蛋白质水力学半径的测定及用于蛋白质变性过程的实时监控

'第59卷第6期化工学报Vol159No162008年6月JournalofChemicalIndustryandEngineering(China)June2008研究论文蛋白质水力学半径的测定及用于蛋白质变性过程的实时监控1211白丽燕,陈春琴,林东强,姚善泾(1浙江大学化学工程与生物工程学系,浙江杭州310027;2杭州华东大药房连锁有限公司,浙江杭州310002)摘要:采用纳米粒度分析仪ZetasizerNano测定了牛血清白蛋白(BSA)的水力学半径,考察了pH、离子强度、表面活性剂等的影响,并用于BSA热变性和脲变性过程的实时跟踪。随pH增大,BSA水力学半径呈/U0形变化趋势;酸性条件下,分子膨胀,随着盐浓度升高,BSA分子先小幅减小后显著增大;中性pH范围,离子强度对蛋白质分子尺寸影响很小,蛋白质性质相对稳定。离子型表面活性剂在蛋白质表面吸附,从而影响BSA水力学半径。通过水力学半径的测量实时跟踪蛋白质变性过程的分子变化,发现增加热变性中离子强度可加快变性速率,SDS加入增大了BSA变性温度Tm。脲在促使BSA分子扩张的同时,对链伸展有抑制作用;在DTT存在下,BSA的水力学半径随着时间变化逐渐增大。结果表明,简便的水力学半径测量可以用于蛋白质大小的表征,并可实时跟踪蛋白变性过程的分子尺度变化。关键词:水力学半径;牛血清白蛋白;表面活性剂;热变性;脲中图分类号:TQ93文献标识码:A文章编号:0438-1157(2008)06-1485-05Measurementofproteinhydrodynamicradiusanditsapplicationstomonitorproteindenaturation1211BAILiyan,CHENChunqin,LINDongqiang,YAOShanjing1(DepartmentofChemicalandBiochemicalEngineering,ZhejiangUniversity,Hangzhou310027,Zhejiang,China;2HuadongMedicineCo1,Ltd1,Hangzhou310002,Zhejiang,China)Abstract:Thehydrodynamicradius(Rh)ofbovineserumalbumin(BSA)wasmeasuredwiththeZetasizerNanoinstrument1TheinfluencesofpH,ionicstrengthandsurfactantswereinvestigated,andtherea-ltimemeasurementofBSAsizewasusedtomonitorthethermaldenaturationandureadenaturationofBSA1TheresultsindicatedthatRhshowedatypical/U0formwiththeincreaseofpH1Inacidsolution,withincreasingionicstrengththeRhdecreasedalittlefirst,andthenincreasedremarkably1AtneutralpHtheinfluenceofionicstrengthcouldbeneglected1TheadsorptionofionicsurfactantsonBSAmolecularsurfaceresultedinthechangeofRh1ForthethermaldenaturationofBSA,therateofdenaturationincreasedwiththeincreaseofionicstrength1Whensodiumdodecylsulfate(SDS)wasadded,themeltingpointTmofBSAcouldincrease1Forureadenaturation,ureacouldcauseBSAmoleculetoexpandbutalso2007-08-13收到初稿,2008-01-09收到修改稿。Receiveddate:2007-08-13.联系人:姚善泾。第一作者:白丽燕(1983)),女,硕士。Correspondingauthor:Prof.YAOShanjing.E-mail:yaosj基金项目:国家高技术研究发展计划项目(2006AA02Z210);@zju1edu1cn国家自然科学基金项目(20206029,20776129)。