高效液相色谱法和分光光度法测定中药有效成分

'兰州医学院硕士学位论文高效液相色谱法和分光光度法测定中药有效成分姓名：董钰明申请学位级别：硕士专业：生药学指导教师：段生玉;封士兰2001.6.1 AbstractThechemicalconstituentsoftraditionalChinesemedicineanditspreparationsareverycomplicated，especiallywhenthepreparationiscomposedoftwoormorekindsofChineseherbs．InordertocontrolthequalityofChineseherbanditspreparation，wedeterminedthecontentsofmainingreditrdsinShenshaoTablet，BaiheGujinPill，FufangChongcaoKeliandcelerybyhighperformanceliquidchromatographyandcolorimetricmethodwhicharemodemanalyticalwaysandestablishedtheanalyticalmethodsoftheirqualitycontr01．TheresultsofthisresearchshowthatthecontentsofmaineffectiveingredientsinShenshaoTablet，GinsenosidesR91，ReandPaeonoside，weredeterminedbyHPLCquicklyandaccuratelyatthesametime．ThecontentofpaeonosideinBaiheGujinPillWaSalsodeterminedbyHPLCandtheotherconstituentshavenodisturbance．ItprovidesascientificwayforthequalitycontrolofShenshaoTabletandBaiheOujinPill．ThecontentofmannitolinFuFmigChongcaokeliwasalsodeterminedbyclorimetricway．Wedeterminedthecontentofflavonoidsindifferentpartsofgreencelerybycolorimetricmethod．Theresultofthisinvestmentprovidesasciendficevidenceforfurtherexploitationandusageofcelery． 中文摘要中药及其制剂中化学成分十分复杂，单味药材本身就是多种化学成分的混合物，复方制剂所含的化学成分就更为复杂。为了研究控制中药材及其制剂的质量问题，我们采用现代分析手段(HPLC和UV，ⅥS)，对一些中药复方制剂和芹菜及芹菜汁中的主要有效成分进行了含量测定：采用HPLC法对参芍片中的主要有效成分人参皂苷Re、Rgl和芍药苷的含量同时进行快速准确的测定，对百合固金丸中芍药昔的含量也可以进行准确方便的测定，制剂中其他成分不干扰。对复方虫草颗粒中的甘露醇进行了比色测定，对该制剂中的甘露醇有很好的专属性，其他成分对测定无干扰。通过对这些中药制剂有效成分测定的研究，为有效地监控这些制剂的质量提供了科学的依据。另对不同栽培品种芹菜及其不同部位中总黄酮用比色法进行TN定，并对芹菜汁中的总黄酮的含量进行TN定，为芹菜的进一步开发利用提供了科学的依据。 一、近年来中药成分分析研究概况我国中医历来用以治病的药物，概称为“中药”。中药是指依据中医学的理论和临床经验应用于医疗保健的药物。中药包含中药材、饮片和中成药(成方制剂)【1】。如甘肃地道药材有当归、黄芪、大黄、党参和甘草等。中药制剂是根据中医药理论和用药原则由单味或多味中药材(或中药浸出物、提取物)按规定的处方和方法加工而成的单方或复方制剂。如六味地黄丸、百合固金丸等。中药是祖国医药伟大宝库的重要组成部分，它具有几千年的历史，疗效显著，品种繁多，服用方便，是中华民族的传统瑰宝，为中华民族的繁衍生息作出了不可磨灭的贡献，为我国人民防病治病起着积极的作用。近年来中药及其制剂在品种、产量、生产规模、提高内在质量、引进高新科学技术和新产品的研制方面都有较大的发展，在国民经济中占有重要的地位，在国际市场上也有较高的声誉。本文就近年来中药成分分析的研究作一概述。1、中药分析的特点中药制剂以大蜜丸、水泛丸、浓缩丸、颗粒剂、片剂、口服液和汤剂等在临床中广泛使用。除了对原药材的鉴别、检查和含量测定以外，更重要的是建立对中药制剂的质量控制体系。