实验一 分光光度法(针推).ppt

'生物化学实验 四、实验室规则1.穿工作服。2.严格按操作规程使用仪器设备。3.实验完毕后，洗净所用器材。4.每次一个实验小组(轮流)做清洁卫生。 五、实验报告的书写实验名称1.目的要求日期2.实验原理3.主要方法及仪器4.基本操作过程5.现象与绘图6.计算或结果7.意义8.注意事项9.讨论与小结10.思考题 实验一分光光度法 一、实验目的：掌握分光光度法的概念、基本原理和应用；并通过实验理解分光光度计的操作方法和步骤以及了解分光光度计的主要组成部件与工作原理。 单色光与复色光单色光:仅具有某一波长的光，由具有相同能量的光子所组成。复色光:与上相反，各种人眼可见的色光都属复色光。 γ射线x射线真空紫外近紫外可见近红外红外远红外无线电波380－760nm10μm－－200－380nm 二、分光光度法的概念分光光度法是基于被测物质的分子对光具有选择性吸收的特性而建立起来的分析方法（也称为吸光光度法）。 在分光光度计中，将不同波长的光连续照射到一定浓度的样品溶液时，便可得出与不同的波长相对应的吸收强度。如以波长（λ）为横坐标，吸收强度（A）为纵坐标，就可绘出该物质的吸收光谱曲线。利用该曲线可以进行物质定性、定量分析。 特点—灵敏度高：测定下限可达10－5～10－6mol/L,10-4%～10-5%准确度能够满足微量组分的测定要求：相对误差2～5％（1～2％）操作简便快速应用广泛 三、分光光度法基本原理 1.物质对光的选择性吸收吸收(absorption):一种物质呈现何种颜色，是与入射光的组成和物质本身的结构有关。溶液呈现不同的颜色是由溶液中的质点（离子或分子）对不同波长的光具有选择性吸收而引起的。 当依次将各种波长的单色光通过某一有色溶液,测量每一波长下有色溶液对该波长光的吸收程度(吸光度A)，然后以波长为横坐标，吸光度为纵坐标作图，得到一条曲线，称为该溶液的吸收光谱。吸收光谱 可见、紫外吸收光谱示意图 物质对不同的色光能有选择性的吸收,即一定的物质主要吸收一定波长的光(互补吸收)，是因为物质本身的分子、原子都处在一定能级的运动状态，当物质吸收了光的辐射能以后，会产生能级的跃迁，产生吸收光谱。吸收光谱的产生 2.光吸收基本定律根据吸收光谱的特性和形状可作该物质的鉴别、纯度检查和初步的结构分析等。但是可见／紫外吸收光谱主要应用在定量分析方面，其定量基础即为Lamber-Beer定律，是说明吸光物质对单色光吸收的强弱与该物质的浓度与厚度间关系的定律。 透光度T(%)与吸光度A 透光度T(%)当一束平行的单色光通过一浓度为C，液层厚度为L的溶液时，该溶液将对此入射光进行吸收，使透过的光强减弱。透光度则为入射前后光强的比值。CL入射光强透射光强I0ItT(%)＝ItI0 透光度与吸光度相互关系溶液的透光度与吸光度呈负相关。A＝lg—I0It＝lg—＝－lgT1T吸光度A吸光度A是透光度的负对数 1.Lamber定律—吸光度与液层厚度的关系1760年，Lamber指出，当单色光通过浓度一定的、均匀的吸收溶液时，该溶液对光的吸收程度与液层厚度L成正比。A＝lg—I0It＝K1LLamber-Beer定律 吸光度与光程（厚度：L）的关系A=KLc检测器L样品光源0.22吸光度光源检测器0.00吸光度光源检测器0.44吸光度L样品L样品 2.Beer定律—吸光度与溶液中吸光物质浓度的关系的关系1852年，Beer指出，当单色光通过液层厚度一定的、均匀的吸收溶液时，该溶液对光的吸收程度与溶液中吸光物质的浓度C成正比。A＝lg—I0It＝K2C 吸光度与浓度的关系A=KLc吸光度0.00光源检测器吸光度0.22光源检测器c1吸光度0.44光源检测器c2 3.Lamber-Beer定律将前面两条定律结合起来，就得到如下结果：A＝KCLK:吸光系数，为单位浓度、单位厚度时的吸光度。C:吸光物质浓度。单位mol/LL:光通过的液层厚度。单位cm A=klcA—吸光度(absorbance)L—介质厚度(length/cm)c—浓度(concentration)K—吸光系数(absorptivity)A＝lg—I0ItItI0lc 四、分光光度计的基本结构 分光光度计的基本结构光源单色器吸收池检测系统稳压电源 722型分光光度计结构方框图光源吸收池检测系统分光系统显示系统 在分光光度计上外来光源（混合光）通过棱镜或光栅得到一束近似的单色光.即将混合光中某一波长的单色光分出，故称为“分光”。优点：波长可调,故选择性好,准确度高. 光源必须具有稳定的足够强度的连续光谱。可见光分光光度计的光源通常为白灼钨灯，其光谱范围为320nm---2500nm。紫外分光光度计的光源是低压氢弧灯，其光谱范围为150nm---400nm。1.光源 单色器是将复杂的白光分散成单色光的装置，其过程为光的色散。色散后的单色光经反射、聚光，通过狭缝到达溶液。常用的单色器是棱镜或光栅。2.单色器 也叫比色皿,比色杯，用来盛被测试的溶液。可见光区使用玻璃制的比色皿，紫外光区使用石英制的比色皿。因为玻璃会吸收紫外线。吸收池的种类很多，其光径可在0.1~10cm之间，其中以1cm光径吸收池最为常用。3.吸收池 即光电转换元件，为光电管或光电倍增管，可将透过比色皿的光信号变成可测量的电信号。检测器 5.显示仪表或记录仪可直接读到结果，如检流计，微安表。 五、定量分析方法㈠标准曲线法0浓度C吸光度A 几点注意：理想的标准曲线应为：用不同浓度标准溶液所测得的吸光度对浓度作图时，是一条斜率接近于1通过原点的直线；标准溶液浓度范围应在被测物质浓度的一半到二倍之间；吸光度在0.05---1.0之间为宜。 ㈡对比法将标准与样品分别在相同条件下显色，测定其吸光度。因是相同物质在相同条件下测定，故可按下式计算出样品的浓度：A标A样KC样LKC标L=则：C样=A标A样C标 六．显色反应条件的选择对多种物质进行测定，常利用显色反应将被测组分转变为在一定波长范围有吸收的物质。 这些显色反应，必须满足以下条件：1．反应的生成物必须在紫外-可见光区有较强的吸光能力，即摩尔吸光系数较大；2．反应有较高的选择性，即被测组分生成的化合物吸收曲线应与共存物质的吸收光谱有明显的差别； 3．反应生成的产物有足够的稳定性，以保证测量过程中溶液的吸光度不变；4．反应生成物的组成恒定。 七、实验步骤：1、开机2、预热3、选择检测波长4、调节仪器零点5、调节吸光度零点6、读取测定管和标准管吸光度7、计算实验数据(单位浓度)8、讨论与小结 本内容结束，谢谢！'