Foundationitem:supportedbytheHigh-techResearchandDevelopmentProgramofChina(2006AA02Z210)andtheNationalNaturalScienceFoundationofChina(20206029,20776129). #1486#化工学报第59卷restraintheextensionofpeptidechains1Byaddingdithiothreitol(DTT),theRhofBSAincreasedgraduallywithdenaturationtime1TheresultsindicatedthatthisconvenientmeasurementofRhcouldbeusedforcharacterizingthemolecularsizeofprotein,andmonitoringthechangeofproteinmoleculeduringthedenaturationprocess.Keywords:hydrodynamicradius;bovineserumalbumin;surfactant;thermaldenaturation;urea[5]坏样品;Model868pH计,美国ThermoOrion引言公司;0122Lm微孔滤膜,上海兴亚净化材料厂;随着生物技术工业的快速发展,对下游分离纯牛血清白蛋白(BSA)及十二烷基磺酸钠(SDS),化过程提出了越来越高的要求。采用有效的表征手上海生物工程公司;十六烷基三甲基氯化铵段,准确、快速、实时地测定蛋白质分子的分子(CTAB),上海新华活性材料研究所;其余试剂均量、空间尺度、表面电荷特性等参数,可以为下游为市售分析纯。[1-2]过程的优化和设计提供指导。文献报道,通过112溶液条件对BSA水力学半径影响检测不同条件下酵母乙醇脱氢酶的大小,可协助选ZetasizerNanoZS型Zeta电位和粒度分析仪[3]择最佳微滤条件,大大提高了分离收率。测定BSA的水力学半径,BSA浓度为110mg#常规测量蛋白质大小的方法,如电泳和凝胶过ml-1,溶液经0122Lm微滤膜过滤,测定9次,滤法,需要标准蛋白作为参照,且过程费时费力。取平均值。常见的粒度分析方法有显微镜法、沉降法、光散射pH影响:配制含100mmol#L-1NaCl的BSA溶法和电超声法等,难以测量小于10nm的蛋白质-1液,调节pH处于2~12,控制电导为516mS#cm。分子。水力学半径是一个和真实颗粒具有相同扩散-1离子强度影响:分别以0101mol#LHCl配速率的假想球体的半径,基于布朗运动,由-1制pH210的BSA溶液,10mmol#LTris-HClStokes-Einstein方程计算得到,常采用光子相关光缓冲液配制pH810的BSA溶液,NaCl浓度按梯[4]谱法测定胶体等超细颗粒的水力学半径。水力学度配制。半径受温度、黏度、扩散系数、溶液pH、离子强-1表面活性剂影响:012mol#L醋酸-醋酸钠度以及吸附性物质等影响,这对于了解诸如蛋白质缓冲液(pH516)配制BSA溶液,加不同量SDS;在溶液中的真实状况,以及分析蛋白质分离纯化过-10101mol#LTris-HCl缓冲液(pH810)配制程中的形态变化具有重要的意义。BSA溶液,加不同量CTAB。不含蛋白的表面活本文将采用Malvern公司的最新仪器Zetasizer性剂溶液作对照。Nano纳米粒度分析仪,以牛血清白蛋白(BSA)113热变性过程中BSA水力学半径变化为模型蛋白,测定不同pH、离子强度、表面活性-110mmol#LTris-HCl缓冲液(pH810)配剂添加等条件下BSA水力学半径的变化,通过实制BSA溶液,考察离子强度影响时,NaCl浓度按时监测来跟踪BSA热变性、脲变性和DTT变性过梯度配制;考察SDS影响时,加适量SDS,浓度分程中分子大小的变化,以了解蛋白质变性过程的分-4-1-4-1别为014@10mol#L和018@10mol#L。子变化和变性机理。温度每升高1e测定1次,温度平衡时间为3min。1材料与方法114脲和DTT变性过程中BSA水力学半径变化-1111设备与材料10mmol#LTris-HCl缓冲液(pH810)配ZetasizerNanoZS型Zeta电位和粒度分析仪,制BSA溶液,添加不同浓度的脲和DTT,考察英国Malvern公司,采用光子相关光谱法,结合非BSA水力学半径的变化。侵入式背投光散射技术,排除了多角度光散射以及2结果和讨论样品污染带来的影响,提高了测量精度和范围,可用于分析超细纳米尺度的胶体颗粒(如蛋白质分211pH对BSA水力学半径影响子)水力学半径,无需参照物,测量快捷,且不破测定了不同溶液pH下BSA的水力学半径,结 第6期白丽燕等:蛋白质水力学半径的测定及用于蛋白质变性过程的实时监控#1487#-1果如图1。