自二十世纪50年代以来，随着中药制剂的发展，我国政府和医药学界高度重视中药质量标准化的问题，将中药及其制剂的质量管理纳入了法制化、规范化的轨道。中国药典从1963年版开始分为两部，其中第一部收载中药材和中药制剂。中国药典(1995年版)已收载有中药材522种，中药制剂398乖P。而中国药典(2000年版)收 载中药材534种，中成药458种m，比1995年版药典有大幅度上升。分析方法也由现代检测方法代替了传统的感观检查方法。如采用显微鉴定技术、化学鉴别方法、色谱法如薄层色谱法对制剂所含中药材进行鉴别：用薄层扫描法、HPLC法、Gc法等对部分药物中已明确的有效成分进行含量测定等。中药分析与化学药分析相比，有其不同之处，归纳起来，有如下一些特点【4lI．I中药制剂中有效成分难以确定。根据中医药理论强调整体观念的原则，中医临床用药的主流是大复方，产生疗效的是全成分的协同作用，难以用一种成分作为疗效指标。因此质量控制应综合考虑。1．2中药及其制剂中化学成分十分复杂。单昧药材本身就是多种成分的复杂混合物，复方制剂所含的化学成分就更复杂，所以说中药制剂分析的对象是复杂的混合物。另一方面，有些中药的有效成分尚不十分清楚，给分析带来了一定的困难。而且，中药中有效成分与无效成分的概念也是相对的，因此中药分析应根据处方确定所要测定的组分，选择合适的检测指标。1．3中药制剂是严格按中医理论和用药原贝Ⅱ而组方的。在进行分析方法研究时，首先应进行组方分析，分清各味药在处方中的君、臣、佐、使地位。应抓住君药i贵童药及毒剧药，着重进行分析检测研究。当然如果有条件，对处方中诸药均进行橙测，．喔4最为理想，但目前还很难傲到。1．4中药及基制剂中，各成分的含量高低不一。许多成分的含量很低，有的甚至为十万分之几，．百万分之几，这给分离检测带来许多困难。4 1．5中药制剂的剂型较多，因制备方法不一，存在状态不同，各有特点。所以在含量测定方法上除了考虑方法的专属性，灵敏性外，尚须注意药材在制剂中的存在形式、辅料对测定的影响及各成分间的干扰。此外，分析中药时，样品的制备，取样的均匀及提取、分离、纯化等，都比化学药分析复杂。2．近年来中药分析常用方法及其应用概况一个理想的质量标准应能全面地反映中药及其制剂的质量，能反映出质量与疗效、疗效与物质基础的关系，其分析方法应简便、快速、准确且有专属性。目前，常用于中药分析的方法有下面几种【”。，2．1化学分析法。包括重量法和容量法。化学分析法为经典的分析法，方法的精密度高，但不如光谱法等仪器分析方法灵敏、专属，当测定组分含量较高时方可应用，且多用于组成较简单的制剂，测定前还需进行提取、纯化等处理过程，以排除干扰。2．2紫外一可见分光光度法16I。该法灵敏、简便。由于中药成分复杂，不同的紫外吸收光谱往往彼此重叠、干扰，因此在测定前必须经过提取、纯化等步骤，以排除干扰。同时应取阴性对照品在相同条件下测定，应无吸收。此外，比色法在中药分析中也有应用，一般用于一类成分总量的测定，如总黄酮，人参总皂苷，总生物碱的含量测定等。2,3薄层扫描法(TLCS)171o该法具有分离效能高，快速、简便等特点。TLCS虽然精密度和准确度不如HPLC，但它可以做为HPLC的补充，用于无紫外吸收，或不能用HPLC测定的组分。 ，，2．4高效液相色谱法(HPLC)ISl。高效液相色谱法分离效能高，分析速度快，应用范围广，其重现性和准确度均优于TLCS。中国药典(1995年版)一部已有12种药材和制剂使用HP[。C测定含量。中国药典(2000年版)一部有105个品种的中药材和中药制剂采用HPLC测定含量，是1995年版中国药典采用HPLC测定含量的中药品种的近9倍【“。2．4．1HPLC在中药材及其质量分析方面的应用。中药质量控制和质量标准的制定势在必行。但由于中药成分的复杂性，特别是复方制剂，给这方面的工作造成很大困难。HPLC技术在这方面有很大优势。如甘草质量评价常以甘草酸为指标，用RP．HPLC以线性回归法测定甘草酸含量，结果表明含量随产地、药材粗细、质地、断面颜色的不同而异，断面黄、质地硬脆、折断粉性大者甘草酸含量高【lOl，为评价甘草品质提供了科学依据。用RP-HPLC对不同规格和产地党参中苍术内酯的测定，结果表明只有山西潞党参样品中存在，而潞党参历来被认为是党参药材的上乘之品，故苍术内酯的检出可作为潞党参的重要鉴别和质量评价手段fl“。国防贸易中10．HAD00．羟基．2癸烯酸)作为鉴定蜂皇浆质量的重要指标，现已实现了RP．HPLC快速测定“21。HPLC还用来测定蜂皇浆胶囊中10．HDAt”1、冬虫夏草及虫箪乌鸡丸中麦角甾醇的测定1141、进口血竭中血竭素的RP-HPLC测定{151、虎杖及其制剂中自黎芦醇苷的RP-HPLC测定【161、桔红中柚皮苷的RP．