钼酸铵分光光度法测定磷浓度实验方法的改进

'ＩＳＳＮ１００２－４９５６实验技术与管理第３０卷第１期２０１３年１月ＣＮ１１－２０３４／ＴＥｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙａｎｄＭａｎａｇｅｍｅｎｔＶｏｌ．３０Ｎｏ．１Ｊａｎ．２０１３钼酸铵分光光度法测定磷浓度实验方法的改进申禹，李玲（清华大学水沙科学与水利水电工程国家重点实验室，北京１０００８４）摘要：钼酸铵分光光度法是测定水环境中磷浓度的常用方法，对其实验方法进行改进，使其更方便、更快捷地应用在各个研究领域。在深入分析影响测量准确度的多种因素的基础上，对显色时间跨度、最佳工作波长和样品ｐＨ值范围等进行了研究。研究结果表明，选择吸光度出现峰值时的波长为工作波长，在磷钼蓝稳定显色期间测定吸光度可保证测定结果的准确性，比如２０℃时稳定显色的时间跨度为５～２５ｍｉｎ，最佳工作波长为７１０ｎｍ。测定正磷酸盐溶液磷浓度时不需消解，正磷酸盐溶液ｐＨ在３～１１范围内不影响显色反应，不会影响磷浓度的测定。关键词：水体中磷含量测量；分光光度法；钼酸铵；正磷酸盐中图分类号：Ｘ８３２文献标志码：Ｂ文章编号：１００２－４９５６（２０１３）０１－００５６－０４ＭｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆａｍｍｏｎｉｕｍｍｏｌｙｂｄａｔｅｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｒｉｃｍｅｔｈｏｄｆｏｒｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔｏｆｄｉｓｓｏｌｖｅｄｐｈｏｓｐｈｏｒｕｓＳｈｅｎＹｕ，ＬｉＬｉｎｇ（ＳｔａｔｅＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙｏｆＨｙｄｒｏｓｃｉｅｎｃｅａｎｄＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，ＴｓｉｎｇｈｕａＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｂｅｉｊｉｎｇ１０００８４，Ｃｈｉｎａ）Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔｈｅａｍｍｏｎｉｕｍｍｏｌｙｂｄａｔｅｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｒｉｃｍｅｔｈｏｄｉｓｔｈｅｍｏｓｔｃｏｍｍｏｎｌｙｕｓｅｄｆｏｒｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｏｆｐｈｏｓｐｈｏｒｕｓｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｉｎｗａｔｅｒｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ．Ｔｈｅｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｍｅｔｈｏｄｗｉｌｌｍａｋｅｉｔｍｏｒｅｗｉｄｅｌｙａｐｐｌｉ－ｃａｔｉｏｎｉｎｔｈｅｒｅｓｅａｒｃｈｆｉｅｌｄ．Ｄｅｅｐｌｙａｎａｌｙｓｉｓｏｆｔｈｅｉｍｐａｃｔｆａｃｔｏｒｓｆｏｒｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｏｆｐｈｏｓｐｈｏｒｕｓｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｉｓｍａｄｅ，ａｎｄｔｈｅｔｉｍｅｓｐａｎｆｏｒｍｅａｓｕｒｉｎｇ，ｔｈｅｏｐｔｉｍｕｍｗｏｒｋｉｎｇｗａｖｅｌｅｎｇｔｈａｎｄｔｈｅｐＨｒａｎｇｅｏｆｗａｔｅｒｓａｍ－ｐｌｅｓａｒｅｓｔｕｄｉｅｄ．