比色法和分光光度法

'一.概述(1)比色法和可见分光光度法的特点比色法:在分析化学中,利用比较有色溶液颜色的深浅来测定物质含量的分析方法称为比色法。过去大多用眼睛观察比较,故又称目视比色法。第二节比色法和可见分光光度法 光电比色法(分光光度法):随着近代分析仪器的发展,目前已普遍使用光电比色计(分光光度计)通过测量有色溶液对入色光的吸收程度对物质进行分析,称为光电比色法(分光光度法)。 与目视比色法相比,光度法的特点:①灵敏度高;10-5~10-6mol/L②准确度较高;③仪器设备较简单,操作简便、快速；④应用广泛。 (2)光的性质和物质的颜色光的性质:光是一种电磁波,具有波粒二象性。光的波动性可用波长来描述,其单位常用纳米(nm)表示,波长越短,能量越高。 具有同一波长的光称为单色光,由不同波长光组成的光称为复合光。 互补色光:若将两种颜色的光按适当的强度比混合可成白光,那么这两种光称为互补色光。 物质的颜色:物质对光的吸收是具有选择性的。当一束白光通过溶液时,若溶液对各种色光都不吸收,则白光全部通过,溶液呈无色透明;若各种色光几乎全被吸收,则溶液呈黑色;若溶液只吸收某种色光,则溶液呈透过光的颜色,也就是说,溶液呈吸收光的互补色光的颜色。 例如,白光通过CuSO4溶液时,溶液颜色为蓝色。 吸收曲线:为了精确表明溶液对不同波长光的吸收情况,可将不同波长的单色光依次通过某一固定浓度的有色溶液,测量该溶液对各单色光的吸收程度,即吸光度,以波长为横坐标,吸光度为纵坐标作图所得曲线,即为吸收曲线,或称吸收光谱。 二、朗伯-比尔定律(1)朗伯-比尔定律透光度(透光率T):吸光度(A):朗伯-比尔定律: 此式表明:当一束平行的单色光通过吸光物质的均匀溶液时,溶液的吸光度与溶液浓度和液层厚度的乘积成正比。K:比例常数,与入射光波长,溶液中吸光物质的本性及溶液的温度有关。 (2)吸光系数当b以cm,c以g/L为单位,K为吸光系数,用符号a表示,单位为L/g·cmA=abc当b以cm,c以mol/L为单位时,K为摩尔吸光系数,用符号ε表示,单位为L/mol·cmA=εbca与ε的关系: 比吸光系数():指质量浓度为1%(g/mL),b为1cm时的吸光度值,单位为mL/g·cm同一物质的ε与之间的关系: 例1一含Fe2+浓度为0.5mg/L的溶液,用邻二氮菲显色测定,吸收池厚度为2cm,在508nm处测得吸光度为0.19,求其摩尔吸光系数和比吸光系数。 (3)偏离朗伯-比尔定律的原因标准曲线:根据朗伯-比尔定律,当吸收池厚度不变,以吸光度为纵坐标,浓度为横坐标作图时,应得到一条通过原点的直线,称为校正曲线或标准曲线。 偏离朗伯-比尔定律的主要原因:①定律仅适用于稀溶液②化学变化引起的偏离(正偏离)③非单色入射光引起的偏离(负偏离) 三.方法和仪器(1)目视比色法目视比色法:用眼睛观察比较溶液颜色深度以测量物质含量的分析方法称为目视比色法。 标准系列法的原理:朗伯-比尔定律对标准系列法原理的解释:A=εsbscs=εxbxcx 标准系列法的优点:①仪器简单,操作简便,适宜于大批试样分析②适宜于稀溶液中微量组分的测定③某些不完全符合朗伯-比尔定律的显色反应,仍可用此法进行测定。标准系列法的缺点:准确度较差。 (2)光电比色法和可见分光光度法①光电比色法的原理:所用仪器为光电比色计。光源→滤光片→一定波长范围的近似单色光→有色溶液→透过光→光电池→检流计的标盘 可见分光光度法所用的仪器称为分光光度计,它是利用分光能力很强的棱镜或光栅的原理,作为单色器,可连续获得不同波长的单色光,其波长范围比用滤光片获得的更窄。因此用分光光度计可连续测量某一定浓度有色溶液在不同波长下的吸光度,从而可得其吸收光谱,通过吸收光谱可选择最适宜的测定波长。 所以分光光度计采用适当的光源和检测器,使测量的范围不只局限于可见光区。如用红外光作为光源成为红外分光光度法;用紫外线作为光源称为紫外分光光度法。 ②光电比色计和可见分光光度计的基本部件光源单色器吸收池检测器指示器 a.光源要求:光源须具有足够的辐射强度,且稳定性好。钨灯是可见分光光度计常用的光源。 b.单色器光电比色计:用滤光片获得单色光。选择滤光片的原则是:滤光片最易透过的光应是有色物质最易吸收的光,即滤光片的颜色与溶液的颜色应为互补色;也可以使用不同的滤光片测量同一有色溶液的吸光度,测得吸光度最大时所用的滤光片就是最适宜的滤光片。 分光光度计:单色器由棱镜或光栅、狭缝和准直镜等部分组成。棱镜:色散元件,有石英或玻璃两种,它们对不同波长光具有不同的折射率。石英棱镜对紫外光分光效果好,玻璃棱镜对可见光分光效果好,因为玻璃对紫外光有吸收,故不能用于紫外光区。 