的的吸光度真正反映待测溶液吸光强度。参比溶液的选择一般遵循以下原则：⑴若仅待测组分与显色剂反应产物在测定波长处有吸收，其它所加试剂均无吸收，用纯溶剂（水)作参比溶液；⑵若显色剂或其它所加试剂在测定波长处略有吸收，而试液本身无吸收，用“试剂空白”(不加试样溶液)作参比溶液； 参比溶液的选择一般遵循以下原则：⑶若待测试液中杂质在测定波长处有吸收，而待测样品与显色剂等均无吸收，则可用“试样空白”(不加显色剂)作参比溶液； 3.控制适宜的吸光度（读数范围）不同的透光度读数，产生的误差大小不同：－lgT=kLc微分：－dlgT＝－0.434dlnT=-0.434dT/T=kLdc两式相除得：dc/c=（0.434/TlgT）dT以有限值表示可得：Δc/c=（0.434/TlgT）ΔT浓度测量值的相对误差（Δc/c）不仅与仪器的透光度误差ΔT有关，而且与其透光度读数T的值也有关。是否存在最佳读数范围？何值时误差最小？ 最佳读数范围与最佳值设：ΔT=1%，则可绘出溶液浓度相对误差Δc/c与其透光度T的关系曲线。如图所示：当：ΔT=1%，T在20%～65%之间时，浓度相对误差较小，最佳读数范围。可求出浓度相对误差最小时的透光度Tmin为：Tmin＝36.8%,Amin＝0.434用仪器测定时应尽量使溶液透光度值在T%=20～65%(吸光度A=0.70～0.20)。 定量分析 一、对单一物质的分析比较法标准曲线法 比较法在相同条件下配制样品溶液和与待测组分浓度相近的标准溶液，在相同实验条件下测得吸光值Ax和As，然后进行比较。Cx=Cs*(Ax/As) 标准曲线法配制一系列不同浓度的标准试样，以空白溶液调零，由低到高依次分析其吸光度值A，将获得的吸光度A数据对应于浓度c作标准曲线，在相同条件下测定试样的吸光度A数据，在标准曲线上查出对应的浓度值；或由标准试样数据获得线性方程，将测定试样的吸光度A数据代入计算。注意在高浓度时，标准曲线易发生弯曲. 二、两个以上组分的定量分析1、混合物的吸收光谱不重叠或部分重叠选择适当的波长，按单一组分的方法测定 2、吸收曲线重叠根据吸光度的加和性来处理。在两个最大波长处测得吸光值A1和A2 利用双波长分光光度法进行定量分析波长的选择 四、分子吸收光谱与分子结构1．紫外—可见吸收光谱有机化合物的紫外—可见吸收光谱，是其分子中外层价电子跃迁的结果（三种）：σ电子、π电子、n电子。分子轨道理论：一个成键轨道必定有一个相应的反键轨道。通常外层电子均处于分子轨道的基态，即成键轨道或非键轨道上。外层电子吸收紫外或可见辐射后，就从基态向激发态(反键轨道)跃迁。主要有四种跃迁所需能量Δk大小顺序为：n→π＊<π→π＊200nm。这类跃迁在跃迁选律上属于禁阻跃迁，摩尔吸光系数一般为10～100L·mol-1·cm-1，吸收谱带强度较弱。分子中孤对电子和π键同时存在时发生n→π＊跃迁。丙酮n→π＊跃迁的λ为275nmkmax为22L·mol-1·cm-1（溶剂环己烷)。 生色团与助色团生色团：最有用的紫外—可见光谱是由π→π＊和n→π＊跃迁产生的。这两种跃迁均要求有机物分子中含有不饱和基团。这类含有π键的不饱和基团称为生色团。简单的生色团由双键或叁键体系组成，如乙烯基、羰基、亚硝基、偶氮基—N＝N—、乙炔基、腈基—C㆔N等。助色团：有一些含有n电子的基团(如—OH、—OR、—NH２、—NHR、—X等)，它们本身没有生色功能(不能吸收λ>200nm的光)，但当它们与生色团相连时，就会发生n—π共轭作用，增强生色团的生色能力(吸收波长向长波方向移动，且吸收强度增加)，这样的基团称为助色团。 红移和蓝移有机化合物的吸收谱带常常因引入取代基或改变溶剂使最大吸收波长λmax和吸收强度发生变化:λmax向长波方向移动称为红移，向短波方向移动称为蓝移(或紫移)。吸收强度即摩尔吸光系数k增大或减小的现象分别称为增色效应或减色效应，如图所示。 吸光度读数在范围内，测量较准确。A．0～1B．0.2～0.7C．0～0.80.15～1.5 分光光度计产生单色光的元件是：A．光栅＋狭缝B．光栅C．狭缝D．棱镜 分光光度计测量吸光度的元件是：A．棱镜B．光电管C．钨灯D．比色皿 摩尔吸光系数与吸光系数的转换关系：A．a＝M·kB．k＝M·aC．a＝k／MD．A＝M·/k 一般分析仪器应预热A．5分钟B．10～20分钟C．1小时D．不需预热 .常规分析一般平行测定次数:A．6次B．3次C．1次D．20次 分光光度法测定实验中，绘制工作曲线标准系列至少要几个点2个3个4个5个 符合Lambert－Beer定律的某有色溶液，当有色物质的浓度增加时，最大吸收波长和吸光度分别是(A)不变、增加(B)不变、减小(C)向长波移动、不变(D)向短波移动、不变 标准工作曲线不过原点的可能的原因是(A)显色反应得酸度控制不当(B)显色剂得浓度过高(C)吸收波长选择不当(D)参比溶液选择不当'