GB541337-2010食品安全国家标准乳和乳制品中黄曲霉毒素M1的测定.pdf

'中华人民共和国国家标准GB5413.37—2010食品安全国家标准乳和乳制品中黄曲霉毒素M1的测定NationalfoodsafetystandardDeterminationofaflatoxinM1inmilkandmilkproducts2010-03-26发布2010-06-01实施中华人民共和国卫生部发布 GB5413.37—2010前言本标准第一法对应于ISO14501：2007Milkandmilkpowder-determinationofaflatoxinM1content-clean-upbyimmunoaffinitychromatographyanddeterminationbyhigh-performanceliquidchromatography，本标准第一法与ISO14501：2007的一致性程度为非等效；本标准第二法和第三法代替GB/T18980-2003；本标准第四法来自于NY/T1664-2008《牛乳中黄曲霉毒素M1的快速检测双流向酶联免疫法》。本标准附录A和附录B为资料性附录。I GB5413.37—2010食品安全国家标准乳和乳制品中黄曲霉毒素M1的测定1范围本标准规定了乳和乳制品中黄曲霉毒素M1的测定方法。标准第一法适用于乳和乳制品中黄曲霉毒素M1的测定；第二法适用于乳、乳粉，以及低脂乳、脱脂乳、低脂乳粉和脱脂乳粉中黄曲霉毒素M1的测定；第三法适用于乳和乳粉中黄曲霉毒素M1的测定；第四法适用于液态乳和乳粉中黄曲霉毒素M1的测定。2规范性引用文件本标准中引用的文件对于本标准的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本标准。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本标准。第一法免疫亲和层析净化液相色谱—串联质谱法3原理试样液体或固体试样提取液经均质、超声提取、离心，取上清液经免疫亲和柱净化，洗脱液经氮气吹干，定容，微孔滤膜过滤，经液相色谱分离，电喷雾离子源离子化，多反应离子监测（MRM）方式检测。基质加标外标法定量。4试剂和材料除非另有规定，本方法所用试剂均为分析纯，水为GB/T6682规定的一级水。4.1甲酸（HCOOH）。4.2乙腈(CH3CN)：色谱纯。4.3石油醚（CnH2n+2）：沸程为30℃～60℃。4.4三氯甲烷（CHCl3）。4.5氮气：纯度≥99.9%。4.6黄曲霉毒素M1标准样品：纯度≥98%。4.7乙腈-水溶液(1+4)：在400mL水中加入100mL乙腈。4.8乙腈-水溶液(1+9)：在450mL水中加入50mL乙腈。4.90.1%甲酸水溶液：吸取1mL甲酸（4.1），用水稀释至1000mL。4.10乙腈-甲醇溶液（50+50）：在500mL乙腈中加入500mL甲醇。4.11氢氧化钠溶液（0.5mol/L）：称取2g氢氧化钠溶解于100mL水中。1 GB5413.37—20104.12空白基质溶液分别称取与待测样品基质相同的、不含所测黄曲霉毒素的阴性试样8份于100mL烧杯中。以下操作按6.1试液提取和6.2净化步骤进行。合并所得8份试样的纯化液，用0.22μm微孔滤膜的一次性滤头（5.23）过滤。弃去前0.5mL滤液，接取少量滤液供液相色谱－质谱联用仪检测。获得色谱－质谱图后，对照附录A中的图A.2，在相应的保留时间处，应不含黄曲霉毒素M1。剩余滤液转移至棕色瓶中，在-20℃电冰箱内保存，供配制标准系列溶液使用。4.13黄曲霉毒素M1标准储备溶液：分别称取标准品黄曲霉毒素M10.10mg（精确至0.01mg），用三氯甲烷（4.4）溶解定容至10mL。此标准溶液浓度为0.01mg/mL。溶液转移至棕色玻璃瓶中后，在-20℃电冰箱内保存，备用。