HPLC测定∽l，以及香连丸、左金丸、朱砂安神丸等8种成药和温胆汤中小檗碱的测定I懈、当归调经露中阿魏酸的测赳191等。2．4．2在中药材资源开发方面的应用。对中药材化学成分进行系统研究，为药材资源开发利用提供科学依据是当前中药研究的热点之一。三尖杉属植物海南业榧与三尖杉的树皮中含三尖杉醅碱与高三尖杉酯碱，具抗癌活性， 临床用于治疗自血病。HPLC用于这类生物碱的测定，为寻找药用植物资源提供了新手段【2m。用RP．HPLC分离测定侧金盏花中强心苷含曩，结果表明吉林产侧金盏花中主要含苷元A、B、加拿大麻苷、铃兰毒苷和毒毛旋花子苷元等强心成分【21】。采用离子抑制RP-HPLC技术测定人工引流熊胆中熊去氧胆酸，使其与差向异构体鹅去氧胆酸、胆酸、猪去氧胆酸和去氧胆酸等获得完全分离[22】。用HPLC测定采用组织培养法诱导出黄连愈伤组织中小檗碱含量，结果表明与黄连根茎相当，为黄连工业化生产提供了依据【231：对霍克斯虫草与冬虫夏草水解氨基酸、水溶性及脂溶性维生素等成分进行了对比分析【24】。对毛叶五味子及毛脉五味子活性成分进行了测定，结果表明种子中木脂素较根茎高，种子中五味子酚含量最高，其次为甲素，为新的药物资源开发提供了科学依据【25】。香茶菜属植物中二萜成分具抗肿瘤等多种生理活性，为开发药材资源用HPLC测定蓝萼香茶菜中蓝萼甲素含量【261。车前为常用中药，目前临床大多以种子入药，其它部位较少用。用HPLC测定地下部分、地上部分和种子中活性成分桃叶珊瑚苷含量，发现地下和地上部分含量较高，认为车前以全草入药更为合理口”。HPLC还用于北山楂和云南山楂中主要有机酸和维生素c的比较研究∞】。2．4．3最适采收季节的确定。采收期对中药材品质影响较大。如用RP．HPLC测定不同月份采收的东北和内蒙古产展枝唐松草中抗癌活性成分唐松草新碱，结果表明5月份(发芽前)采收者含量最高【291。对不同产地、不同生长时间、不同规格的麦冬块根中麦冬皂苷B、D进行测定，以寻找麦冬中皂苷成分的积累规律，为合理利用麦冬资源提供了依据【30】。葛根中黄酮含量受产地、采收季节影响较大，用梯度洗脱、外标工作益线法测定了2—12月间采集的葛根中葛根素含量，结果表明6月份含量最高f31)。 2．4．4在中药炮制和提取工艺方面的应用。炮制是中药生产和临床应用的重要环节。研究炮制机理、探索炮制前后化学成分变化、合理制定炮制工艺是当前中药炮制研究的薄弱环节，HPLC在这方面的应用还刚起步。厚朴饮片炮制方法多达14种，常用姜制品。为探讨姜制的影响，以厚朴酚含量为指标，用HPLC对不同方法炮制的厚朴饮片进行了测定，结果表明清炒品厚朴酚含量最高；姜炙、姜煮、姜浸品中以姜炙品含量最高{“。用HPLC比较了醇沉法、高速离一II,法和超滤法对桂皮中桂皮酸含量的影响133】。2．4．5在体内活性成分分析方面的应用。HPLC用于测定体内药物及其代谢产物，可为药代动力学、临床药理和毒理学研究提供科学依据。青藤碱是从毛青藤中提取的，临床用于类风湿性关节炎的治疗，建立了RP．HPLC测定血浆中青藤碱的方法f3“。阿魏酸是活血化瘀中药当归、川芎的有效成分，其钠盐当归素具抗血小板聚集、抑制血小板释放反应作用，可用桂皮酸为内标，uv(312rim)检测血样中阿魏酸含量㈣。右旋儿茶素在植物界分布广泛，具保肝解毒作用，用RP．HPLC测定了其血浆浓度及药代动力学参数㈣。随着HPLC技术的不断发展，这一技术在中药研究方面的应用必将得到进一步的推广。3．近年来中药分析方法的进展近几年来，随着分析手段和方法的飞速发展，中药分析呈现出新的发展趋势。其进展主要有：3．1计算药物分光光度法的应用。主要有双波长和三波长分光光度法m1、差示分光光度法啪3，导数分光光度法‘3⋯，系数倍率法‘40]，卡尔曼 滤波法，正交函数分光光度法⋯1等。3．1．1双波长法和三波长法。双波长法盼特点是用一个吸收池和两束不同波长的光(测定波长为h和参比波长k)进行测定，通常干扰组分吸收光谱在这两个波长处具等同吸收。定量信息是试样溶液对两样单色光的吸收度差值(△A)。如波长对选择恰当，可消除共存组分的干扰，大大简化了测定手续。如选用278nnl(k)～265nm(k)波长对测定小儿肺熟咳喘口服液中黄芩苷㈦。三波长法是基于在于扰组分的吸收光谱中具有线性吸收的三个波长上进行吸收度的测量，然后通过计算求得被测组分含量。该法关键在于选择三波长组合，要求干扰组分三点吸收值成线性．而待测组分的△A值尽可能大。三波长组台确定的方法有等吸收点法、作图计算法和计算机选择法等。二陈丸是由陈皮、制半夏、茯苓、甘草等组成的传统中成药，陈皮为主药，其中陈皮苷的测定选择九l为318nm，k为286nm，k为275rim波长组合，定量信息△A=A2一(九2-九3)Al+(xl—x：)A3／k．一k‘4”。