罗丹明B-Mn2-H2O2体系同步荧光分光光度法

'罗丹明B-Mn2+-H202体系同步荧光分光光度法测定水果的抗氧化活性摘要在稀硫酸介质中，血2"-比02体系产生的疑自山基迅速氧化罗丹明B使其褪色。在579nm处测定吸光度的变化，可间接测定疑自山基的生成量。水果提収物可以消除溶液中的疑自山基，从而使溶液的吸光度下降程度减弱。据此建立了一种测定水果对羟自由基的清除率的新方法。测定了4种常见水果的抗氧化性,其中苹果和橙了的抗氧化性较强。1前言轻自由基(-0H)是活性氧屮对生物体毒性最强、危害最大的一种自由基。它可以通过电子转移、加成以及脱氢等方式与生物体内的多种分子作用，造成糖类、氨基酸、蛋白质、核酸和脂类等物质的氧化性损伤，使细胞坏死或突变。疑自由基还与衰老、肿瘤、辐射损伤和细胞呑噬有关。对机体适当补充外源性抗氧化剂或给予能促使机体内源性物质恢复到一定水平的约物，可改善这些状况。由于长期使用化学合成的抗氧化剂对入体有一定的副作用，所以，寻找天然、安全、无毒的抗氧化剂就越来越受到入们的重视。对瓮自由基的研究有许多，例如：荧光法研究高粱红色素清除瓮自由基活性，为高粱红色索的合理开发和利用提供了一定的参考依据；罗丹明6G-Co2+-H202体系荧光法测定常见蔬菜的抗氧化活性，测定了14种常见的蔬菜的抗氧化活性，其小菠菜、油菜、韭菜、香菜、雪里蔥5种绿叶蔬菜的抗氧化活性较强；丁基罗丹明B-Fe2-H2O2休系荧光法测定茶叶的抗氧化活性,对多种茶叶及枸杞的清除疑自由基作用进行了研究，充分利用了丰富的茶叶资源提高入体抗氧化性能。目前，离体检测轻门由基的方法主要有电了门旋共振(ESR)法、化学发光法、光度法及荧光法，这些方法多是用传统的Fe2+-HA休系产生轻自由基，或Cif、Co2代替Fe245"61使灵敏度提高，对水果抗氧化活性的研究已有报道。木文采用罗丹明B作指示剂，在Mn2-H2O2体系产生疑自由基(•0H),测定水果的抗氧化活性。从常见水果中寻找抗氧化剂，充分利用丰富的水果资源，具有实际意义。2测定原理传统的Fenton反应是用Fe2*-H202体系产生疑自ft］基。木文研究发现，亦可与H2O2作用，类似Fenton反应产生轻口由基，产率比FcSO-还要高，其反应原理可类推如下：Mn2"+H2O2-Mn(in)+•0H+OH"Mn(III)+H202->Mn(IV)+-OH+OH" 然后，利用瓮自由基迅速氧化罗丹明B,使罗丹明B的荧光强度显著降低，降低程度随瓮自出基的增加而加人，从而间接测定疑自由基的产生量。而水果提取物可以部分清除溶液中的径自由基，从而使其荧光猝灭程度减弱，据此可以测定水果抗氧化性3实验部分3.1主要仪器与试剂3.1.1主要仪器F-4600型分了荧光分光光度计SQ2119多功能食品加工机TD4台式离心机电子分析天平PHSJ-3F实验室pH计3.1.2主要试剂MnS04•H20（含量不少于99%）抗坏血酸（含量不少于99.7%）H202（含量不少于30%）罗丹明B氯化钱（含量不少于99.5%）氨水（含量不少于25%-28%）日木日立公司上海帅佳电子科技有限公司湖南仪器表总厂离心机长梅特勒-托利多仪器上海冇限公司上海精密科学仪器有限公司天津市北方天医化学试剂厂天津市福晨化学试剂厂天津市凯通化学试剂有限公司天津市津科精细化工研究所天津市津东天正精细化学试剂厂天津市赢达希贵化学试剂厂所用试剂均为分析纯，水为蒸饰水。3.2储备液的配制干燥的小烧杯若干，100mL容量瓶3只，1000mL的容量瓶1只，聚乙烯塑料瓶，500mL容量瓶两只，50讥容量瓶5只，10mL容量瓶20只，2mL移液管4只，贴上标签（罗丹明B,Mn2+,IIA,buffcro）,100ml量筒一只,10mL移液管两只（缓冲）3.2.1硫酸锚储备液的配制准确称取MnSOj•H20（M二169）0.3397g,在小烧杯屮用少量水溶解转移100mL容量瓶屮定容，配制成20mmol/L溶液作为储备液。