4.14黄曲霉毒素M1标准系列溶液：吸取黄曲霉毒素M1标准储备溶液（4.13）10µL于10mL容量瓶中，用氮气将三氯甲烷吹至近干，空白基质溶液（4.12）定容至刻度，所得浓度为10ng/mL的M1标准中间溶液。再用空白基质溶液（4.12）将黄曲霉毒素M1标准中间溶液稀释为0.5ng/mL、0.8ng/mL、1.0ng/mL、2.0ng/mL、4.0ng/mL、6.0ng/mL、8.0ng/mL的系列标准工作液。5仪器和设备5.1液相色谱-质谱联用仪，带电喷雾离子源。5.2色谱柱：ACQUITYUPLCHSST31，柱长100mm，柱内径2.1mm；填料粒径1.8μm，或同等性能的色谱柱。5.3天平：感量为0.001g和0.00001g。5.4匀浆器。5.5超声波清洗器。5.6离心机：转速≥6000转/分钟。5.750mL具塞PVC离心管。5.8水浴:温控30℃士2℃，50℃士2℃，温度范围25℃～60℃。5.9容量瓶:100mL。5.10玻璃烧杯:250mL，50mL。5.11带刻度的磨口玻璃试管:5mL，10mL，20mL。5.12移液管:1.0mL，2.0mL和50.0mL。5.13玻璃棒。5.1410目圆孔筛。5.15250mL分液漏斗。5.16100mL圆底烧瓶。5.17旋转蒸发仪。1给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不表示对该产品的认可，如果其他等效产品具有相同的效果，则可使用这些等效的产品。2 GB5413.37—20105.18pH计：精度为0.01。5.19250mL具塞锥形瓶。5.20免疫亲和柱：针筒式3mL。5.2110mL和50mL一次性注射器。5.22固相萃取装置（带真空系统）。5.23一次性微孔滤头：带0.22μm微孔滤膜（水相系）。6分析步骤6.1试液提取6.1.1乳：称取50g(精确至0.01g)混匀的试样，置于50mL具塞离心管(5.7)中，在水浴(5.8)中加热到35℃～37℃。在6000转/分钟下离心15min。收集全部上清液，供净化用。6.1.2发酵乳(包括固体状、半固体状和带果肉型)：称取50g(精确至0.01g)混匀的试样，用0.5mol/L的氢氧化钠溶液（4.11）在酸度计(5.18)指示下调pH至7.4，在9500转/分钟下匀浆(5.4)5min，以下按6.1.1进行操作。6.1.3乳粉和粉状婴幼儿配方食品：称取10g(精确至0.01g)试样，置于250mL烧杯中。将50mL已预热到50℃的水加入到乳粉中，用玻璃棒将其混合均匀。如果乳粉仍未完全溶解，将烧杯置于50℃的水浴(5.8)中放置30min。溶解后冷却至20℃，移入100mL容量瓶中，用少量的水分次洗涤烧杯，洗涤液一并移入容量瓶中，用水定容至刻度，摇匀后分别移至两个50mL离心管(5.7)中，在6000转/分钟下离心15min，混合上清液，用移液管移取50mL上清液供净化处理用。6.1.4干酪：称取经切细、过10目圆孔筛混匀的试样5g(精确至0.01g)，置于50mL离心管(5.7)中，加2mL水和30mL甲醇，在9500转/分钟下匀浆5min，超声提取30min，在6000转/分钟下离心15min。收集上清液并移入250mL分液漏斗中。在分液漏斗中加入30mL石油醚（4.3），振摇2min，待分层后，将下层移于50mL烧杯中，弃去石油醚层。重复用石油醚提取2次。将下层溶液移到100mL圆底烧瓶中，减压浓缩至约2mL，浓缩液倒入离心管中，烧瓶用乙腈-水溶液(1+4)（4.7）5mL分2次洗涤，洗涤液一并倒入50mL离心管中，加水稀释至约50mL，在6000转/分钟下离心5min，上清液供净化处理。6.1.5奶油：称取5g(精确至0.01g)试样，置于50mL烧杯中，用20mL石油醚(4.3)将其溶解并移于250mL具塞锥形瓶中。加20mL水和30mL甲醇，振荡30min后，将全部液体移于分液漏斗中，待分层后，将下层溶液全部移到100mL圆底烧瓶中，在旋转蒸发仪（5.17）中减压浓缩至约5mL，加水稀释至约50mL，供净化处理。