痹症敞由马钱子、川乌等组成，对其中士的宁的测定，选用252nm，238nm，282nm波长组合，△A为定量信息，按回归方程计算含量[44j,用315rim，325nm，340nm波长组合测定了由十二味中药组成的清热解毒注射液中绿原酸含量【45l。用单波长分光光度计(手动式)进行双波长或三波长测定在实际工作中巳得到推广应用，只要波长组合选择适当也能获得满意结果。如张清民等用三波长分光光度法测定喜树碱多相脂质体中喜树碱含量，实验可在单光束分光光度计上进行【461。3．1．2差示分光光度法。一般是取供试液～式两份，一份加酸、碱、缓冲液或其它试剂(发生某种化学反应)，使待铡组分定量地转变为另一种形式，同时产生特征光谱变化，而共存组分不发生变化，置样品池中；另一份加空9 白试剂置参比池中，于适当波长处测其吸收度差值(△A)，AA为被测组分的定量信息，如虎杖中蒽醌的含量测定Ⅲ1。试样粉末经提取后的甲醇溶液一式两份，一份用O．5％醋酸镁甲醇液稀释至一定体积；另一份仅用甲醇稀释。由于大黄素甲醇液Lmax为430nm而加入醋酸镁显色后)1．max移至505nm，虎杖中非蒽醌类成分不与醋酸镁甲醇液显色，因此505nm处两份试液的△A值可用来定量。利用胆红素在光照下易氧化变色其吸收光谱发生显著变化的性质，在453nm波长处测定其光照前后吸收度差值(AA)，△A与胆红素浓度呈线性关系。用该法测定了六应丸、六神丸和牛黄消炎丸中胆红素t“j及牛黄降压丸中胆红素【49J的含量。单光束手动式分光光度计同样可用于差示分光光度法的测定．用空白试液调零即可。林黎明用差示导数光谱法测定金银花和银翘解毒片中总绿原酸含量f50)。根据钨酸钠与绿原酸之间＆吖匕学反应声生特征峰位移，而其它共存组分与辅料不发生反应的特性使大部分共存组4-钓干扰得以排除，个别成分的干扰又通过～阶导数光谱迸一步排除。将试样提取液～式两份，一份加pH6．0磷酸盐缓冲液置参比池中；另一份加硝酸钠及钨酸钠后置样品池中，在430nm．330nm范围内绘制一阶导数光谱，测蹙343nm、385nm处的振幅值作定量信息。3．1．3导数光谱法。根据干扰组分吸收曲线的特征，选用合适的导数阶数。目前应用较多的是几何校正法，即用导数光谱上合适的振幅作定量信息，通常用白记式分光光度计。振幅测量有切线法、峰谷法、峰零法、面积法等。近年来用代数校正法的报道也常见，这是根据导数光谱的意义将测得的吸收值经代数运算给出定量信息的方法，既适合于自记式也适合于手动式分光光度计。如国产751型等仪器，从而使导数光谱法在基层单位也较易推广应用。在中药活性成分含量测定方面，目前以导数光谱法使用频率最高。该法有三 个重要参数，即微分阶数(n)、波长间隔(△)及中间波长(Xm)。11的选择主要视干扰组分吸收曲线形状而定，一般n越大分辨率越强，但信噪比会降低；△越大测定灵敏度越高，但分辨率会降低；L,n选择原则是无关吸收在km，；km，的导数值相等或接近相等而待测组分的导数曲线在该处的形状较为特征、易于辨认。兹将该法在测定中药活性成分方面的若干应用列于下表。附表导数光谱法在中药活性成分测定方面的应用3．1．4正交函数法。正交函数式应用于分光光度分析形成了消除干扰的新技术。用正交多项式的的系数Pj作为混合物中待测组分定量信息时称Pj法，此法还有△Pj法(应用于示差分光光度法中的正交函数法)和Pw法f复合多项式法)。该法有四个重要参数：正交多项式次数(j)、波长点数(N)、波长间隔(△)和中间波长(^m)或波长范围。如小建中合剂中芍药苷的 测定就是采用正交函数法【511。该制剂由自芍、桂枝、炙甘草等多味中药组成。在210nm～250nm之间芍药苷呈二次吸收曲线而干扰组分呈一次吸收曲线，故在此区间每隔lnm分别测定二者吸收度并输入计算机，用自编程序筛选出测试条件。由于该法在条件筛选时计算工作量很大，计算机的应用使工作大大简化。结果表明在波长217nm一247mm，间隔5nm，采用七点二次多项式进行小建中合剂中芍药苷的测定，结果满意。青黛的氯仿提取物中有靛蓝和靛玉红，用六点二次多项式正交函数法测定靛蓝含量可消除靛玉红的干扰Ⅲj。3．1．5系数倍率法。导数光谱法能将两个或两个以上的重叠光谱分开，对多组分的中药分析是个重要的手段，但对于非特征性吸收的校正则需要用高阶导数光谱，因而受到仪器条件的限制。系数倍率导数光谱法是将导数光谱作为一独立的光谱体系，再运用数学方法获取定量信息。测定波长的选择和系数K的确定是本法的关键。现在已开始用计算机按编定的程序选择测定波长和确定K值，不但可在双波长分光光度计，也可用手动式单波长分光光度计来完成测定。对双黄连注射液(由黄芩、金银花和连翘经提取后制成)中活性成分黄芩苷、绿原酸、连翘苷的测定，采用系数倍率法可不经分离直接测定【531。选定的测定参数分别为：黄芩苷(276nnd333nm，K=I．