GB54139-2010食品安全国家标准婴幼儿食品和乳品中维生素A、D、E的测定.pdf

'中华人民共和国国家标准GB5413.9—2010食品安全国家标准婴幼儿食品和乳品中维生素A、D、E的测定NationalfoodsafetystandardDeterminationofvitaminA,D,Einfoodsforinfantsandyoungchildren,milkandmilkproducts2010-03-26发布2010-06-01实施中华人民共和国卫生部发布 GB5413.9—2010前言本标准代替GB/T5413.9-1997《婴幼儿配方食品和乳粉维生素A、D、E的测定》。本标准与GB/T5413.9-1997相比，主要变化如下：——抗氧化剂由原来的焦性没食子酸改为抗坏血酸；——将处理方法中的加热回流改为恒温皂化操作；——增加了标准溶液的校正；——将原有的单点定量改为标准曲线法；——增加了维生素D回收率的测定；——将计算公式进行修改。本标准附录A为规范性附录，附录B为资料性附录。本标准所代替标准的历次版本发布情况为：——GB5413-1985、GB/T5413.9-1997。I GB5413.9—2010食品安全国家标准婴幼儿食品和乳品中维生素A、D、E的测定1范围本标准规定了婴幼儿食品和乳品中维生素A、D、E的测定方法。本标准适用于婴幼儿食品和乳品中维生素A、D、E的测定。2规范性引用文件本标准中引用的文件对于本标准的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本标准。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本标准。3原理试样皂化后，经石油醚萃取，维生素A、E用反相色谱法分离，外标法定量；维生素D用正相色谱法净化后，反相色谱法分离，外标法定量。4试剂和材料除非另有规定，本方法所用试剂均为分析纯或以上规格，水为GB/T6682规定的一级水。4.1α-淀粉酶：酶活力≥1.5U/mg。4.2无水硫酸钠。4.3异丙醇：色谱纯。4.4乙醇：色谱纯。4.5氢氧化钾水溶液：称取固体氢氧化钾250g，加入200mL水溶解。4.6石油醚：沸程30℃～60℃。4.7甲醇：色谱纯。4.8正己烷：色谱纯。4.9环己烷：色谱纯。4.10维生素C的乙醇溶液（15g/L）。4.11维生素A、D、E标准溶液4.11.1维生素A标准储备液（视黄醇）（100μg/mL）：精确称取10mg的维生素A标准品，用乙醇（4.4）溶解并定容于100mL棕色容量瓶中。1 GB5413.9—20104.11.2维生素E标准储备液（α-生育酚）（500μg/mL）：精确称取50mg的维生素E标准品，用乙醇（4.4）溶解并定容于100mL棕色容量瓶中。4.11.3维生素D2标准储备液（100μg/mL）：精确称取10mg的维生素D2标准品，用乙醇（4.4）溶解并定容于100mL棕色容量瓶中。4.11.4维生素D3标准储备液（100μg/mL）：精确称取10mg的维生素D3标准品，用乙醇（4.4）溶解并定容于100mL棕色容量瓶中。注：维生素A、D、E标准储备液均须-10℃以下避光储存。标准工作液临用前配制。标准储备溶液用前需校正，见附录A。5仪器和设备5.1高效液相色谱仪，带紫外检测器。5.2旋转蒸发器。5.3恒温磁力搅拌器：20℃～80℃。5.4氮吹仪。5.5离心机：转速≥5000转/分钟。5.6培养箱：60℃±2℃。5.7天平：感量为0.1mg。6分析步骤6.1试样处理6.1.1含淀粉的试样称取混合均匀的固体试样约5g或液体试样约50g（精确到0.1mg）于250mL三角瓶中，加入lgα-淀粉酶（4.1），固体试样需用约50mL45℃～50℃的水使其溶解，混合均匀后充氮，盖上瓶塞，置于60℃±2℃培养箱（5.6）内培养30min。6.1.2不含淀粉的试样称取混合均匀的固体试样约10g或液体试样约50g（精确到0.1mg）于250mL三角瓶中，固体试样需用约50mL45℃～50℃水使其溶解，混合均匀。6.2测定维生素D的试样需要同时做回收率实验。6.3待测液的制备6.3.1皂化：于上述处理的试样溶液中加入约100mL维生素C的乙醇溶液（4.10），充分混匀后加25mL氢氧化钾水溶液（4.5）混匀，放入磁力搅拌棒，充氮排出空气，盖上胶塞。1000mL的烧杯中加入约300mL的水，将烧杯放在恒温磁力搅拌器（5.3）上，当水温控制在53℃±2℃时，将三角瓶放入烧杯中，磁力搅拌皂化约45min后，取出立刻冷却到室温。6.3.2提取：用少量的水将皂化液全部转入500mL分液漏斗中，加入100mL石油醚（4.6），轻轻摇动，排气后盖好瓶塞，室温下振荡约10min后静置分层，将水相转入另一500mL分液漏斗中，按上述方法进行第二次萃取。