可见分光光度法测定乳状液过氧化值的研究

'http://www.paper.edu.cn1可见分光光度法测定乳状液过氧化值的研究余辉，陈洁江南大学食品科学与安全教育部重点实验室，江南大学食品学院，江苏无锡（214036）摘要：本文采用分光光度法对国内现有的乳状液中氢过氧化物含量的测定方法进行改进。3+论文对方法中的测定条件、精确度及影响因素进行评价和分析。结果显示，Fe浓度在0～3+4mg/L范围内，Fe-硫氰酸盐络合物在510nm处的吸光值与浓度关系符合朗伯－比耳定律，该方法的相对标准偏差RSD=0.60%，加标回收率为98.2%~101.2%，最低检出量为1.701meq/kg。结果表明，采用本方法测定乳状液中油脂的过氧化物值具有试剂用量少、灵敏度和精确度高的优点，适用于乳状体系中氢过氧化物含量的测定。关键词：乳状液，过氧化值，分光光度法1.引言[1，2]在食品与医疗工业中，许多食品和一些药物是以乳状液的形式存在的。这类食品或药物（尤其是含多不饱和脂肪酸）在储藏期间，由于空气、光照、温度、金属离子等因素的[3]影响，很容易氧化酸败，产生一种令人不愉快的哈败味，失去了商品价值。脂肪在氧化过程中产生一系列的化合物，而氢过氧化物是其最初的氧化产物。因此对氢过氧化物含量的测[4]定是了解产品变质程度的一个有效方法。Patrick等通过先提取乳状液中氢过氧化物，再通[5]过碘量法来测定；Mei等先提取乳状液中氢过氧化物，再利用氢过氧化物将Fe(Ⅱ)氧化成Fe(Ⅲ)，采用分光光度法来检测乳状液氢过氧化物含量。在我国，对于乳状液在储藏期间其[6]氧化程度的测定，采用碘量法测定，梅丹等先冷冻干燥除去水分，然后通过碘量法测定氢[7]过氧化物含量。本文所给出测定乳状液中氢过氧化物含量的方法，是在Hamm及Chaiyasit[8]的测定方法基础上加以改进而确定的。该方法利用氢过氧化物在酸性条件下可将Fe(Ⅱ)氧化成Fe(Ⅲ)，Fe(Ⅲ)再与硫氰酸盐反应生成红色的硫氰酸铁络合物，采用分光光度法进行比色定量。该方法简便易行，数据稳定性好，灵敏度和精确高，试剂用量少等优点。2.材料与方法2.1原理首先用异辛烷+异丙醇混合溶剂提取乳状体系中的氢过氧化物，然后利用氢过氧化物在酸性的甲醇+正丁醇混合溶剂条件下把Fe(Ⅱ)氧化成Fe(Ⅲ)，再测Fe(Ⅲ)与硫氰酸盐反应生成红色的硫氰酸铁络合物，最后在波长510nm处，测该络合物的O.D值，通过Fe(Ⅲ)的标准曲线进行比色定量。2.2仪器与试剂分析天平：灵敏度0.1mg；棕色容量瓶：25mL、250mL；移液枪：10~100µL和100~1000µL；具塞试管：10mL；UV-2800H紫外可见分光光度计：尤尼柯（上海）仪器有限公司；HH-2数显恒温水浴锅：国华电器有限公司；WH-2微型涡流混合仪：上海沪西分析仪器厂有限公3+司；JHG-Q54-P60高压均质机：上海张堰轻工机械厂。Fe标准贮备溶液：精确称取4.9769g硫酸亚铁（FeSO4·7H2O）溶于50mL双重蒸馏水中，加入100mL浓硫酸，稍稍加温，溶解后立即滴入20%高锰酸钾溶液，至最后一滴红色不退色为止。用水定容至1000mL，摇匀，1本课题得到国家自然科学基金项目（乳状液中多不饱和脂肪酸氧化机制的研究（20401007））的资助。-1- http://www.paper.edu.cn+33+3+得标准贮备液，此液每毫升含100µgFe；Fe标准工作溶液：取Fe标准贮备溶液10mL于100mL容量瓶中，用甲醇︰正丁醇（2︰1，v/v）混合液定容至刻度，摇匀，得标准工作+3溶液，此液每毫升含10µgFe；氯化亚铁溶液（现用现配）：分别吸取0.6mL的0.144M硫酸亚铁溶液和0.132M氯化钡+0.4M盐酸混合溶液于1.5ml的塑料离心管中，涡流混合30s，在5000rpm离心5min，4℃避光备用；所使用的试剂均为AR级试剂（国药集团化学试剂有限公司），实验用水均为双重蒸馏水（本实验室自制），所使用的试剂均需脱气处理。2.3实验方法2.3.1标准曲线的绘制取8支10mL干燥的具塞刻度试管中，分别加入含0，10，20，40，80，100，200，400µL3+的Fe标准工作溶液于，用微量注射器吸分别吸取20µL硫氰酸钾溶液于试管中，分别加甲醇+正丁醇（2︰1，v/v）混合溶剂定容至5mL，配成含0，0.1，0.2，0.4，0.8，1.0，2.0，3+4.0µgFe标准系列。迅速盖好塞子，涡流混合10s。在15-25℃避光静置20min，以甲醇+正丁醇（2︰1，v/v）混合液作空白对照，于510nm波长下测定吸光值。