由图可知,随着pH的增大,BSA的水力浓度高达410mol#L,BSA水力学半径仍保持学半径呈/U"形分布,该结果与凝胶过滤法测定的在410nm左右,说明该条件下BSA分子结构相对[6]分子大小变化趋势相一致。pH对BSA分子尺度稳定,始终处于紧密状态。结果表明,BSA在中[7]的影响可用5种状态表示:E(expanded)zy性条件下是稳定的,这个结果在生理学上具有重要F(fast)zyN(normal)zyB(basic)zyA(aged)。意义。BSA水力学半径随pH的变化趋势正是这5种状态转化的表观体现。图1pH对BSA水力学半径的影响Fig11InfluenceofpHonhydrodynamicradiusofBSApH5~7之间BSA处于自然状态N,水力学半径保持在4nm左右,蛋白质分子结构相对稳定。pH<5时,A螺旋向B折叠和自由卷曲转变,导致NyF状态的转变,水力学半径略有增长;pH<315,二硫键破坏导致BSA变性,水力学半径显著增加,pH215时BSA分子达到完全伸展的状态E,水力学半径接近6nm;当pH7~9之间,BSA分子进行NyB状态的渐进转变,四级结构微弱重组,呈现结构上的波动;pH>10,BSA变性,造成水力学半径的显著增大。212离子强度对BSA水力学半径的影响213表面活性剂对BSA水力学半径影响分别考察了两个pH(pH210和pH810)下,考察了阴离子表面活性剂SDS和阳离子表面不同NaCl浓度对BSA水力学半径的影响,结果见活性剂CTAB对BSA水力学半径影响,结果见图图2和图3,表现出不同的变化规律。当pH2104和图5。由图可知,随着表面活性剂浓度增加,时,BSA水力学半径随离子强度的增加先小幅度水力学半径增大,并在某一浓度下达到最大值,随减小,然后迅速增大。这种影响可以归结为静电力后呈现下降趋势。当表面活性剂浓度较低时,由于和疏水力共同作用的结果。在相对低的浓度范围-1离子型表面活性剂在蛋白质表面的吸附,造成蛋白(0~300mmol#L),随着NaCl浓度的增加,分[8]质水力学半径的增大;不同表面活性剂的吸附量和子内的疏水作用增强,抑制了BSA的酸性膨胀,分子链长有差别,因此水力学半径的增大幅度略有所以水力学半径缓慢变小。随着盐浓度的增加(大-1不同。当表面活性剂浓度达到临界胶束浓度于300mmol#L),分子间的静电斥力趋于零,(CMC)后,会在溶液中形成胶束,导致胶束和疏水基团逐渐暴露,BSA分子开始聚集,水力学半径显著增大。NaCl浓度达到750mmol#L-1时,BSA竞争溶液中的自由表面活性剂,并且仪器测出的是胶束和BSA混合物的平均水力学半径,造溶液中产生白色沉淀,即发生了盐析。pH810时,成偏差,因此测量的水力学半径达到最大值后呈现离子强度对BSA水力学半径几乎不产生影响,盐 #1488#化工学报第59卷[9]下降趋势,该结果与文献报道相符。214热变性过程中BSA水力学半径变化-1势,8mol#L脲浓度下BSA水力学半径达到考察了BSA在不同NaCl浓度和添加SDS条817nm。当加入DTT后,呈现不同的变化规律。件下,热变性过程中水力学半径的变化。结果如图-1溶液中存在20mmol#LDTT时,由于二硫键6和图7。由图6可知,随着温度的升高,BSA水被破坏,BSA分子充分展开,水力学直径可以达力学半径先保持不变,当达到临界温度Tm后,发到1715nm;随着脲浓度的增加,水力学半径先是生变性,水力学半径开始随温度升高而显著增加。-1急剧减小,当脲浓度为4mol#L时,达到最小随离子强度增大,BSA变性速率明显加快,而变值(约614nm),随后水力学半径又呈现上升的趋性温度Tm几乎不变。从图7中可以看出,添加低势。结果表明,脲的作用是复杂的,具有双重作浓度的SDS,明显提高了BSA的变性温度Tm,实用,一方面能够促使蛋白分子的扩张,另一方面一验验证了文献报道的/低浓度SDS对BSA结构具-1[10]定浓度下(<4mol#L)还能抑制肽链的伸有保护作用0。该现象可以用交联作用来解释,[11]展。可能原因如下:脲可以改变水化层结构,BSA蛋白分子中的非极性残基和带正电残基可以从而影响蛋白的高级结构使蛋白分子扩张;而通过SDS连接,使得BSA在热变性中更加稳定。215BSA在脲和DTT变性过程中水力学半径变化DTT能直接破坏蛋白分子的二硫键,促使肽链的充分伸展;当二硫键被打开后,低浓度的脲又可以考察了脲浓度以及添加DTT对BSA水力学半径影响,结果见图8。由图可知,只有脲存在时,通过多肽链特定位点的结合,抑制蛋白质分子的扩-1随着脲浓度增加,BSA水力学半径逐渐增大,但张;当脲浓度大于4mol#L,扩张作用占主导[12]地位。进一步考察了脲变性过程中BSA水力学是增大幅度有限,蛋白质分子呈现逐步扩张的趋 第6期白丽燕等:蛋白质水力学半径的测定及用于蛋白质变性过程的实时监控#1489#半径随时间的变化,结果见图9。