6.2净化6.2.1免疫亲和柱的准备将一次性的50mL注射器筒与亲和柱(5.20)上顶部相串联，再将亲和柱与固相萃取装置连接起来。注：根据免疫亲和柱的使用说明书要求，控制试液的pH值。6.2.2试样的纯化将以上6.1试液提取液移至50mL注射器筒(5.21)中，调节固相萃取装置的真空系统,控制试样以2mL/分钟～3mL/分钟稳定的流速过柱。取下50mL的注射器筒，装上10mL注射器筒。注射器筒内加入水，以稳定的流速洗柱，然后，抽干亲和柱。脱开真空系统，在亲和柱下部放入10mL刻度试管，上部装上另一个10mL注射器筒，加入4mL乙腈(4.2),洗脱黄曲霉毒素M1，洗脱液收集在刻度试管中(5.11)中，洗脱时间不少于60秒。然后用氮气缓缓地在30℃下将洗脱液蒸发至近干(如果蒸发至干，会损失黄曲霉毒素M1)，用乙腈-水溶液（1+9）稀释至1mL。3 GB5413.37—20106.3液相色谱参考条件流动相：A液，0.1%甲酸溶液；B液，乙腈-甲醇溶液（1+1）。梯度洗脱：参见附录A中的表A.1。流动相流动速度：0.3mL/min。柱温：35℃。试液温度：20℃。进样量：10µL。6.4质谱参考条件检测方式：多离子反应监测（MRM），详见表1中母离子、子离子和碰撞能量。扫描图参见附录A中的图A.1。表1离子选择参数表黄曲霉毒素母离子定量子离子碰撞能量定性子离子碰撞能量离子化方式M1329.0273.522259.522ESI+离子源控制条件：参见附录A中的表A.2。6.5定性试样中黄曲霉毒素M1色谱峰的保留时间与相应标准色谱峰的保留时间相比较，变化范围应在±2.5％之内。黄曲霉毒素M1的定性离子的重构离子色谱峰的信噪比应大于等于3（S/N≥3），定量离子的重构离子色谱峰的信噪比应大于等于10（S/N≥10）。每种化合物的质谱定性离子必须出现，至少应包括一个母离子和两个子离子，而且同一检测批次，对同一化合物，样品中目标化合物的两个子离子的相对丰度比与浓度相当的标准溶液相比，其允许偏差不超过表2规定的范围。表2定性时相对离子丰度的最大允许偏差相对离子丰度＞50％＞20％至50％＞10％至20％≤10％允许相对偏差±20%±25%±30%±50%各检测目标化合物以保留时间和两对离子（特征离子对/定量离子对）所对应的LC-MS/MS色谱峰面积相对丰度进行定性。要求被测试样中目标化合物的保留时间与标准溶液中目标化合物的保留时间一致（一致的条件是偏差小于20%），同时要求被测试样中目标化合物的两对离子对应LC-MS/MS色谱峰面积比与标准溶液中目标化合物的面积比一致。6.6试样测定按照6.3和6.4确立的条件，测定试液（6.2）和标准系列溶液（4.14）中黄曲霉毒素M1的离子强度，外标法定量。色谱图见附录A的图A.2。色谱参考保留时间：黄曲霉毒素M13.23min。6.7空白试验不称取试样，按6.5的步骤做空白实验。应确认不含有干扰被测组分的物质。6.8标准曲线绘制4 GB5413.37—2010将标准系列溶液（4.14）由低到高浓度进样检测，以峰面积-浓度作图，得到标准曲线回归方程。6.9定量测定待测样液中被测组分的响应值应在标准曲线线性范围内，超过线性范围时，则应将样液用空白基质溶液稀释后重新进样分析或减少取样量，重新按6.1进行处理后再进样分析。7分析结果的表述外标法定量，按式（1）计算黄曲霉毒素M1的残留量。A×V×f×1X=……………………………………………………（1）m式中:X——试样中黄曲霉毒素M1的含量，单位为微克每千克（µg/kg）；A——试样中黄曲霉毒素M1的浓度，单位为纳克每毫升（ng/mL）；V——样品定容体积，单位毫升（mL）；f——样液稀释因子；m——试样的称样量，单位克（g）。以重复性条件下获得的两次独立测定结果的算术平均值表示，结果保留三位有效数字。8精密度在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10%。