Ｔｈｅｒｅｓｕｌｔｓｓｈｏｗｔｈａｔｔｈｅｗａｖｅｌｅｎｇｔｈｏｆｐｅａｋａｂｓｏｒｂａｎｃｅｓｕｃｈａｓ７１０ｎｍｉｓｒｅｇａｒｄｅｄａｓｔｈｅｏｐｅｒａｔｉｎｇｗａｖｅｌｅｎｇｔｈ，ａｎｄｔｈｅｔｉｍｅｓｐａｎｆｏｒｍｅａｓｕｒｉｎｇｉｓｆｒｏｍ５ｔｏ２５ｍｉｎｕｔｅｓａｔ２０℃ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅｄｕｒｉｎｇｔｈｅｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ．Ｉｎａｄｄｉｔｉｏｎ，ｔｈｅｐＨｖａｌｕｅｒａｎｇｅｓｆｒｏｍ３ｔｏ１１，ｗｈｉｃｈｄｏｅｓｎｏｔａｆｆｅｃｔｔｈｅｐｈｏｓｐｈａｔｅｓｏｌｕｔｉｏｎ，ｄｏｅｓｎｏｔａｆｆｅｃｔｔｈｅｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｏｆｐｈｏｓｐｈｏｒｕｓｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ．Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｏｆｐｈｏｓｐｈｏｒｕｓｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｉｎｗａｔｅｒ；ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｒｙ；ａｍｍｏｎｉｕｍｍｏｌｙｂｄａｔｅ；ｐｈｏｓｐｈａｔｅ［１］磷是水环境中营养元素之一，是水体浮游藻类（离子色谱法）和化学方法（分光光度法）等；按照生长的限制性营养元素，水中磷的含量与水体发生化学反应过程的不同，可分为钼酸铵分光光度法、孔富营养化现象密切相关。磷在水体中的含量是生雀绿－磷钼杂多酸法以及罗丹明荧光分光光度法等。［２］产、科研中经常遇到的问题。目前磷浓度测定的方钼酸铵分光光度法，简单易行、快速准确，得到了法很多，按照测定原理，可分为阴离子交换树脂法广泛的应用。随着这种测定方法的不断推广，在应用中出现了一些问题，比如工作波长的选择、显色反收稿日期：２０１２－０４－２０应时间的选取、样品ｐＨ值范围的确定等。目前有许基金项目：国家自然科学基金项目（Ｎｏ．５１０７９０７１，Ｎｏ．５１０３９００２）多学者对钼酸铵分光光度法测定磷浓度的实验方法作者简介：申禹（１９８７—），男，云南镇雄，硕士研究生，研究方向为水力［３］进行了修正。梁运江等应用７５６ＣＲＴ型紫外可见学及河流动力学分光光度计进行６００～８５０ｎｍ范围内的波长扫描，通信作者：李玲（１９７０—），女，辽宁沈阳，副教授，研究方向为水力学及河流动力学．在６９０ｎｍ处出现局部吸收峰值，而最大吸收峰在Ｅ－ｍａｉｌ：ｌｉ－ｌｉｎｇ＠ｍａｉｌ．ｔｓｉｎｇｈｕａ．ｅｄｕ．ｃｎ７２２．２ｎｍ附近，８３０ｎｍ以上吸光度出现锯齿形波 申禹，等：钼酸铵分光光度法测定磷浓度实验方法的改进５７动，由于某些原因给出的工作波长未得到广泛认可。的浓度为１ｍｏｌ／Ｌ、液层厚度为１ｃｍ时溶液对某单色［４］黄城等认为钼锑抗法显色时间长，不稳定，磷含量光的吸收能力，是衡量分光光度分析灵敏度的重要标少时显色不明显，且受ｐＨ值影响比较大，结合海藻志。一般认为当ε＞１０４Ｌ／（ｍｏｌ·ｃｍ）时比较灵敏，ε＜［５］中磷的测定，提出苯二酚、Ｎａ２ＳＯ３还原法。吴海燕１０３Ｌ／（ｍｏｌ·ｃｍ）时不灵敏。