光栅:色散元件,利用光的衍射和干涉原理制成。当白光通过密刻平行条痕的光栅后,将不同波长的光色散成连续光谱。具有波长范围宽、色散均匀、分辨本领高等优点。 c.吸收池(比色皿)用于盛装被测试液和参比溶液。按制作材料不同分为石英吸收池和玻璃吸收池。 d.检测器作用:是将光强度信号转换为可测电信号,常见检测器有光电池和光电管。光电池:国产581-G型光电比色计及72型分光光度计。 优点:光电池灵敏度较高,产生的光电池不需要经过放大便可直接用灵敏检流计测量。缺点:光电池经强光照射或连续使用时间过长,易产生“疲劳现象”,导致灵敏度降低,遇此情况,应暂停使用并避光放置,待其复原后再用。 光电管:国产721型分光光度计 e.指示器 (3)常用光电比色计和分光光度计光电比色计:国产581-G型,仪器通常配有红色、绿色、蓝色三块滤光片,其透过光的最大波长分别在650、530和440mm左右。 可见光光度计:国产721型分光光度计 四、显色反应及其影响因素显色反应:将被测组分转变为有色化合物的反应称为显色反应。显色剂:使被测组分显色的试剂称为显色剂。 (1)对显色反应的要求①选择性好②灵敏度高③有色化合物组成恒定④有色化合物的化学性质稳定⑤显色剂在测定波长处无明显吸收 (2)显色剂显色剂可分为无机显色剂和有机显色剂两大类。由于大多数有机显色剂能与金属离子形成稳定的有特征颜色的螯合物,灵敏度较高,选择性也较好。因此,在比色分析和光度分析中主要选用有机显色剂。 两种常用的有机显色剂：①邻二氮菲其结构式为这是目前广泛用于测定Fe2+的较好的显色剂。先用盐酸羟胺把待测试液中的Fe3+还原为Fe2+,然后在pH5~6的条件下,与邻二氮菲反应,生成稳定的橙红色配合物，配合物的λmax为508nm.反应是特效的,灵敏度也较高，摩尔吸光系数ε为1.1×104L/mol.cm。 ②.双硫腙其结构式为 (3)影响显色反应的因素：①显色剂的用量：显色反应表示式:M+RMR(被测组分)(显色剂)(有色配合物)显色剂的用量应当适宜,其用量是通过实验确定。 实验方法为：固定被测组分的浓度和其它条件,改变显色剂在溶液中的浓度cR,分别测量吸光度(A),绘制A-cR曲线。 ②溶液的酸度适宜酸度范围确定方法：固定显色剂和被测组分的浓度,改变溶液的pH值,分别测量吸光度,绘制A-pH曲线。曲线平坦部分所对应的pH值即为适宜的酸度范围。 ③显色时间作吸光度-时间曲线,确定适宜的显色时间。④显色温度⑤溶剂的性质⑥共存离子的干扰及其消除 消除共存离子干扰的方法：a.控制溶液的酸度b.加入掩蔽剂c.分离干扰离子 五、光度测量条件的选择(1)选择合适波长的入射光①选被测有色物质的λmax为入射光②如在λmax处显色剂或干扰组分有明显的吸收,则应选灵敏度较低但能避免干扰的适宜波长的光作为入射光。 (2)选择适宜的参比溶液①.当被测溶液、显色剂及所用其他试剂均无色,可用纯溶剂作为参比溶液,称为溶剂空白。②.当显色剂无色而被测试液中存在其他有色离子时,可用不加显色剂的被测试液作为参比溶液,称为试样空白。③.当显色剂或其他试剂有色,可用显色剂或其他试剂作为参比溶液,称为试剂空白。 ④.用不含被测组分的试样,在相同条件下与被测试样同时进行处理,测吸光度时以前者所得溶液为参比溶液,称为平行操作空白。如临床上进行某种药物浓度的监测,取正常人血样和待测血药浓度的血样在相同条件下处理,用前者得到的溶液作为参比溶液。 (3)控制适当的吸光度读数范围适宜读数范围:吸光度A在0.15~1.0内，或透光度T值在0.10~0.70内。六.比色法和可见分光光度法的定量方法(1)校正曲线法(适用于经常性的批量分析）(2)标准对比法（标准品对照法）此法适宜于非经常性的分析工作。 当校正曲线通过零点时,将样品溶液和一标准溶液在选定实验条件下显色,测得吸光度分别为Ax和As,标准溶液的浓度为cs,则样品溶液的浓度cx可按下式求得： 在药物分析中,为了测定方便,通常使被测试样称样量和稀释倍数与标准试样一致,则被测试样的含量ω可由测量的两者吸光度的比求得,即 另外,在药物分析中,还常用与标准品的比吸光系数比较进行含量测定。如被测试样称样量和稀释倍数与标准品一致,在相同条件下,测得被测试样与标准品的比吸光系数分别为和则试样质量浓度为 七.比色法和可见分光光度法在医学检验中的应用全血中铁的测定全血中铁的测定需要先将各种形式的铁转化为游离的Fe3+离子。通常用消化法,蛋白质用钨酸沉淀除去,取无蛋白的滤液,在一定条件下加KSCN显色剂,生成血红色配合物,反应式为 在520nm波长处或用蓝绿色滤光片测量吸光度,与标准溶液比较,求出含量。'