0017)、绿原酸(324nm／312rim，K=0．9359)、连翘苷(227nm／304nm，k=1．0019)。3．2多维色谱及联用技术的应用。目前应用较成功的有：二维薄层色谱用于鉴别，气一质联用用于挥发性成分的测定，裂解气相色谱．聚类分析法用于鉴别。3,3模式识别法的应用。模式识别法，是以标准中药材为模式，将其提取物经色谱(TLC，HPLC，GC)及光谱(UV，取，NMR，MS)分析获得 化学信息，经数量化后，将全部数据输入计算机进行数据处理，经特征抽提聚类分析，然后建立判别函数。蒋被测样品数据与标准模式同样数据比较，就可以对同类中药进行模式识别。3．4药理、生物测定技术的应用。根据中医药理论及药物的综合效应来设计与临床效果平行的生物测定方法控制中药及其制剂的质量，而暂时不必过多地考虑制剂复方组成的复杂性，同时测定样品也可不需要精制和分离。此外，也有用测定中药中微量元素来鉴别药材或辅助鉴别取得成功的实践。如利用微量元素鉴别中药贝母、麦冬、黄芩等，结果令人满意【54】。3．5毛细管电泳法。毛细管电泳(CE)是指以高压电场为驱动力，以毛细管为分离通道，依据样品中各组分之间淌度和分配行为上的差异而实现分离的一类液相分离技术m】。CE具有灵敏度高、柱效高、分析速度快、进样量少，实验成本低、应用面广等特点，与色谱法相比，克服了HPLC实验成本高，GC应用面窄，TLCS柱效低，重现性差，时间长等缺点，成为继HPLC之后发展迅速的分析方法之一。张国华脚1利用毛细管区带电泳(CZE)对黄连及其成药中的7种小檗碱型生物碱进行了分离，同时测定了其中的小檗碱、巴马亭和药根碱的含量。Honda等㈤用cZE测定了芍药根中芍药苷和氧化芍药苷的含量；Hemann等158】对钩藤属植物Uncariatomcntosa中6种羟基吲哚类生物碱进行了分离分析；此外，还应用胶束电动毛细管电泳法(MECC)，毛细管等速电泳(CITP)等方法对许多中药进行了分析。 3．6色谱指纹图谱(图象)分析在中药鉴别中的研究和应用1591。现代“指纹(fingerprint)”鉴定始于十九世纪末20世纪初的犯罪学(cr—iminology)和法医学。指纹鉴定的过程一般经过：分析“Analysis”，比较“Copmarison”，评价“Evaluation”和校验“Verification”。中药色谱指纹图谱鉴别是借用了法医学的概念，但不是概念的重复：即由次生代谢产物组成的中药提取物的色谱指纹图谱不具备个体的绝对唯一性，更强调的是物种色谱特征的唯一性和同种个体之间的相似性。中药色谱指纹图谱鉴别须经过制备、分析、比较和校验。分析色谱指纹图谱要求“准确的辨认accuratereco—gnition”而不是“精密的测量precisemeasurement”；比较供试品与对照品的包谱指纹图谱是要求“相似similarity”而不是“相同identity”；评价色谱比较的结果，是根据色谱指纹图谱的模糊属性(fuzzyfeature)，着眼于宏观的规律性的特征分析，即着重辨认完整色谱的“图貌”，而不是求索细枝末节。观已为大家熟知的美国FDA允许草药保健品申报资料可以提供色谱指纹图外，WHO?在1996年草药评价指导原则中已有规定，如在plantprepare-mion及finishproducts的章节中均提到如果草药的活性成分不明，可以提供色谱指纹图谱以证明产品质量的一致Kath／eenFimMendola1997年在NutritionScienceNews的草药生产厂的实验室及实验室标准一文中提到草药色谱指纹图谱可以提供复杂成分的定性甚至定量的信息，考察在生产过程中有无变化，或者监测其成分是否与标签声称的内容一致。 欧共体对草药质量的指南中也称单靠测定某有效成分考察质量的稳定性是不够的，因为草药及其制剂是以整体当作活性物质。色谱指纹图谱尤其薄层色谱的鲜明的显色的指纹图谱是很有用的，譬如山楂和金丝桃。国外关于植杉药色谱指纹图的研究论文最近日渐增多，他们指出色谱指纹图鉴别，目的是解决成分复杂、有效成分不明的草药如何监测和证明产品批问质量的稳定。如果成分比较简单，如银杏叶的萜类内酯主要只有四个，都有Ii学对照品，可以实现四种内酯的含量测定，内酯部分的色谱指纹图就没有必要了，他们的企业标准只做黄酮醇苷的色谱指纹图，国外生产厂家工艺要求比较严格，所以他们研究色谱指纹图主要是针对原料药材的质量，他ff]发现同一品种的草药不同产地，不同采集时间，所含成分都有可能不同，也知道原料质量稳定不是一件易事，所以要求厂家必须固定品种、产地和采收季节葡加工方法，此外，他们的另一种做法是标化提取物，不同批次的原料在投料生产前“勾兑”，或者不同批次的提取物“勾兑”，使最终产品的质量基享稳定在～个水平上(±5一j0％)。德国银杏叶提取物制荆是一个很突出的佩_『I。