认为钼锑抗法存在过量的钼酸铵和还原剂，造成假摩尔吸光系数与波长有关，一定浓度的溶液在不阳性显色而干扰测定，利用硝酸铋与磷钼酸铵形成同波长下，测得吸光度最大时对应的波长为最大吸收离子缔合物显色体系进行了改良。此外，对于色度波长，对应的摩尔吸光系数也最大，波长微小波动对吸［６］［７］浊度补偿、连续流动分析、水样冰冻时间的影光度的影响也最小，测定溶液浓度的精确度和灵敏度［８］响等已有较成熟的研究。另外有很多学者对于水最高。样采集、标准磷系列消解、温度、ｐＨ值、显色反应时间等问题进行探讨［９－１５］，积累了大量实验经验。以上２测量方法分析研究虽然在某些方面取得了一定的进展，但所做的根据钼酸铵分光光度法的原理，磷浓度测定的准研究工作缺乏系统性和完整性。本研究将针对钼锑确性依赖于朗伯－比尔定律的适用性和磷钼蓝的显色抗法测定磷浓度的实验中显色反应时间、样品ｐＨ值效果。影响朗伯－比尔定律适用性的因素包括单色光范围、最佳工作波长等问题逐一进行探讨，并给出应的纯度、工作波长、样品浓度等；影响磷钼蓝显色反应用这种方法测定磷浓度实验方法的改进建议。的因素包括样品ｐＨ值、环境温度、显色反应时间、干１钼酸铵分光光度法的测量原理扰离子的存在及色度、浊度等。单色光的纯度属于仪器精度的问题，干扰离子、色度和浊度与样品本身有钼酸铵分光光度法的化学机理是正磷酸盐与钼酸关，环境温度一般选择室温，而显色反应时间的控制、铵反应生成能稳定显色的磷钼蓝，光学机理为朗伯－比工作波长的选择、显色反应时的ｐＨ值等则与实验操尔定律。在酸性介质中，正磷酸盐与钼酸铵反应，生成作有关。因此磷浓度测定中应弄清以下问题：样品消黄色的磷钼杂多酸（磷钼黄），反应式为解的必要性，合适的显色时间跨度，最佳工作波长，合３－２－＋ＰＯ４＋１２ＭｏＯ４＋２７Ｈ＝适的样品ｐＨ值范围。Ｈ７［Ｐ（Ｈｏ２Ｏ７）６］＋１０Ｈ２Ｏ（１）首先，消解的目的是把总磷转化为正磷酸盐，理论室温下，在酒石酸锑钾（锑离子）或硝酸铋（铋离上用正磷酸盐配制的标准溶液及样品溶液不需要消子）的催化作用下，磷钼杂多酸立即被抗坏血酸或氯化解，因为样品的消解过程比较耗时，如果在研究中能省亚锡还原，转化成稳定的蓝色络合物———磷钼蓝略消解过程将会提高磷浓度测定效率，但省略消解过（Ｈ３ＰＯ４·１０ＭｏＯ３·Ｍｏ２Ｏ５或Ｈ３ＰＯ４·８ＭｏＯ３·程需要实验验证。２Ｍｏ２Ｏ５），这一反应称为显色反应。其次，测定吸光度应在蓝色络合物磷钼蓝稳定显磷钼蓝呈现蓝色，会选择性吸收与蓝色光互补的色时测定，同时测定多份样品（如绘制工作曲线）时很红色光（波长约为７００ｎｍ）。磷钼蓝的蓝色深度与磷有必要确定稳定显色的时间跨度，显色稳定前可能显的含量在一定质量浓度范围内（大约０．８ｍｇ／Ｌ）服从色不充分，超过稳定显色时间后显色可能褪去。显色朗伯－比尔定律，即溶液对单色光的吸收与溶液浓度及反应与温度有关，因此不同环境温度下应确定相应的单色光通过的液层厚度成正比。光的吸收程度用吸光显色时间跨度。度表示，其定义式为再次，工作波长为最大吸收波长时，同一浓度的样Ａ＝ｌｇ（Ｉｉｎ／Ｉｏｕｔ）＝ｌｇ（１／Ｔ）（２）品吸光度最大，分光度测定的分辨率高，而且在吸光度Ｉｏｕｔ其中Ｉｉｎ为入射光强度，Ｉｏｕｔ为透射光强度，Ｔ＝Ｉ为透随波长连续平滑变化的曲线上，吸光度出现峰值时斜ｉｎ光度，可表示为百分比形式。率为０，曲线最平坦，此时由于单色光不纯等原因导致朗伯－比尔定律用公式表示为波长微小扰动，对吸光度的影响最小。不同型号的分Ａ＝ａｂｃ（３）光光度计显示的最大吸收波长可能不同，因此有必要式中，ａ为吸光系数（Ｌ／（ｇ·ｃｍ））；ｂ为液层厚度通过实验确定最佳工作波长。（ｃｍ）；ｃ为溶液质量浓度（ｇ／Ｌ）。