第二法免疫亲和层析净化高效液相色谱法9原理亲和柱内含有的黄曲霉毒素M1特异性单克隆抗体交联在固体支持物上，当试样通过亲和柱时，抗体选择性的与黄曲霉毒素M1(抗原)键合，形成抗体—抗原复合体。用水洗柱除去柱内杂质，然后用洗脱剂洗脱吸附在柱上的黄曲霉毒素M1，收集洗脱液。用带有荧光检测器的高效液相色谱仪测定洗脱液中黄曲霉毒素M1含量。10试剂和材料除非另有规定，本方法所用试剂均为分析纯，水为GB/T6682规定的一级水。10.1免疫亲和柱：亲和柱的最大容量不小于100ng黄曲霉毒素M1(相当于50mL浓度为2µg/L的试样)，当标准溶液含有4ng黄曲霉毒素M1(相当于50mL浓度为80ng/L的试样)时回收率不低于80%。应该定期检查亲和柱的柱效和回收率，对于每个批次的亲和柱至少检查一次(见10.1.1和10.1.2)。10.1.1柱效检查用移液管(11.4)移取1.0mL的黄曲霉毒素M1标准储备液(10.5.2)到20mL的锥形试管中(11.9)。用恒流的氮气(10.3)将液体慢慢吹干，然后用10mLl0%的乙腈水溶液(10.2.2)溶解残渣，用力摇荡。将该溶液加入到40mL的水中，充分混匀，全部通过免疫亲和柱（10.1）。按说明书要求使用免疫亲和柱。淋洗免疫亲和柱后，洗脱黄曲霉毒素M1。将洗脱液进行适当稀释后，用高效液相色谱仪测定免疫亲和柱键合的黄曲霉毒素M1含量。计算黄曲霉毒素M1的回收率，将其结果与10.1中所要求的指标进行比较。5 GB5413.37—201010.1.2回收率检查用移液管(11.4)移取0.8mL0.005µg/mL的黄曲霉毒素M1标准工作液(10.5.3)到10mL的水中，充分混匀，全部通过免疫亲和柱。按说明书使用免疫亲和柱。淋洗免疫亲和柱，洗脱下黄曲霉毒素M1。将洗脱液进行适当稀释后，用高效液相色谱仪测定免疫亲和柱键合的黄曲霉毒素M1含量。计算黄曲霉毒素M1的回收率，将其结果与10.1中所要求的指标进行对比。10.2乙腈(CH3CN)：色谱纯。10.2.125%乙腈水溶液：将250mL的乙腈(10.2)与750mL的水混溶(使用前需要脱气)。10.2.210%乙腈水溶液：将100mL的乙腈(10.2)与900mL的水混溶(使用前需要脱气)。10.3氮气（N2）。10.4三氯甲烷：加入0.5%～1.0%质量比(与三氯甲烷质量比)的乙醇进行稳定。10.5黄曲霉毒素M1标准溶液，纯度≥98%。10.5.1浓度的校正黄曲霉毒素M1三氯甲烷标准溶液浓度为10µg/mL。根据下面的方法，在最大吸收波段处测定溶液的吸光度，以确定黄曲霉毒素M1的实际浓度。用分光光度计（11.11）在340nm～370nm处测定，扣除三氯甲烷的空白本底，读取标准溶液的吸光度值。在接近360nm最大吸收波段λmax处，测得吸光度值为A，根据式（2）计算浓度值：A×M×100c=…………………………………………………(2)iε式中：ci——黄曲霉毒素M1实际浓度，单位为微克每毫升(µg/mL)；A——在λmax处测得的吸光度值；M——328g/mol，黄曲霉毒素M1摩尔质量，单位为克每摩尔（g/mol）；2ε——19950，溶于三氯甲烷中的黄曲霉毒素M1的吸光系数，单位为平方米每摩尔（m/mol）。10.5.2标准储备液确定黄曲霉毒素M1标准溶液的实际浓度值后（10.5.1），继续用三氯甲烷将其稀释为浓度为0.1µg/mL的储备液。储备液密封后于冰箱中5℃以下避光保存。在此条件下，储备液可以稳定两个月。10.5.3黄曲霉毒素M1标准工作液从冰箱中取出标准储备液（10.5.2）放置至室温，移取一定量的储备液进行稀释制备成工作液。工作液临用前配制。黄曲霉毒素M1标准工作液配制：用移液管（11.4）准确移取1.0mL的储备液（10.5.2）到20mL的锥形试管中（11.9），用和缓的氮气（10.3）将溶液吹干，然后用20.0mL10%的乙腈水溶液（10.2.2）将残渣重新溶解，30min内振摇，混匀，配成浓度为0.005µg/mL的黄曲霉毒素M1标准工作液。