分光光度法-血糖.ppt

'p31实验四分光光度技术与葡萄糖氧化酶法测定血糖 一、分光光度法分光光度法是根据不同物质对于不同波长的光波具有选择性吸收的光学特性，建立起来的分析方法。（一）分光光度法的依据 I0It溶液当一定波长的光线通过某种透明介质时，其中一部分光可透过，一部分光被吸收，这种某种溶液对一定波长的光的吸收特性可用于该物质的定性和定量分析。 分光光度计可获得单色光分光光度计利用棱镜或光栅取得波长范围为几个nm甚至更窄的单色光。 测定的时候需选择不同物质最大吸收峰所对应的波长波长（nm）光吸收值最大吸收峰 分光光度计的优点分光光度法的灵敏度、准确度及选择性都很高，是一种最常用的灵敏、精确、快速和简便的分析方法。 不同分光光度计的波长范围紫外光(200-400nm)可见光(400-760nm)红外光(760nm-30μm) （二）分光光度法原理Lambert-beer定律，该定律阐明了溶液对单色光吸收的多少与溶液浓度及液层厚度的乘积成正比关系。I0Itlg=KCL I0Itlg：光密度（O.D.），或称吸光度（A）I0：入射光强度It：透过光强度K：吸光系数，它与该物质吸收光能力有关I0Itlg=KCLC：溶液浓度(mol/L)L：液层厚度(cm) （三）分光光度法计算待测溶液浓度的方法1、利用标准溶液测定溶液的浓度A标=KC标LA样=KC样LA标A样C标C样＝ 2、利用标准曲线求得待测溶液的浓度标准曲线的制作：先配制一系列已知不同浓度的测定物标准溶液，按测定管显色，分别读取各管光密度，以各管光密度为纵坐标，各管浓度为横坐标，作图得标准曲线。 浓度吸光度以测定管的光密度从标准曲线上可求得测定物浓度 （四）分光光度计的基本结构1、光源2、单色光器3、吸收杯（比色杯）4、检流计（测光系统） 752型分光光度计1）A/T/C/F切换键2）SD键——具2个功能。传输数据；确认当前的F值。3）▽/0%——调T为000.0。4)△/100%——调T为100.0。转换至A时，按键后显示0.000。 （五）操作规程1.插上电源，打开电源开关预热30min。2.将波长旋钮旋至所需波长。3.将样品倒入比色皿放入比色皿架，空白管进入光路，按A/T/C/F键至光标于T位，开盖按▽/0%键使读数显示000.0。关盖，再按△/100%键使读数显示100.0。按A/T/C/F键至光标于A位，再按△/100%显示0.000。拉出样品管进入光路读A。4.测定结束打开样品室盖。5.取出比色皿清洗干净后用蒸馏水冲洗并倒扣在粗滤纸上晾干。 实验目的了解葡萄糖氧化酶法测定血糖的基本原理。掌握酶法测定血糖的实验方法熟悉分光光度计的使用。P57二、葡萄糖氧化酶法测定血糖 实验原理：葡萄糖＋O2+H2OGOD葡萄糖酸内酯＋Ｈ2O22Ｈ2O2+4-氨基安替比林+酚POD红色醌类化合物+Ｈ2O+O2用分光光度法将待测溶液与同样处理的葡萄糖标准液比色，求待测血糖浓度。 仪器和药品：血清、血糖试剂盒752可见紫外分光光度计。 基本操作取三支试管，编号，下表加样计算血糖浓度编号试剂ml空白管标准管测定管血清－－0.02葡萄糖标准液(100mg/dl)－0.02－酚试剂1.51.51.5酶试剂1,51.51.5混匀后37度保温15分钟,在505nm波长处比色，显色后2小时稳定。 吸量管的使用拿吸量管正确姿势取液姿势卸放姿势 微量取样器的操作调至所需体积值；吸：垂直持取样器用大拇指按至第一档；将吸头插入溶液松开大拇指，液面上升；放：移出液面，按至第一档继续按至第二档以排空液体。注意：移取另一样品时，更换新吸头。 计算公式测定管吸光度值标准管吸光度值葡萄糖含量(mg/dL)=×100参考数据：A测=0.217，A标=0.258，葡萄糖含量=84mg/dl 思考题试分析影响本试验的因素有哪些？操作分光光度计时要注意哪些关键点？'