他们的固体剂型产品色谱指纹图谱的重现性十分良好，含量测定相当稳定(浮动范围±!％)。中药色谱指纹图谱(图象)的实验研究难度较大是不言而喻的，涉及的技术问题比较多，比如药材本身质量的稳定性，色谱方法的选择，辨认色谱指纹图谱的方法问题等，需要在广泛的范围和相当的一段时间加以解决。4．中药分析的意义中药是我国的重要资源，面临我国加入WTO步饯的加快，建立中药现 代化的质量标准显得更加重要。长期以来，我国的大量中药以原药材或简单加工后出口国外，附加值低，而国外则采用现代化的生产和检测手段，对其进一步加工返销国内，其价格却翻了好几倍；另一方面，由于中药没有建立可行的质量标准，使许多名优传统中成药的出口受到限制。因此，对中药进行分析，建立科学的质量标准，使中药的质量大大提高，是中药现代化、国际化的迫切需求。中药成分复杂，对其分析可以起到鉴别真伪，区别优劣的作用，这对于保证临床合理，科学，安全用药是至关重要的。也对保护地道药材，打击假冒伪劣提供科学的依据。因此，中药的质量控制，还有许多工作要做，如何确定中药质量评价的指标是关键的问题。只有在探明中药及其制剂的作用机理，主要有效成分及相互关系后，才能提出评价其质量的客观指标，制定出比较完善的质量标准。只有提高中药的质量，才能使中药更好地发挥防病、治病的作用，才能与国际标准接轨，才能发挥其重要的资源优势。 参考文献1．徐国钧主编，生药学第二版，北京，人民卫生出版社，1995，5：l2．中华人民共和国药典委员会主编，中国药典，(1995年版)一部。3．中华人民共和国药典委员会主编，中国药典，(2000年版)～部4．蔡美芳主编，药物分析，北京，中国医药科技出版社，1996，l：238-2395．刘文英主编，药物分析，北京，人民卫生出版社，1999，1l：3276．安登魁主编，药物分析，济南，济南出版社，1994，8：397．何丽一，色谱，1987：5(57：292—297)8．赵守孝，药学通报，1987；22(67：371)9．罗军，解放军药学学报；2000，16(4)：224—22510．从晓东等，中草药，1991；22(11)：52611．王峥涛等，中国药科大学学报，1992；23(1)：3812．戴富宝等，药物分析杂志，1990：10(2)：10813．周淑平，中国药学杂志，1991；26(2)；9914．李云华等，药学学报，1991：26(10)：76815．鲁静等，中国中药杂志，1991；16(10)：615 16．童平等，中草药，1990；21(11)：1617．黄美声等，中草药，1990；21(5)：1518．郭平等，华西医科大学学报，1991；22(1)：9019．黄宗玉等，中成药，1991：13(8)：1120．王慕邹等，药物分析杂志，1991；11(6Z)：33321．谷学林等，白求恩医科大学学报，1990．16(2)：13122．王杏珍等，药物分析杂志，1991；11(2)：10423．芮和恺等，中药材，1990；13(3)：824．郭锡勇等，中草药，1990；21(3)：1325．宋万志等，中药材，1990；13(II)：1526．张之桐等，中国中药杂志，1991；16(II)：67927．郭月秋等，中国中药杂志，1991：16(12)：74028．李海生等，中草药。1990；21(4)：1329．周誉等，中草药，1990；21(9)：1330．余伯阳等，中草药，1991，22(8)：34531．仲英等，中草药，1992，23(6)：29432．胡玉萍等，中国中药杂志，1991，16(9)：53533．朴奉花等，中国中药杂志，1991，16(9)：54818 34．张先洲等，中草药，1991：22(10)：44635．燕福生等，首都医学院学报，1991；12(1)：2736．潘海燕等，药学学报，1991：26(5)：37137．StewartJt，eta1．Jparm．Sci．，1972：61(3)：43238．DayST，eta1．JParm．Sci．，1978；57：151839．DuezP，etal，JChromatogr．1984：303(2)：39140．徐兆昌，国外医学，药学分册，1985，1：47—5341．安登魁主编，药物分析，北京，人民卫生出版社，1994，6：35842．杨桦等，中国中药杂志，1991；16(8)：47443．薛漓等，中成药，1991；13(2)：1444．任大伟等，中国中药杂志，1991；16(9)：54545．张广强等，中国中药杂志，1990；15(8)：3346．张清民等，沈阳药学院学报，1991；8(1)：4847．王少云等，中草药，1993：24(8)：40748．倪坤仪等，药学学报，1990；25(10)：76349．倪坤仪等，中国药科大学学报，1992；23(1)：6150．