合并醚液，用水洗至近中性。醚液通过无水硫酸钠过滤脱水，滤液收入500mL2 GB5413.9—2010圆底烧瓶中，于旋转蒸发器上在40℃±2℃充氮条件下蒸至近干（绝不允许蒸干）。残渣用石油醚转移至10mL容量瓶中，定容。6.3.3从上述容量瓶中准确移取2.0mL石油醚溶液放入试管A中，再准确移取7.0mL石油醚溶液放入另一试管B中，将试管置于40℃±2℃的氮吹仪（5.4）中，将试管A和B中的石油醚吹干。向试管A中加5.0mL甲醇（4.7），振荡溶解残渣。向试管B中加2.0mL正己烷（4.8），振荡溶解残渣。再将试管A和试管B以不低于5000转/分钟的速度离心10min，取出静置至室温后待测。A管用来测定维生素A、E，B管用来测定维生素D。6.4测定6.4.1维生素A、E的测定6.4.1.1色谱参考条件色谱柱：C18柱，250mm×4.6mm，5μm，或具同等性能的色谱柱。流动相：甲醇（4.7）。流速：1.0mL/min。检测波长：维生素A：325nm；维生素E：294nm。柱温：35℃±1℃。进样量：20μL。6.4.1.2维生素A、E标准曲线的绘制分别准确吸取维生素A标准储备液（4.11.1）0.50mL、1.00mL、1.50mL、2.00mL、2.50mL于50mL棕色容量瓶中，用乙醇定容至刻度混匀。此标准系列工作液浓度分别为1.00μg/mL、2.00μg/mL、3.00μg/mL、4.00μg/mL、5.00μg/mL。分别准确吸取维生素E标准储备液（4.11.2）1.00mL、2.00mL、3.00mL、4.00mL、5.00mL于50mL棕色容量瓶中，用乙醇定容至刻度混匀。此标准系列工作液浓度分别为10.0μg/mL、20.0μg/mL、30.0μg/mL、40.0μg/mL、50.0μg/mL。分别将维生素A、E标准工作液注入液相色谱仪中（色谱图参见附录B），得到峰高(或峰面积)。以峰高(或峰面积)为纵坐标，以维生素A、E标准工作液浓度为横坐标分别绘制维生素A、E标准曲线。6.4.1.3维生素A、E试样的测定将试液（6.3.3中A管）注入液相色谱仪中，得到峰高(或峰面积)，根据各自标准曲线得到待测溶液中维生素A、E的浓度。6.4.2维生素D的测定6.4.2.1维生素D待测液的净化6.4.2.1.1色谱参考条件。色谱柱：硅胶柱，150mm×4.6mm，或具同等性能的色谱柱。流动相：环己烷（4.9）与正己烷（4.8）按体积比1：1混合，并按体积分数0.8%加入异丙醇（4.3）。流速：1mL/min。波长：264nm。柱温：35℃±1℃。进样体积：500μL。6.4.2.1.2取约0.5mL维生素D标准储备液于10mL具塞试管中，在40℃±2℃的氮吹仪（5.4）上吹干。残渣用5mL正己烷振荡溶解。取该溶液50μL注入液相色谱仪中测定，确定维生素D保留时间。然后将500μL待测液（6.3.3中B管）注入液相色谱仪中，根据维生素D标准溶液保留时间收集维生素D馏分于试管C中。将试管C置于40℃±2℃条件下的氮吹仪中吹干，取出准确加入1.0mL甲醇（4.7），残渣振荡溶解，即为维生素D测定液。3 GB5413.9—20106.4.2.2维生素D测定液的测定6.4.2.2.1参考色谱条件色谱柱：C18柱，250mm×4.6mm，5μm，或具同等性能的色谱柱。流动相：甲醇（4.7）。流速：1mL/min。检测波长：264nm。柱温：35℃±1℃。进样量：100μL。6.4.2.2.2标准曲线的绘制分别准确吸取维生素D2（或D3）标准储备液（4.11.3、4.11.4）0.20mL、0.40mL、0.60mL、0.80mL、1.00mL于100棕色容量瓶中，用乙醇定容至刻度混匀。此标准系列工作液浓度分别为0.200μg/mL、0.400μg/mL、0.600μg/mL、0.800μg/mL、1.000μg/mL。分别将维生素D2（或D3）标准工作液注入液相色谱仪中，得到峰高（或峰面积)，参见附录B。以峰高(或峰面积)为纵坐标，以维生素D2（或D3）标准工作液浓度为横坐标分别绘制标准曲线。6.4.2.2.3维生素D试样的测定吸取维生素D测定液（6.4.2.1中C管）100μL注入液相色谱仪中（色谱图参见附录B），得到峰高（或峰面积），根据标准曲线得到维生素D测定液中维生素D2（或D3）的浓度。维生素D回收率测定结果记为回收率校正因子f，代入测定结果计算公式（2），对维生素D含量测定结果进行校正。