实验所用的浓度是2mmol/L,移取10mL20mmol/L储备液寸TOOinL的容量瓶屮定容至刻度。 3.2.2罗丹明B储备液的配制准确称取罗丹明BO.Olg左右，在小烧杯中溶解，转移定容在1000mL的容量瓶中，配成1X102g/L的储备液。3.2.31%双氧水储备液的配制移取30%H2023mL于聚乙烯的塑料瓶中,再加87mL的蒸馅水（都用量筒）。3.2.4.0.1mol/L氨水储备液的配制准确移取3.33mL浓氨水，稀释至500mL的容量瓶中，定容至刻度，转移在500mL的细口瓶中，配置成0.1mol/LNHs-H20的储备液。3.2.5.0.1mol/L氯化镀储备液的配制准确称取2.675g左右氯化鞍（M=53.49）,在小烧杯屮用少量水溶解，转移定容在500mL的容量瓶中,转移在500n）L的细口瓶中,配置成0.1mol/LNH4Cl的储备液。3.2.6根据化学手册配制成不同pH值NH3-NH4CI缓冲溶液：0.1mol/LNH4C1V/mL32323()25150.1mol/LNHVH2OV/mL14152530pH8.08.589.19.59.8lOmL移液管，配于50niL容量瓶中，注意不要定容!3.2.7抗坏血酸储备液的配制准确称取抗坏血酸0.3523g,在小烧杯中用少量水溶解，转移定容在100mL的容量瓶中,得到20mmol/L的储备液。实验时，移取2.5mL20mmol/L的抗坏血酸，转移定容在100mL的容量瓶屮得到0・5mmol/L的抗坏血•酸。3.3实验方法3.3.1轻自由基的测定在10mL容量瓶中,pH9.8的缓冲溶液1.0mL,加入IX102g/L的罗丹明B1.6mL,2.0nuiiol/L的MiF溶液2.0mL,1%的H©溶液1・0mL,加蒸谓水至刻度，混匀。测定579nni波长处的荧光强度F,计算其与空白参比（罗丹明B与缓冲液）荧光强度F。之差AF,通过测定・0H形成前后罗丹明B的荧光强度变化，来反映•011的产生量。3.3.2轻自由基清除率的测定在上述休系中加入一定量的梵自由基清除剂，同样操作侧定荧光强度Fs;罗丹明B和缓冲 溶液作为空白体系，其荧光强度为F。，未加清除剂的体系，其荧光强度为F,则清除率二（Fs-F）/（Fo-F）X100%3.3.3水果水提取物清除•0H的作用新鲜水果洗净，晾干，准确称取20g,加入200mL蒸憎水，匀浆3min,过滤，离心5min,取上层清液0.6mL按上述方法进行测定。4结果与讨论4.1.荧光光谱罗丹明B木身能产生特征荧光，其激发波长和发射波长分别为553nm和579nm,1、罗丹明B+缓冲溶液2、罗丹明B+缓冲溶液+Mf+IIO+抗坏血酸3、罗丹明B+缓冲溶液+Mf+HQ图1荧光光谱4.2实验参数工作模式：发射扫描扫描间隔：2nm激发狭缝：6nm发射狭缝：6nm负高压:130V4.3实验条件实验条件对轻自由基的产生有影响，也对抗氧化剂对瓮自由基的清除率有影响，应综合 考虑这两方面的因索，选择适宜的测定条件。4.3.1酸度的影响强酸性介质中罗丹明B基本无荧光，弱酸性介质中罗丹明B的荧光很弱，碱性介质中，罗丹明B发强荧光，空白和轻自Ftl基体系的AF受pH值的影响如图2所示。可以看出，在pH二9.8 吋AF有较大值，故选用弱碱性介质pH9.8的缓冲溶液。①②③④⑤缓冲各lmL(pH=)8.08.589」9.59.8罗丹明B(1X1O2g/L)/mLl.61.61.61.61.6Mn2+(2.0mmol/L)/mL22222H2O2(l%)/mL0.80.80.80.80.8■B100-■80-60-/LLG・40-/20-/0-//788：08.28.48.68.89.09.2949：69*8100pH1,2，3，4，5，缓冲各lmL(pH=)8.08.589.19.59.8罗丹明B(8X10-4g/L)/mL1.61.61.61.61.6AF12.2-2.6717&292.7 