最后，显色反应一般是在酸性环境下进行，对于不若ｃ以ｍｏｌ／Ｌ为单位，ｂ以ｃｍ为单位，则写为经消解而直接进行显色反应的样品，样品初始ｐＨ值Ａ＝εｂｃ（４）可能对显色反应造成影响，目前没有这方面的资料，本ε称为摩尔吸光系数（Ｌ／（ｍｏｌ·ｃｍ）），表示吸光物质文通过实验来确定不消解的样品合适的ｐＨ值范围。 实验技术与管理５８３实验方法的改进（１）选择合适的显色反应时间跨度。参照国家标准水质总磷的测定（ＧＢｌ１８９３—１９８９，以下简称标准方法），取５ｍＬ磷标准溶液（５０ｍｇ／Ｌ）稀释到２５０ｍＬ定容，得到１．０ｍｇ／Ｌ的磷溶液。分别取１．０ｍｇ／Ｌ的磷溶液２５ｍＬ于１４支５０ｍＬ比色管中，加蒸馏水稀释至５０ｍＬ，先后滴加１ｍＬ抗坏血酸溶液和２ｍＬ钼酸盐溶液，静置３、５、１０、１５、２０、２５、３０ｍｉｎ，各取２支图２吸光度随波长的变化比色管中的磷溶液分别在７００ｎｍ波长下测定吸光度。根据吸光度Ａ的变化确定显色反应时间ｔ跨度，结果如图１所示。图３消解对正磷酸盐浓度测定的影响究中大量样品高密度的测定极不方便。通过实验确定图１吸光度随显色反应时间的变化不消解对测定结果无影响后，可减少部分实验工作量。（４）预估合适的样品ｐＨ值范围。取５支比色管本实验在室温２０℃下进行，图１表明显色反应时分别加入约４０ｍＬ水，用ＨＣｌ和ＮａＯＨ调节溶液ｐＨ间在５～２５ｍｉｎ内，吸光度无显著性变化，因此确定此值分别为３、５、７、９、１１；另取１５支５０ｍＬ比色管分成５温度下合适的显色反应时间跨度为５～２５ｍｉｎ，在此组，每组３支，其中１支作为空白对照，另外２支形成显色反应时间跨度内，溶液能稳定显色，吸光度测定应重复对照，用移液管分别加入０．５ｍＬ磷浓度为５０在此时间跨度内完成。显色反应也是一种化学反应，ｍｇ／Ｌ的磷标准贮备溶液，每组空白对照分别加蒸馏反应时间与温度有关，实际操作时应根据环境温度按水至５０ｍＬ，重复对照则各加入大约３０ｍＬ水，用此方法确定合适的显色反应时间。ＨＣｌ和ＮａＯＨ调节溶液ｐＨ值分别为３、５、７、９、１１，调（２）确定最佳工作波长。取１．０ｍｇ／Ｌ的溶液２５节好后总体积小于５０ｍＬ，滴加ｐＨ值对应相等的水ｍＬ于２支５０ｍＬ比色管中，加水至５０ｍＬ，并加抗坏至５０ｍＬ。此时获得ｐＨ值分别为３、５、６、７、８、９、１１，血酸和钼酸盐进行显色反应，在合适的显色时间跨度磷质量浓度均为０．５ｍｇ／Ｌ的系列溶液，加抗坏血酸内，分别设定波长为６８０、６９０、７００、７０５、７１０、７１５、７２０、和钼酸盐进行显色反应，测定吸光度。实验测得吸光７３０ｎｍ，测定并比较吸光度，结果如图２所示。图２表度随样品ｐＨ值的变化如图４所示。明，当波长为７１０ｎｍ时，吸光度达到峰值，峰值很平缓，在７０５～７１５ｎｍ范围内吸光度基本无变化，且波长的微小波动对浓度测定基本无影响，由此确定实验最佳波长为７１０ｎｍ。（３）分析消解对正磷酸盐浓度测定的影响。取已知浓度正磷酸盐溶液，分别经过消解和不经过消解后测定磷浓度，结果如图３所示。图３表明，正磷酸盐溶液经消解与不经消解，测得吸光度无显著性变化。不经消解测定磷浓度主要用于实验研究，由于消解过程需要加热３０ｍｉｎ，而且要待图４样品ｐＨ值对显色反应的影响溶液冷却，比较耗费时间，对于像吸附磷一类的实验研 申禹，等：钼酸铵分光光度法测定磷浓度实验方法的改进５９图４表明，ｐＨ值在３～１１范围内，同一质量浓酸盐浓度时无需消解，一般也无需调节样品初始ｐＨ度、不同ｐＨ值的磷酸盐溶液，用钼酸铵分光光度法测值（３～１１范围内）。得的吸光度值相差不大，故实验中可不考虑ｐＨ值对（２）测定前预估样品磷质量浓度并稀释至实验标显色反应的影响。事实上，由于抗坏血酸和钼酸盐溶定曲线的线性范围内，即确保磷质量浓度在０．１～０．８液均为强酸，经实验测定，即使样品溶液ｐＨ值为１２，ｍｇ／Ｌ范围内进行测定。显色反应后ｐＨ值也小于２，足以满足显色反应酸性（３）如果样品量较少，可换用２５ｍＬ比色管进行环境的要求。