在用氮气对储备液吹干的过程中，一定要仔细操作，避免因温度降低太多而出现结露。在作标准曲线时，黄曲霉毒素M1的进样绝对含量分别是0.05ng、0.1ng、0.2ng、0.4ng。根据高效液相色谱仪进样环的容积量，用工作液配置一系列适当浓度的黄曲霉毒素M1标准溶液，稀释液用10%乙腈水溶液（10.2.2）。11仪器和设备11.1一次性注射器：10mL和50mL。11.2真空系统。6 GB5413.37—201011.3离心机：转速≥7000转/分钟。11.4移液管：1.0mL、2.0mL和50.0mL。11.5玻璃烧杯：250mL。11.6容量瓶：100mL。11.7水浴：温控30℃±2℃，50℃±2℃，温度范围36℃±1℃。11.8滤纸：中速定性滤纸。11.9带刻度的磨口锥形玻璃试管：5mL、10mL、20mL。11.10高效液相色谱仪11.10.1无脉冲泵：适合恒定体积流量约1mL/min的泵。11.10.2进样系统：具有固定或可变容积的进样环，进样体积50µL～500µL。11.10.3反相色谱柱：填充3μm或者5μm的十八烷基硅胶，加有填充反相材料的保护柱。11.10.4荧光检测器：具有365nm激发波长、435nm发射波长，在适当的色谱条件下能够测定0.02ng的黄曲霉毒素M1(相当于5倍噪音)。11.11紫外分光光度计：波长范围为200nm～400nm。11.12天平：感量为0.01g。12分析步骤所有的操作分析均应在避光条件下进行。12.1试样制备12.1.1乳：将试样在水浴（11.7）中加热到35℃～37℃。用滤纸（11.8）过滤（根据情况，可以使用多层滤纸进行过滤），或者在7000转/分钟离心15min。至少收集50mL试样，按照12.4继续操作。12.1.2乳粉：称取10g样品（精确到0.1g），置于250mL的烧杯（11.5）中。将50mL已预热到50℃的水多次少量地加入到乳粉中，用搅拌棒将其混合均匀。如果乳粉不能完全溶解，将烧杯在50℃的水浴（11.7）中放置至少30min,仔细混匀。将溶解的乳粉冷却至20℃后，移入100mL容量瓶（11.6）中，用少量的水分次淋洗烧杯，淋洗液一并移入容量瓶中，再用水定容至刻度。用滤纸（11.8）过滤乳，或者在7000转/分钟下离心15min。至少收集50mL的乳试样，按照12.4继续进行分析。12.1.3发酵乳：按照“第一法”中6.1.2的前处理方法进行。12.1.4干酪：按照“第一法”中6.1.4的前处理方法进行。12.1.5奶油：按照“第一法”中6.1.5的前处理方法进行。12.2免疫亲和柱的准备将一次性的50mL注射器筒（11.1）与亲和柱（10.1）的顶部相连，再将亲和柱与真空系统（11.2）连接起来。12.3试样的提取与纯化用移液管移取50mL试样（12.1.1或12.1.2）到50mL注射器（11.1）中，调节真空系统（11.2），控制试样以2mL/min～3mL/min稳定的流速过柱。取下50mL的注射器，装上10mL注射器。注射器内加入10mL水，以稳定的流速洗柱，然后，7 GB5413.37—2010抽干亲和柱。脱开真空系统，装上另一个10mL注射器，加入4mL乙腈(10.2)。缓缓推动注射器栓塞，通过柱塞控制流速，洗脱黄曲霉毒素M1，洗脱液收集在锥形管(11.9)中，洗脱时间不少于60s。然后用和缓的氮气(10.3)在30℃下将洗脱液蒸发至体积为50µL～500µL(如果蒸发至干，会损失黄曲霉毒素M1)。再用水稀释10倍至最终体积为Vf(即500µL～5000µL)。注：如果注入高效液相色谱仪含黄曲霉毒素M1的样品，乙腈含量超过10％，色谱峰变宽。如果水含量超过90％，则对色谱峰的形状没有影响。12.4高效液相色谱分析12.4.1色谱条件色谱柱：C18，长25cm，内径4.6mm；流动相：25%乙腈水溶液(10.2.1)；流速：1mL/min。