每个含量重复测定3+3次，以吸光度均值对相应的Fe的含量(µg)绘制标准曲线。2.3.2样品制备准确称取一定量的表面活性剂SDS（1%，w/w）、大豆油（东海粮油赠送）和双重蒸馏水，油水比例为1︰4（w/w）。把表面活性剂、油和水进行充分混合，通过高压均质机进行二次均质。均质条件：均质压力分别为40、20MPa，乳化温度为40℃。2.3.3加标物POV测定分别准确称取一定量的3种不同氧化程度的乳状液（每个氧化程度取3次），随后进行索氏抽提法进行油脂的提取，然后采用GB/T5538-1995法进行油脂POV的测定。平行测定结果符合允许差（0.2meq/kg）要求，以其算术平均值作为结果，计算结果精确至0.01。2.3.4样品测定吸取1mL乳状液，加入到5mL的塑料离心管中，再加入5mL异辛烷+异丙醇（2︰1，v/v）混合溶剂，涡流混合30s。在3000rpm离心2min。吸取2mL上清液（取样量视过氧化物含量的高低而定），加到10mL干燥的具塞刻度试管，用移液枪吸取20µL硫氰酸钾于试管中，再用甲醇+正丁醇（2︰1，v/v）混合溶剂定容至5mL，迅速盖好塞子，涡流混合10s。在15-25℃避光静置20min，以甲醇+正丁醇（2︰1，v/v）混合溶剂作空白对照，于510nm波长下测定其O.D，记为A脂肪空白。吸取2mL上清液（取样量视过氧化物含量的高低而定），加到10mL干燥的具塞刻度试管，分别用移液枪吸取20µL硫氰酸钾和氯化亚铁溶液于试管中，再用甲醇+正丁醇（2︰1，v/v）混合溶剂定容至5mL，迅速盖好塞子，涡流混合10s。在15-25℃避光静置20min，以甲醇+正丁醇（2︰1，v/v）混合溶剂作空白对照，于510nm波长下测定其O.D，记为A样品。吸取2mL双重蒸馏水，加到10mL干燥的具塞刻度试管，用移液枪吸取20µL硫氰酸钾于试管中，再用甲醇+正丁醇（2︰1，v/v）混合溶剂定容至5mL，，迅速盖好塞子，涡流混合10s。在15-25℃避光静置20min，以甲醇+正丁醇（2︰1，v/v）混合溶剂作空白对照，于510nm波长下测定其O.D，记为A试剂空白。-2- http://www.paper.edu.cn2.3.5计算样品中的过氧化值可根据所测得的O.D值，即A=A样品-(A试剂空白+A脂肪空白)，再按公式（1）计算样品的过氧化值。A×K×n×0.5PV（meq/kg）=×1000（1）55.86×m×2式中：PV—样品的过氧化值(POV)，meq/kg;A—测得样品液的吸光度；3+K—测得Fe标准曲线的斜率（本法测得的斜率值为1.5238）；55.86—Fe的原子量；m—称取样品中油脂的质量，g；0.5—O/Fe的摩尔比；n—吸取上清液的体积分数；2—氧换算为POV（meq/kg）的系数。计算结果精确至0.01。3.结果与讨论3.1测试条件3.1.1Fe3+－硫氰酸络合物的最大吸收波长的选择3+取200µL的Fe标准工作溶液，按样品测定方法进行操作。在UV-2800H紫外可见分光光度计进行最大吸收峰波长扫描，扫描结果显示，其最大吸收峰为510nm。3.1.2酸度对氢过氧化物氧化Fe2+的影响取上述制备的乳状液，按样品测定方法进行操作，在其他条件固定时通过改变氯化钡+盐酸混合溶液中盐酸的摩尔浓度，观察显色变化。实验表明，盐酸的摩尔浓度在0.3~0.4M3+时显色体系吸光度最大且稳定，同时考虑到Fe与硫氰酸也要在强酸性条件下才能定量反应完全，故本法选用盐酸的摩尔浓度为0.4M。3.3.3温度对显色的影响取上述制备的乳状液，按样品测定方法进行操作，在其他条件固定，改变静置时的反应温度。实验表明，本反应在15-25℃范围内，测定样品的相对标准偏差RSD<1.0%。温度低于15℃，反应不完全，溶液呈混浊而影响比色。3.1.4显色稳定性实验取上述制备的乳状液，按样品测定方法进行操作，随后每隔5min测定一次吸光度值。实验结果表明，反应时间t=15~20min，测得的吸光度值达到最高并且可稳定60min，相对平2+均偏差RSD<2.0%；若反应时间t<10min，测定结果明显偏低，这是因为过氧化物与Fe反应缓慢所致。故最佳反应显色时间为20min。3.1.5Fe3+－硫氰酸络合物组成测定-3- http://www.paper.edu.cn3+取标准曲线的中点（含0.4µg/mLFe），按标准曲线绘制的方法进行操作。实验结果表3+明，利用摩尔比法及平衡移动法均测得络合物中Fe与硫氰酸之比为1︰1。基于此，本文对样品进行测量时，采用以下的实验条件：入射光波长λ=510nm，氯化钡+盐酸混合溶液中盐酸的摩尔浓度为0.4M，硫氰酸钾和氯化亚铁溶液加入量均为20µL，反应显色时间为20min，反应显色温度控制在15-25℃。