显色反应，钼酸盐溶液和抗坏血酸溶液相应减半，对（５）确定工作曲线及合适的磷质量浓度范围。配测定结果无影响。当需要同时测定多组样品的磷质制磷质量浓度为０．０、０．０２、０．０４、０．１２、０．２、０．４、０．６、量浓度时，可使用滴定管滴加抗坏血酸和钼酸盐，使０．８、１．０ｍｇ／Ｌ的标准系列正磷酸盐溶液，在最佳工作用一次性滴管向比色皿里添加反应液，测完后用注波长下和合适的时间跨度内测定吸光度，实验数据见射器抽出溶液，可在不影响实验精度的前提下提高图５。并利用已知浓度溶液进行回收率实验。测定效率。（４）可以采用空白溶液对分光光度计进行标零，以水作参比，标定吸光度为０，所测吸光度不需再扣除空白试样的吸光度。参考文献（Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅｓ）［１］魏复盛．水和废水监测分析方法［Ｍ］．北京：中国环境科学出版社，２００２．［２］ＧＢ１１８９３—１９８９水质总磷的测定：钼酸铵分光光度法［Ｓ］．北京：中国标准出版社，１９９０．［３］梁运江，谢修鸿，许广波，等．磷钼蓝比色法合适工作波长及线性范图５工作曲线及线性范围围的探讨［Ｊ］．中国环境监测，２００７（１）：３５－３７．［４］黄城，周燕，曾淦宁，等．抗坏血酸－钼蓝分光光度法测定海藻中磷图５表明，根据样品质量浓度小于０．８ｍｇ／Ｌ的的研究探讨［Ｊ］．海洋环境科学，２００９（增刊）：７６－７８．２［５］吴海燕．“磷钼蓝”分光光度法的改良试验［Ｊ］．粮食科技与经济，实验数据可拟合出线性回归方程为ｃ＝２．０２６Ａ，Ｒ＝１９９９（４）：２７－２８．１．０００，Ｐ＜０．００１，并且回收率在９８％～１０３％之间。［６］张玉华，林凯，周凤华．测定总磷时的色度浊度补偿［Ｊ］．江苏环境若可读取的最小吸光度为０．００１，则最低检测限约为科技，１９９９（３）：４１－４２．０．００２ｍｇ／Ｌ。同时磷质量浓度为１．０ｍｇ／Ｌ时，测定［７］李俊，刘芳，华桂珍．流动注射光度法测定水中磷［Ｊ］．环境监测管结果开始偏离拟合的直线，说明吸光度随磷质量浓度理与技术，２００５，１６（５）：２７－２８．［８］赵建刚，陈园．连续流动分析法测定不同冰冻时间水样总磷浓度的线性变化的磷质量浓度范围为０～０．８ｍｇ／Ｌ。因此考变化［Ｊ］．分析仪器，２０１０（５）：７０－７２．虑到测定结果的精度，测定时应预估样品磷质量浓度，［９］奕向晶．测定总磷中显色温度对显色时间的影响［Ｊ］．黑龙江环境并稀释至０．１～０．８ｍｇ／Ｌ范围内进行测定，这样钼酸通报，２０００，２４（４）：６８－７２．铵分光光度法就可测定任意质量浓度的磷。［１０］李云．钼酸铵分光光度法测定总磷的有关问题探讨［Ｊ］．仪器仪表与分析监测，２００６（４）：４０－４１．４结论［１１］马学宝，江利．总磷测定校准曲线绘制方法的对比试验［Ｊ］．科技资讯，２００９（３６）：１９４．本文依据钼酸铵分光光度法的测量原理，介绍了［１２］丁春荣，石慧．钼锑抗分光光度法测定总磷问题的讨论［Ｊ］．污染采用钼酸铵分光光度法测定磷浓度的实验方法，并对防治技术，２００９（４）：１０６－１０８．其进行了修正，可得到如下结论：［１３］王晓玉，罗志华，刘鸿雁．钼酸铵分光光度法测定总磷影响因素的（１）测定前根据实验确定最佳工作波长为７１０探讨［Ｊ］．黑龙江环境通报，２０１０（４）：４１－４３．［１４］索有芳．钼酸铵分光光度法测定总磷的主要影响因素［Ｊ］．青海环ｎｍ，确定实验温度条件下的显色时间跨度，如在室温境，２０１０（２）：８９－９０．为２０℃时吸光度测定操作可在加完钼酸盐溶液后［１５］钟卉芳．钼酸铵分光光度法测定总磷有关问题的探讨［Ｊ］．广东科５～２５ｍｉｎ内完成，确定实验标定曲线。另外测定正磷技，２０１１（６）：１８－１９．'