12.4.2黄曲霉毒素M1的标准曲线根据高效液相色谱仪进样环容积，选择适当进样体积数Vi，分别注入含有0.05ng、0.1ng、0.2ng和0.4ng的黄曲霉毒素M1标准溶液。绘制成峰面积或峰高对黄曲霉毒素M1质量的标准曲线。12.4.3色谱分析根据样品洗脱液色谱图中黄曲霉毒素M1的峰高或峰面积值，从标准曲线上得出样品洗脱液中所含有的黄曲霉毒素M1质量数(ng)。如果样品洗脱液的黄曲霉毒素M1的峰面积或峰高值高于标准曲线范围，用水定容稀释样品洗脱液后，重新进样分析。13分析结果的表述13.1乳应用式(3)计算被测样品中的黄曲霉毒素M1的含量ωm。m×V×1Afω=…………………………………………………（3）mV×Vi式中：ωm——黄曲霉毒素M1的含量，单位为微克每升(µg/L)；mA——样品洗脱液黄曲霉毒素M1的峰面积或峰高从标准曲线上得出的黄曲霉毒素M1的质量，单位为纳克(ng)；Vi——样品洗脱液的进样体积，单位为微升(µL)；Vf——样品洗脱液的最终体积，单位为微升(µL)；V——通过免疫亲和柱被测样品的体积，单位为毫升(mL)。式(3)适用于未经稀释的试样，否则应该乘以稀释倍数。以重复性条件下获得的两次独立测定结果的算术平均值表示，结果保留三位有效数字。13.2乳粉应用式(4)计算被测样品中的黄曲霉毒素M1的含量ωp。m×V×1Afω=…………………………………………………(4)pV×mi8 GB5413.37—2010式中：ωp——黄曲霉毒素M1的含量，单位为微克每千克(µg/kg)；m——50mL样液(12.3)中所含乳粉质量，单位为克(g)。mA、Vf、Vi的含义与13.1中所定义的一样。以重复性条件下获得的两次独立测定结果的算术平均值表示，结果保留三位有效数字。14精密度各实验室试验结果的精密度总结于附录B中，这些数据不适用于其他的污染水平和被测样。第三法免疫层析净化荧光分光度法15原理试样经过离心、脱脂、过滤，滤液经含有黄曲霉毒素M1特异性单克隆抗体的免疫亲和柱层析净化，黄曲霉毒素M1交联在层析介质中的抗体上。此抗体对黄曲霉毒素M1具有专一性，当样品通过亲和柱时，抗体选择性的与所有存在的黄曲霉毒素M1(抗原)键合。用甲醇-水(1+9)将免疫亲和柱上杂质除去，以甲醇-水(8+2)通过免疫亲和柱洗脱，将溴溶液衍生后的洗脱液置于荧光光度计中测定黄曲霉毒素M1含量。16试剂和材料除非另有规定，本方法所用试剂均为分析纯，水为GB/T6682规定的一级水。16.1甲醇(CH3OH):色谱纯。16.2氯化钠(NaCl)。16.3甲醇-水(1+9):取10mL甲醇加入90mL水。16.4甲醇-水(8+2):取80mL甲醇加入20mL水。16.5溴溶液储备液(0.01%):称取适量溴，溶于水后，配成0.01%的储备液，避光保存。16.6溴溶液工作液(0.002%):取10mL0.01%的溴溶液储备液加入40mL水混匀，于棕色瓶中保存备用。现用现配。16.7二水硫酸奎宁[(C20H24N2O2)2·H2SO4·2H2O]。16.8硫酸溶液(0.05mol/L):取2.8mL浓硫酸，缓慢加入适量水中，冷却后定容至1000mL。16.9荧光光度计校准溶液:称取0.340g二水硫酸奎宁，用0.05mol/L硫酸溶液（16.8）溶解并定容至100mL，此溶液荧光光度计读数相当于2.0µg/L黄曲霉毒素M1标准溶液。0.05mol/L硫酸溶液（16.8）荧光光度计读数相当于0.0µg/L黄曲霉毒素M1。17仪器和设备17.1荧光光度计。17.2离心机:转速≥7000转/分钟。17.3玻璃纤维滤纸:直径11cm，孔径1.5μm。9 GB5413.37—201017.4黄曲霉毒素M1免疫亲和柱。17.5空气压力泵。17.6玻璃试管:直径12mm，长75mm，无荧光特性。17.7玻璃注射器：10mL。