3.2本文法所绘制的标准工作曲线3+对不同Fe含量的标准溶液测定，测得工作曲线数据如表1，对这些数据采用最小二乘法回归可得到该工作曲线的直线方程。表1工作曲线数据Table1Thedataofcalibrationcurve编号12345673+Fe/µg0.000.200.400.801.002.004.00A0.0000.1880.3660.6240.7981.3382.6843+3+结果表明，Fe浓度在0～4mg/L范围内，Fe-硫氰酸络合物的O.D值符合朗伯－比耳定律，工作曲线的回归方程为X＝1.5238A-0.1059，相关系数r=0.9972。对试剂空白进行20次测定，测定值为A=0.046±0.0015。根据国际纯粹及应用化学联合会（IUPAC）关于分[9]析方法的检出限规定计算出检出下限为A=0.0505。按0.75g取样量计算成过氧化值，其最低检出量为1.701meq/kg。3.3方法精密度测试含20%大豆油混合液均质后，立即对其同时进行10次过氧化值的测定，结果见表2。10次测定结果的平均值：pov（meq/kg）=9.258±0.055，相对标准偏差：RSD=0.60%。可见本方法具有较高的精密度。表2对同一乳状液的多次平行测定结果Table2Theresultsofmultipledeterminationforthesameemulsioncontainingsoybeanoil编号12345678910乳状液（g）0.9440.950.940.9550.960.9380.9450.970.9630.95A（吸光度）0.2550.2610.2580.260.2590.2590.2550.2630.2580.261POV9.1759.3689.2509.3039.3079.2379.2309.2069.2509.254(meq/kg)3.4加标回收实验使用双重蒸馏水为底本，按样品测定方法进行3种不同氧化程度的乳状液进行加标回收实验，实验结果见表3。结果显示，加标的平均回收率为98.2%~101.2%，符合检测方法的要求。-4- http://www.paper.edu.cn表33种具有不同过氧化值乳状液加标回收实验结果Table3TheresultsofindexedrecoverytestsforthethreedeferencePOVofemulsion※底本值加标值测定值样本回收率(%)平均回收率(%)(meq/kg)(meq/kg)(meq/kg)0.006.9077.045102.010.006.9076.63196.098.70.006.9076.96998.00.0015.60715.06196.520.0015.60715.919102.098.20.0015.60714.98396.00.0026.95728.386105.330.0026.95727.469102.0101.20.0026.95725.87996.3[注]※加标值测定详见实验方法中加标物POV测定3.5注意事项本文样品测定方法是以样品中的氢过氧化物在酸性条件下氧化将Fe(Ⅱ)氧化成Fe(Ⅲ)反应为依据进行测定的。因此所用试剂、实验用水及仪器污染了铁离子对测定结果有干扰；同时Fe(Ⅱ)易于被易被空气中的氧气氧化，操作过程中减少不必要的振荡；建议实验用水最好使用双重蒸馏水，玻璃仪器采用酸洗，并在150℃过夜烘干，所使用的试剂均需脱气处理。4.结论3+本文介绍的测定乳状液中氢过氧化物含量的分光光度法：Fe浓度在0～4mg/L范围内，3+Fe-硫氰酸盐络合物在510nm处的吸光值与浓度关系符合朗伯－比耳定律，该方法的相对标准偏差RSD=0.60%，加标回收率为98.2%~101.2%，最低检出量为1.701meq/kg，且试剂用量少、灵敏度和精确度高的优点。该法适用于乳状体系中氢过氧化物含量的测定。-5- http://www.paper.edu.cn参考文献[1]Mancuso,J.R.,McClements,D.J.&Decker,E.A.Theeffectsofsurfactanttype,pHandchelatorsontheoxidationofsalmonoil-in-wateremulsions.[J].Agric.FoodChem.1999,47:4112-4116.[2]孟玉芳,龚明涛,张钧寿.含药静脉注射用脂肪乳剂的研究进展.[J].中国医药工业杂志,2004,35(9):558~561.[3]Coupland,J.N.