林黎明，中国中药杂志，1991；16(5)：28219 51．杨士伟等，中成药，1992；14(2)：1052．陆瑞兰等，中药材，1990；13(11)：3453．栾士香等，中国中药杂志，1991；16(10)：60254．蔡美芳主编，药物分析，北京，中国医药科技出版社，1996．122455．罗国安等，色谱，1995，13(4)：25456．张国华等，色谱，1995，13(4)：24757．HondaSeta1．JChromatogr，t990：515：65358．KenndEeta1．Chromatogr，1990：514：38359．谢培山，现代化中药产业关键技术系列研讨会(一)国际色谱指纹图评价中药质量研讨会，学术报告论文集，广州，2001，i3-17-i3—21。20 二、高效液相色谱法(HighPerformanceLiquidChromatography．HPLC)测定中药有效成分高效液相色谱法(HPLc)以其分离效能高，分析速度快而引起人们的高度重视。中国药典(2000年版)一部收载了105个品种的中药材采用HPLC测定含量，是1995年版中国药典采用HPLC测定含量的中药品种的近9倍。由此可见，HPLC正在发展成为一种成熟和常规的方法而广泛用于中药有效成分的分析。我们选择了由北京空军总医院研制，河北天浩制药厂生产的中药制剂参芍片和传统中药成方制剂百合固金丸，采用HPLC法对其中的主要有效成分建立了含量测定的方法。我们对参芍片中人参皂苷Rg．，Re和芍药苷采用HPLC法同时进行测定，但由于人参皂苷R函，Re采用HPLC法测定时对仪器要求较高，流动相乙腈也比较贵，在实际应用时难以普及，我们又对参芍片中的芍药苷单独建立了简便，价廉，快速的HPLC测定方法。对百合固金丸中芍药苷的含量也建立了HPLC测定的方法。．(一)、高效液相色谱法测定人参皂苷R舀，Re和芍药苷的含量。参芍片是由人参茎叶皂苷提取物和白芍组成的纯正名贵中药制剂，是由空军总医院研制，河北天浩制药厂生产的。收载于中华人民共和国卫生部颁标准第八册。具有活血化淤，益气止痛的功效。适用于气虚血淤所致的胸闷、胸痛、心悸、气短等症。^该药的质量标准有对芍药苷的含量测定，用的是薄层扫描法。人参皂苷Rg，，Rc只有鉴别，没有含量测定。为了使参芍片的质量进一步提高，我们2l 用准确度、精密度更高的高效液相色谱法对人参皂苷R蜀，Re和芍药苷进行了含量测定。选用乙腈和0．2％磷酸作流动相，203nm和230nm两个波长测定，人参皂苷RgI，Re和芍药苷这三个化合物分离得很好。芍药昔在230nm下测定结果比203rim测定结果精密度更好。这种方法快速，准确，可以作为参芍片的含量测定方法。1．仪器试剂：美国waters公司HPLC仪，515泵，2487紫外检测器，Millrnnium”色谱管理站，色谱柱：SymmetryCls柱。水为双重蒸馏水，乙胯为色谱纯。所用其他试剂均为分析纯。人参皂苷Rg。，Re和芍药苷均购自中国药品生物制品鉴定所(供含量测定用，批号：0736-9912)。电子天平f十万分之一，梅特勒公司)。2．色谱条件：流动相：乙腈-0．2％磷酸(11：89)，流速：1．1m1．rain"1；柱温：30"C；检测波长：203nm，230nm，进样量均为10Hl。3．实验方法3．1．色谱行为：将人参皂苷Rg。，Rc和芍药苷对照品溶液混合，进样，其保留时间分别为26．074min，27．444min和6．015rain。3个峰分离很好，色谱图见图l(203rim)，图2(203rim)。取参芍片样品溶液进样，样品中人参皂苷R蜀，Re和芍药苷分离很好，并且无杂质峰干扰，色谱图见图3(203nm)，图4(230nm)。将除去人参皂苷提取物和白芍的赋形剂按制剂工艺制成阴性对照品溶液，进样，结果见图5，由图5可见，赋形剂对测定无干扰。 图1(203rim)标准品J、址．A000"O．OO20．叩Minutss图4(230nrla)样品O每掌2母eOMinures图2(230hm)标准品10-"uho图3(203nm)样品图5(230nm)阴性对照品3．2·线性关系的考察a分别精密称取人参皂苷Rg，，Re和芍药苷对照品12，16rag，2．28mg,5．25mg，加甲醇超声溶解，定容于10mt容量瓶；再取上述人参皂苷I迎t的甲醇溶液5rnl置10IIll容量瓶中，加甲醇至刻度。用0．45“m滤膜过滤，分别精密取续滤液0．2，O．4，0．6，0．8，1．Oml，用甲醇定容至10．Oml。}I●、，．i?ik 配成系列浓度的对照品溶液，进样10ul，每个浓度重复测定3次，以峰面积平均值A为纵坐标，浓度C为横坐标，进行回归处理。人参皂苷R蜀，Re和芍药苷的回归方程分别为：Y=5288．12+322912．