BSA水力学半径同的蛋白质对象,获得规律性认识,将有助于蛋白在前100min内,呈直线上升趋势,随后增长速率变性和复性的机理探讨和过程优化。逐渐变小,最后达到稳定,结果表明BSA分子结References构变化是个渐进的过程,快速而精确的水力学半径测定可以用于蛋白质分子尺度变化的实时跟踪。[1]BowenWR,HallNI,PanLC,SharifAO,WilliamsPW1Therelevanceofparticlesizeandzeta-potentialinproteinprocessing1NatureBiotechnology,1998,16:785-787[2]YeJinfu(叶进富),LinDongqiang(林东强),YaoShanjing(姚善泾).Zetapotentialofbovineserumalbuminanditscorrelationtotheretentionfactorofionexchangechromatography.JournalofChemicalEngineeringofChineseUniversity(高校化学工程学报),2007,21(3):381-385[3]BowenWR,HallNI1Propertiesofmicrofiltrationmembranes-mechanismsoffluxlossintherecoveryofanenzyme1BiotechnologyandBioengineering,1995,46(1):28-35[4]Whatishydrodynamicradius?http://www1marlvern1co1uk[5]IntroductiontoZetasizerNanoZS1http://www1marlvern1co1uk[6]MartensonRE1Theuseofgelfiltrationtofollowconformationalchangesinproteins1JournalofBiologicalChemistry,1978,253(24):8887-8893[7]SadlerPJ,TuckerA1pH-inducedstructuraltransitionsofbovineserumalbumin1EuropeanJournalofBiochemistry,1993,212(3):811-817[8]TanfordC,BuzzellJG,RandsDG,SwansonSA1Thereversibleexpansionofbovineserumalbumininacidsolutions1JournaloftheAmericanChemicalSociety,1955,77:6421-6428[9]ValstarA,AlmgrenM,BrownW1Theinteractionofbovineserumalbuminwithsurfactantsstudiedbylightscattering1Langmuir,2000,16(3):922-9273结论[10]MoriyamaY,KawasakaY,TakedaK1Protectiveeffectofsmallamountsofsodiumdodecylsulfateonthehelical借助合适的纳米粒度分析仪,测定了BSA水structureofbovineserumalbumininthermaldenaturation1力学半径,考察了pH、离子强度、表面活性剂等JournalofColloidandInterfaceScience,2003,257(1):影响,并用于BSA热变性和脲变性过程的实时跟41-46[11]LiepinshE,OttingG1Specificityofureabindingto踪。结果表明,ZetasizerNano可以用于蛋白质水proteins1JournaloftheAmericanChemicalSociety,力学半径的测量,结果稳定可靠,分析过程快捷。1994,116(21):9670-9674pH、离子强度、表面活性剂等都对蛋白质分子产[12]DasA,ChitraR,ChoudhuryRR,RamanadhamM1生影响,可用水力学半径进行表征。初步研究表Structuralchangesduringtheunfoldingofbovineserum明,通过简便的水力学半径测量,可以实现蛋白变albumininthepresenceofurea:asmal-langleneutronscatteringstudy1Pramana,2004,63(2):363-368性过程中分子尺度变化的实时跟踪。进一步研究不'