18分析步骤18.1试样提取18.1.1乳：取50.0mL试样，加入1.0g氯化钠（16.2），7000转/分钟下离心10min，小心移取用于分析的乳底脱脂层，不要碰触顶部脂肪层，将脱脂的乳以玻璃纤维滤纸（17.3）过滤，滤液备用。18.1.2乳粉：称取5g试样(精确至0.01g)，用30℃～60℃水将其慢慢溶解，定容至50mL，加入1.0g氯化钠（16.2），以下按18.2的步骤操作。18.2净化将免疫亲和柱（17.4）连接于10mL玻璃注射器（17.7）下。准确移取10.0mL上述滤液（18.1）注入玻璃注射器中，将空气压力泵（17.5）与注射器连接，调节压力使溶液以约6mL/min流速缓慢通过免疫亲和柱（17.4），直至2mL～3mL空气通过柱体。以10mL甲醇-水(1+9)（16.3）清洗柱子两次，弃去全部流出液，并使2mL～3mL空气通过柱体。准确加入1.0mL(V1)甲醇-水(8十2)（16.4）洗脱液洗脱，流速为1mL/min～2mL/min，收集全部甲醇-水洗脱液于玻璃试管（17.6）中，备用。18.3测定18.3.1荧光光度计校准在激发波长360nm，发射波长450nm条件下，以0.05mol/L的硫酸溶液（16.8）为空白，调节荧光光度计的读数值为0.0μg/L；以荧光光度计校准溶液（16.9）调节荧光光度计的读数值2.0μg/L。18.3.2样液测定取上述洗脱液加入1.0mL(V)0.002%溴溶液，1min后立即于荧光光度计测定样液中黄曲霉毒素M1含量c1。18.3.3空白试验用水代替试样，按18.1～18.3步骤做空白试验。19分析结果的表述19.1乳乳检测结果按式(5)计算:(C−C)×V×10101X=……………………………………………(5)1V式中:X1——试样中黄曲霉毒素M1含量，单位为微克每升(µg/L)；C1——荧光光度计中读取的样液中黄曲霉毒素M1的浓度，单位为微克每升(µg/L)；C0——荧光光度计中读取的空白试验中黄曲霉毒素M1的浓度，单位为微克每升(µg/L)；10 GB5413.37—2010V1——最终净化甲醇-水（8+2）洗脱液体积，单位为毫升(mL)；V——通过亲和柱试样体积，单位为毫升(mL)；10——仪器的读数系数。以重复性条件下获得的两次独立测定结果的算术平均值表示，结果保留到小数点后一位。19.2乳粉乳粉检测结果按式(6)计算:(C−C)×V×10×V201X=………………………………………(6)2m式中:X2——试样中黄曲霉毒素M1含量，单位为微克每千克(µg/kg)；C2——荧光光度计中读取的样液中黄曲霉毒素M1的浓度，单位为微克每升（µg/L)；C0——荧光光度计中读取的空白试验中黄曲霉毒素M1的浓度，单位为微克每升（µg/L)；Vl——最终净化甲醇-水(8+2)洗脱液体积，单位为毫升(mL)；V——通过亲和柱试样体积，单位为毫升(mL)；m——50mL试样中所含乳粉的质量，单位为克每毫升(g/mL)；10——仪器的读数系数。以重复性条件下获得的两次独立测定结果的算术平均值表示，结果保留到小数点后一位。第四法双流向酶联免疫法20原理利用酶联免疫竞争原理，样品中残留的黄曲霉毒素M1与定量特异性酶标抗体反应，多余的游离酶标抗体则与酶标板内的包被抗原结合，通过流动洗涤，加入酶显色底物显色后，与标准点比较定性。21试剂和材料除非另有规定，本方法所用试剂均为分析纯，水为GB/T6682规定的二级水。21.1黄曲霉毒素M1双流向酶联免疫试剂盒，2℃～7℃保存。21.1.1黄曲霉毒素M1系列标准溶液。21.1.2酶联免疫试剂颗粒（含特异性酶标抗体）。21.1.2.1抗黄曲霉毒素M1抗体。警告：不应破损，否则立即销毁。21.1.2.2酶结合物。21.1.3酶显色底物。22仪器和设备22.1样品试管，带有密封盖，内置酶联免疫试剂颗粒（21.1.2）。11 GB5413.37—201022.2移液器（管），450µL±50µL。22.3酶联免疫检测加热器，40℃±5℃。22.4双流向酶联免疫检测读数仪。