7分析结果的表述7.1维生素A含量的计算维生素A含量按（1）计算：c×102/×5×100sX=………………………………………………………………（1）m式中：X——试样中维生素A的含量，单位为微克每百克（μg/100g）；cs——从标准曲线得到的维生素A待测液的浓度，单位为微克每毫升（μg/mL）；m——试样的质量，单位为克（g）。注：1μg视黄醇=3.33IU维生素A。以重复性条件下获得的两次独立测定结果的算术平均值表示，结果保留三位有效数字。7.2维生素D含量的计算维生素D含量按（2）计算：c×107/×2×2×100sX=…………………………………………………………（2）m×f式中：X——试样中维生素D2（或D3）的含量，单位为微克每百克（μg/100g）；cs——从标线得到的维生素D2（或D3）待测液的浓度，单位为微克每毫升（μg/mL）；m——试样的质量，单位为克（g）；4 GB5413.9—2010f——回收率校正因子。注：试样中维生素D的含量以维生素D2和D3的含量总和计。以重复性条件下获得的两次独立测定结果的算术平均值表示，结果保留三位有效数字。7.3维生素E含量维生素E含量按（3）计算：c×10/2×5×100sX=………………………………………………………（3）m×1000式中：X——试样中维生素E（α-生育酚）的含量，单位为毫克每百克（mg/100g）；cs——从标准曲线得到的维生素E待测液的浓度，单位为微克每毫升（μg/mL）；m——试样的质量，单位为克（g）。以重复性条件下获得的两次独立测定结果的算术平均值表示，结果保留三位有效数字。8精密度在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值，维生素A、E不得超过算术平均值的5%，维生素D不得超过算术平均值的10%。9其他本标准检出限：维生素A为1µg/100g、维生素E为10.00µg/100g、维生素D为0.20µg/100g。5 GB5413.9—2010附录A（规范性附录）标准溶液浓度校正方法维生素A、D、E标准储备液配制后需要进行校正，具体操作如下：分别取维生素A、D、E标准储备液若干微升，分别注入至含有3.00mL乙醇的比色皿中，根据给定波长测定各维生素的吸光值，按表A.1给定的条件进行测定，通过下列公式计算出该维生素的浓度。表A.1各维生素吸光值的测定条件1%标准品加入标准储备液的量（μL）比吸光系数E波长λ（nm）cm视黄醇（维生素A）V1835325α-生育酚（维生素E）V71294麦角钙化甾醇（维生素V485264D2）胆钙化醇（维生素D3）V462264浓度计算按式(4)：A1.300C=××…………………………………………………………(4)−3E100V×10式中：C——维生素A、D、E浓度，单位为克每毫升（g/mL）；A——维生素A、D、E的平均紫外吸光值；V——加入标准储备液的量，单位为微升（μL）；E——A、D、E维生素1%比色光系数；.300——标准储备液稀释倍数。−3V×106 GB5413.9—2010附录B（资料性附录）标准品液相色谱图B.1维生素A、E、D3、D2标准品液相色谱图维生素A、E、D3、D2标准品液相色谱图见图B.1～图B.4。0.0300.025A-5.1580.020维生素AU0.0150.0100.0050.0001.002.003.004.005.006.007.008.009.0010.0011.0012.0013.0014.0015.0016.0017.00分钟图B.1维生素A标准品液相色谱图0.0180.0160.0140.0120.010AU0.008E-14.0590.006维生素0.0040.0020.0001.002.003.004.005.006.007.008.009.0010.0011.0012.0013.0014.0015.0016.00分钟图B.2维生素E标准品液相色谱图7 GB5413.9—20100.00180.00160.00140.00120.00100.0008D3-11.4860.0006AU0.0004维生素0.00020.0000-0.0002-0.0004-0.0006-0.00081.002.003.004.005.006.007.008.009.0010.0011.0012.0013.0014.0015.0016.00分钟图B.3维生素D3标准品液相色谱图0.00320.00300.00280.0026D2-10.3840.00240.0022维生素0.00200.00180.0016AU0.00140.00120.00100.00080.00060.00040.00020.00001.002.003.004.005.006.007.008.009.0010.0011.0012.0013.0014.0015.00分钟图B.4维生素D2标准品液相色谱图8'