&McClements,D.J.Lipidoxidationinfoodemulsions.[J].TrendsFoodSci.Technol.1996,7:83~91.[4]Patrick,J.K.S.&Stefan,F.M.InvitrovxidationofIVlipidemulsionsinDifferentall-in-oneadmixturebagsassessedbyaniodometricAssayandGas-LiquidChromatography.[J].Nutrition1997,13:133~140.[5]Mei,L.Y.,McClements,D.J.&Decher,E.A.Lipidoxidationinemulsionsasaffectedbychargestatusofantioxidantsandemulsiondroplets.[J].Agric.FoodChem.1999,47:2267-2273.[6]梅丹，李大魁，赵彬等.市售中长链脂肪乳注射液的质量评价.[J].中国临床营养杂志,2004,12(4):239~243.[7]Hamm,D.L.,Hammond,E.G.,Parvanah,V.etal.ThedeterminationofperoxidebytheStammmethod.[J].Amer.OilChemists’Soc.,1965,42:920.[8]Chaiyasit,W.,Silvestre,M.P.C.,McClements,D.J.etal.Abilityofsurfactanthydrophobictailgroupsizetoalterlipidoxidationinoil-in-wateremulsion.[J].Agric.FoodChem.2000,48:3077-3080.[9]Irving,H.M.H.N.,Freiser,H.&West,T.S.(Eds),IUPAC,Compendiumofanalyticalnomenclature,definitiverules.[M].PERGAMONPress,Oxfore,1978.DETERMINATIONOFPOVINOIL-IN-WATEREMULSIONSBYVISUAL-SPECTROPHOTOMATER∗YuHui,ChenJieTheKeyLaboratoryofFoodScienceandSafety,MinistryofEducation,SouthernYangtzeUniversity,SchoolofFoodScienceandTechnology,SouthernYangtzeUniversity,Wuxi,Jiangshu,China(214036)AbstractAvisual-spectrophotometrymethodforperoxidevalueofoil-in-wateremulsionswasstudiedinthispaper.Thedeterminationconditions,precision,accuracyandinfluencingfactorsofthemethodwere3+discussedindetailed.Theresultsshowedthat,whentheconcentrationofFewasintherangeof3+0~4mg/L,therelationshipbetweenabsorbanceat510nmandconcentrationofFe-thiocyanatecomplexcompoundaccordswiththeLambert&Bill’slaw.Therelativestandarddeviationwas0.60%.Theratesofrecoverywere98.2%~101.2%.ThelimiteddetectionPOVwas1.701meq/kg.Theresultsindicatethatthismethodcanprovidehighprecisionandaccuracyandlowcostofreagents.Thismethodissuitableforhydroperoxidesanalysisofoil-in-wateremulsions.Keywords:emulsion,peroxidevalue,spectrophotometry作者简介：余辉（1979—），男，硕士，主要从事油脂氧化研究，江南大学食品学院；陈洁（1969-），通讯作者，女，博士，教授，主要从事食品加工及贮藏技术研究。-6-'