23分析步骤23.1加热器（22.3）预热到45℃±5℃，并至少保持15min。23.2液体试样或乳粉试样复原后振摇混匀，移取450µL至样品试管（22.1）中，充分振摇，使其中的酶联免疫试剂颗粒（21.1.2）完全溶解。23.3将样品试管（22.1）和酶联免疫检测试剂盒（21.1）同时置于预热过的加热器内保温，保温时间5min～6min。使试样中的黄曲霉毒素M1和酶联免疫试剂颗粒中的酶标记黄曲霉毒素M1抗体结合。23.4将样品试管内的全部内容物倒入试剂盒（21.1）的样品池中，样品将流经“结果显示窗口”向绿色的激活环流去。23.5当激活环的绿色开始消失变为白色时，立即用力按下激活环按键。23.6试剂盒（21.1）继续放置在加热器（22.3）中保温保持4min，使显色反应完成。23.7将试剂盒从加热器中取出水平放置，立即进行检测结果判读，结果判读应在1min内完成。24分析结果的表述24.1目测判读结果试样点的颜色深于质控点，或两者颜色相当，检测结果为阴性。试样点的颜色浅于质控点，检测结果为阳性。24.2双流向酶联免疫检测读数仪判读结果数值≤1.05，显示Negative，检测结果为阴性。数值＞1.05，显示Positive，检测结果为阳性。注:阳性样品需用第一法定量检测方法进一步确认。25其他本标准第一法的定量限为0.01μg/kg(以乳计)；第二法乳粉中黄曲霉毒素M1的最低检测限为0.08μg/kg，乳中黄曲霉毒素M1的最低检测限为0.008μg/L；第三法乳中的黄曲霉毒素M1的检出限为0.1μg/L，乳粉中黄曲霉毒素M1的检出限为0.lμg/kg；第四法的检出限为0.5μg/kg。12 GB5413.37—2010附录A（资料性附录）黄曲霉毒素M1免疫亲和层析净化液相色谱—串联质谱法色谱图及参考条件A.1黄曲霉毒素M1免疫亲和层析净化液相色谱—串联质谱法色谱图及参考条件免疫亲和层析净化液相色谱—串联质谱法黄曲霉毒素M1子离子扫描图见图A.1。免疫亲和层析净化液相色谱—串联质谱法黄曲霉毒素M1色谱质谱图见图A.2。免疫亲和层析净化液相色谱—串联质谱法液相色谱梯度洗脱条件见表A.1。免疫亲和层析净化液相色谱—串联质谱法离子源控制条件见表A.2。图A.1黄曲霉毒素M1子离子扫描图图A.2黄曲霉毒素M1色谱质谱图13 GB5413.37—2010表A.1液相色谱梯度洗脱条件时间（min）流动相A%流动相B%梯度变化曲线068.032.0-4.2055.045.065.000.0100.065.700.0100.016.0068.032.06注:1为即时变化,6为线性变化。表A.2离子源控制条件电离方式电喷雾电离，负离子毛细管电压（kV）3.5锥孔电压（V）45射频透镜1电压（V）12.5射频透镜2电压（V）12.5离子源温度（℃）120锥孔反吹气流量（L/h）50脱溶剂气温度（℃）350脱溶剂气流量（L/h）500电子倍增电压（V）65014 GB5413.37—2010附录B(资料性附录)多个不同实验室的试验结果世界各地16个实验室参加了低脂肪(1％)和高脂肪(28％)乳粉样品的协同试验。高脂肪样品是用于制作参比物质的剩留物，所以黄曲霉毒素M1的含量是已知的。对于乳粉，其污染水平为0.08µg/kg～0.6µg/kg，即对于乳而言，污染水平为8ng/L～60ng/L。试验结果根据ISO5725-l和ISO5725-2规定的统计方法获得，其精密度的数据列于表B.1。表B.1精密度数据样品编号12345a实验室个数124131114平均值/(ng/kg)8115080202580重复性值r/(ng/kg)2360.11527203再现性值R/(ng/kg)52984161310重复性变异系数/(%)9.914.06.84.712.5复验性变异系数/(%)2322.718.310.819.1a减少的实验室数是根据Cochran和Grubbs统计方法应该从样本中剔除的数据图B.1高效液相色谱分离黄曲霉毒素M1的标准图15'