图24.3.2罗丹明B的用量加入不同体积1X102g/L罗丹明B溶液，按试验方法测定空白体系和•0H体系的AF,如图3所示，结果表明罗丹明B用量为1.6mLo①②③④⑤缓冲(pH=9.8)/mL11111罗丹明B(1X102g/L)/mL11.21.41.61.8Mn2+(2.0mmol/L)/mL22222H2O2(l%)/mL0.80.80.80.80.8F2，3，4，5，缓冲(pH=9.8)/mL11111罗丹明B(8XIO"4g/L)/mL11.21.41.61.8AF72.971.771.1101.585.54.3.3硫酸锚的用量 按实验方法加入不同体积2mmol/L的MnSO,容液，测定荧光强度，如图4所示，选用MnSO,溶液为2.0mLo①②③④⑤缓冲(pH=9.8)/mL11111罗丹明B(1X102g/L)/mL1.61.61.61.61.6Mn2+(2.0mmol/L)/mL0.811.21.62H2O2(l%)/mL0.80.80.80.80.8AF59.155.371.164.881.7缓冲(pH=9・8)/mL1罗丹明B(1X102g/L)/mL1.6 4.3.4过氧化氢的用量用不同体积1%的H心按试验方法测定荧光强度，如图5所示，本实验选用HO溶液1.0mho①②③④⑤缓冲(pH=9.8)/mL11111罗丹明B(8XIO-4g/L)/mL1.61.61.61.61.6Mn2+(2.0mmol/L)/mL2.02.02.02.02.0H2O2(l%)/mL0.60.81.01.21.4AF82.483.7115.687.0114.4缓冲(pH=9.8)/mL1罗丹明B(1X102g/L)/mL1.6 4.5抗氧化剂清除羟自由基作用的测定于体系中加入抗坏血酸，按试验方法测定空白体系的Fo,-OH体系的F,加清除剂体系的Fso荧光强度变化如图1所示，结果表明，随抗坏血酸用量增加，清除率加大。说明本体系中抗坏血酸与•0H的清除作用有明显的量效关系。4.6水果的抗氧化作用测定了4种新鲜水杲的水提取物对・011的清除率，结果见表2。从表中看出橙了、苹杲具有较强的清除・011的功能。清除率二（Fs—F）/（Fo—F)X100%表2各种水果的清除率水果清除率（%）梨31.92橙子3&75獗猴桃31.57苹果39.15结果讨论从这次实验中可以看出水杲盘蔬菜中含有大量天然抗氧化剂、且提取率高、抗氧化活性强,其与机体亲和力强和安全性高等优点具有取代合成抗氧化剂趋势，是今后的研究重点。另外,天然抗氧化剂尚需在有效成分的抗氧化机理、协同作用、构效关系和分子设计等方面开展深入研究，为天然植物开发抗氧化剂的应用奠定理论基础；同吋要加强天然植物原料提取、分离纯化有效成分工艺研究，以尽快实现天然抗氧化剂的产业化。参考文献：[1]方敏，王燿峰，宫智勇・15种水果和33种蔬菜的抗氧化活性研究.食品科学.2008年，第29卷，第10期[2]芦双，董静洲，孙紫薇.常见多汁类水果、蔬菜的总抗氧化活性的研究•湖北民族学院学报（自然科学版）,2011.12.第29卷.第4期⑶黄莉娟，胡蝶，张萍，聂迎春•柑橘的抗氧化活性研究•现代食詁科技.2012.第28卷.第4期 [4]郑炜•果蔬抗氧化作用机理及评价方法研究进展.浙江林业科技.2004.3•第24卷第2期[5]张名位，郭宝江•果蔬抗氧化作用研究进展•华南师范大学学报（口然科学版）.2011年第4期[6]王琦，余亚白，赖呈纯，陈源，高慧颖，谢鸿根•儿种台湾水果的抗氧化能力研究•福建农业学报.2010.第25卷第6期[7]许红星，曹晖，刘方方•两种方法评价常见水果的抗氧化活性•扬州大学烹饪学报.2012第4期[8]秦延河•罗丹明B-ln24--H202体系光度法测定水果的抗氧化性•江西师范大学学报（自然科学版）2005年11月第29卷第6期[9]邹磊，甄少波，宋杨•食品抗氧化能力检测方法的研究进展•食品工业科技.2011.第6期第32卷[10]臧运波，张爱梅•荧光素钠伽体系荧光法测定常见水果的抗氧化活性•分析科学学报.2005.2.第21卷第1期'