81X，r=0，9998；Y=8289．91+351180．59X,r=0．9997；Y=93453．6+1296765．14X，r=0．9995，线性范围分别为：O．96-4．80ug，O．91-4．56ug和1．05-5．25pg。3．3提取溶剂的比较：取l、2、3号样品用氯仿超声提取两次，过滤，挥干氯仿，将滤纸和样品一起置于具塞三角瓶中，用正丁醇浸泡过夜，再超卢提取3次，提取液过滤于蒸发皿中，水浴蒸干正丁醇，用甲醇溶解并转移定容至10ml容量瓶中，0．45um滤膜过滤，取续滤液进样，测定。再I双1、2、3号样品用甲醇超声提取四次，过滤，定容于10ml容量瓶中，0．45um滤膜过滤，取续滤液进样，测定。结果表明，两种溶剂提取人参皂替Rg。，芍药苷的含量基本一致，正丁醇提取Re的含量比甲醇提取含量商。因此，选用正丁醇作为提取溶剂。3．4加样回收率试验：取1号样品，加入对照品溶液，按样品测定法测定人参皂苷Rgt，Re和芍药苷的含量，计算回收率，结果见表1·样品加样回收率试验结果(n_3)表1由表1可见，本法回收率较好。 3．5．精密度试验：取标准品溶液分别重复进样测定5次，人参皂苷RgRc和芍药苷的峰面积RsD(％)分别为0．59，0．42，O．90a3．6．稳定性试验：取3号样品溶液，分别进样5次，测定峰面积。人参皂苷R孙I沁和芍药苷的峰面积的RsD(％)分别为3．11，3．40和0．97。4．样品测定：取去掉糖衣的样品lO片精密称定后求出平均片重，研成细粉，精密称取1．30009，用氯仿超声提取两次，过滤，挥干氯仿，将滤纸和样品一起置于具塞三角瓶中，用正丁醇浸泡过夜，再超声提取3次，提取液过滤于蒸发皿中，水浴蒸干正丁醇，用甲醇溶解并转移定容至10ml容量瓶中，O．45um滤膜过滤，续滤液为供试品溶液。分别进样对照品溶液和供试品溶液，按上述色谱条件测定，以外标两点法计算样品中人参皂苷Rg。，Re的含量。再取样品溶液lml，定容于10ml，进样测定230nm的峰面积值，外标两点法计算样品中芍药苷的含量。每个样品各测定3次，结果见表2。参芍片中人参皂苷Rg。，Re和芍药苷的含量表2s．讨论：样品中芍药苷的含量是人参皂苷R191，Re的含量的15倍左右，若同时测定它们的含量，误差较大。因此，我们先用高浓度的样品溶液在203 nm波长处测定人参皂苷Rg。，Re的含量，再将样品溶液稀释lO倍，测定芍药营的含量，在230nm测得的芍药苷比203nm精密度好。因此芍药苷的测定波长选230nm。但由于该法对HPLC仪的要求较高，流动相乙腈比较昂贵，且如果仅测定该制剂中芍药苷的含量，也能较好地控制其质量，故我们又选用了SP8800高效液相色谱仪，以甲醇和水为流动相，以KromasilC．。柱为分析柱，建立了对参芍片中芍药苷含量测定的方法。(--)lip·HPLC测定参芍片中芍药苷含量。我们采用反相高效液相色谱法测定了参芍片中芍药苷的含量，优选了提取、测定条件。1．仪器与试药美国SP高效液相色谱仪，包括SP8800泵，SP．UV2000检测器，SP4600积分仪：USC-302超声波清洗仪(上海波龙设备有限公司)；UV731紫外可见分光光度仪(上海分析仪器厂)；芍药苷对照品(购自中国药品生物制品检定所，供含量测定用，批号：0736—9912)，参芍片(北京空军总医院提供，中国河北天浩制药厂生产，无含量标示)；水为双重蒸馏水，其它试剂均为分析纯。2．色谱条件色谱柱：KromasilC18柱(250mm×4．6mm，10Pm)，柱压：1100PSI，流速：0．8ml／min，流动相：甲醇-水(35：65)，柱温：室温，检测波长：230rim。 进样量均为10u1。3．实验方法3．1选择性实验：精密称取120"C干燥至恒重的芍药苷对照品15．70mg，置250ml容量瓶中，用50％乙醇稀释至刻度，制成浓度为62．8ug／ml的对照品溶液；取样品10片，剥去糖衣，精密称定后研细，然后取片粉约O．29，精密称定，置100ml容量瓶中，加50％7,醇15ml，超声振荡lO分钟，取出。加50％醇稀释至刻度，过滤，弃去初滤液，取续滤液1．0ml置10ml容量瓶中，加50％乙醇并稀释至刻度，作为样品溶液；取人参茎叶皂苷提取物约0．029，精密称定，置25ml容量瓶中，加50％L醇溶解并稀释至刻度，作为缺芍药苷阴性对照品溶液。在上述色谱条件下分别绘制标准对照品溶液、阴性对照品溶液、样品溶液的HPLC图谱，结果见图6。3．2线性与范围：精密吸取芍药苷对照品1．0，1．5，2．0，2．5，3．0m1分别置10ml容量瓶中，加50％乙醇稀释至刻度，摇匀。各取10ul进样，分别主芏样两次，测定芍药苻峰面积，以峰面积平均值对浓度作回归曲线，得回归方程为’0=-47750．44+54899．09X，相关系数r=0．9999，(p