紫外分光光度法测定胆南星中总胆酸的含量

'紫外分光光度法测定胆南星中总胆酸的含量万军，翟羽佳，闫翠起，贾程程西南交通大学生命科学与工程学院，四川成都610031[摘要]目的：建立中药胆南星中总胆酸含量测定的方法。方法：以鹅去氧胆酸为对照品，直接采用加入50％硫酸溶液，75℃水浴加热反应显色，于紫外分光光度计377±2nm波长处测定。结果：鹅去氧胆酸在0.0000～0.4312mg/mL，呈良好线性关系（r=0.9991），平均回收率为98.79％（n=5），RSD为3.02％。结论：本方法准确，简便，重复性好，可用于中药胆南星中总胆酸含量测定。[关键词]胆南星；鹅去氧胆酸；总胆酸；含量测定；紫外分光光度法DeterminationonthecontentsoftotalbileacidinBileArisaemabyUVWANJun，ZHAIYu-jia，YANCui-qi，JIACheng-chengLifeScience&EngineeringCollegeofSouth-westJiao-tongUniversity，Chengdu，Sichuan610031[ABSTRACT]OBJECTIVE：ToestablishthemethodsofdeterminationonthecontentsoftotalbileacidinBileArisaemabyultravioletspectrophometry.METHOD：Toadd50%sulfuricacidtothesampleandreactinwaterbathat75℃.Thecontentsoftotalbileacidweredeterminedbyultravioletspectrophometryon377±2nm,usingchenodeoxycholicacid(CDCA)asthechemicalreferencesubstance.RESULT：Thelinearresponserangefrom0.0000～0.4312g/mL，r=0.9991.Therecoveryratewas98.79%（n=5），RSDwas3.02%.CONCLUSION：Themethodisaccurate,simpleandreproduciblewhichcouldbeusedforthedeterminationoftotalbileacidinBileArisaema.[KEYWORDS]BileArisaema;CDCA;Totalbileacid;Determination;Ultravioletspectrophometry胆南星系由天南星科植物天南星Arisaemaerubescens（wall.）Schott.、异叶天南星A.heterophyllumBl.或东北天南星A.amurenseMaxim.的干燥块根细粉与牛、羊或猪胆汁炮制加工而成，胆汁制南星，既可减低生南星毒副作用，又使其药性由温转凉，变温化寒痰药为清化热痰、息风定惊之品，用于治疗痰热咳嗽、咯痰黄稠、中风痰迷，癫狂惊痫等症。《中国药典》2005版一部主要针对原药材进行显微和理化鉴别[1]，而未对成品中的胆汁质量进行控制。笔者采用鹅去氧胆酸作为胆南星中总胆酸含量的评价指标，建立专属性较强的含量测定方法，拟有效控制胆南星的内在质量，使标准更加完善。1仪器与试药【收稿日期】2010-1-13（009）【第一作者】万军，男，西南交通大学生命科学与工程学院讲师，博士学位，主要从事中药新药研究与教学工作；E-mail：wwangyidi@126.comTU-1901双光束紫外可见分光光度计（北京普析通用仪器有限责任公司）；SartoriusBS224S（德国赛多利斯公司）精密电子天平；4 SK8200LH超声仪（上海科导超声仪器有限公司）；DK-98-1型电热恒温水浴锅（天津市泰斯特仪器有限公司）。胆南星，由成都中药饮片有限公司提供，批号090802，091001，091002，091101、091102、091103；鹅去氧胆酸对照品购自中国药品生物制品检定所，供含量测定用，批号110806-200704；其余试剂均为分析纯。2方法与结果2.1对照品溶液的制备精密称取鹅去氧胆酸对照品10.0mg，置10mL容量瓶中，加冰醋酸制成每1mL含1mg鹅去氧胆酸溶液，即得对照品溶液。2.2供试品溶液的制备[2～3]取胆南星样品粉末1.0g，精密称定，置锥形瓶中，加乙酸乙酯80mL，水浴回流2.5h，于提取结束时加入0.6g活性炭，继续回流0.5h，滤过，滤液水浴蒸干，用60%的冰醋酸溶解，并转移至25mL容量瓶中，定容，摇匀（依情况进行过滤），精密吸取此溶液1.0mL，置20mL带刻度试管中，加入50%硫酸溶液14mL，混匀，置75℃水浴中保温10min，迅速移至冰浴中放置2min，即得。2.3检测波长的确定按供试品溶液的制备方法，以60%冰醋酸溶液作为空白。将对照品溶液、供试品溶液在200～400nm波长范围内进行光谱扫描。结果供试液和对照溶液在377n·m处有最大吸收，故选择377nm波长作为测定波长。见图l。AB图1UV光谱图A.对照品B.样品2.4标准曲线的制备分别精密吸取0.0，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0，3.5mL的鹅去氧胆酸对照品溶液（C＝0.1232mg/mL）置20mL带刻度的试管中，以60%冰醋酸溶液作为空白，依法测定吸光度，以吸光度A为纵坐标，对照品浓度C为横坐标，绘制标准曲线，回归方程：A=1.263C+6.9×10-3，r=0.9991。结果表明鹅去氧胆酸在0.0000～0.4312mg/mL的范围内线性关系良好。2.5精密度、重复性、稳定性精密称取胆南星样品粉末，按供试品溶液制备方法制备，以60%冰醋酸溶液作为空白对照液，在377nm处测定其吸收度，重复测定5次，RSD=0.14％，表明仪器精密度良好。精密称取胆南星样品粉末，5份，测定，平均值为78.49mg/g，RSD=0.67％，结果表明该方法重复性良好。4 取同一份样品，依法操作，在0.0，0.5，1.0，1.5，3.5，6.0h时间在377nm处测定吸收度，RSD=2.89％，表明供试品溶液在6h内测定基本稳定。2.6加样回收率试验取胆南星样品粉末，5份，精密称定，分别加入鹅取氧胆酸对照品适量，依法操作，在377nm处测定其吸收度，结果平均值为98.79％，RSD=3.02％。2.7样品测定按照以上方法测定6批胆南星样品（090802、091001、091002、091101、091102、091103），结果总胆酸含量以鹅去氧胆酸计分别为78.5，104.6，91.7，85.2，88.3，90.0mg/g，平均值为89.7mg/g（n=6）。3讨论3.1指标成分的选择目前，对胆南星中的胆酸质量控制研究较少，主要集中在薄层色谱鉴别及胆汁化学成分的分析[4～6]，尚未见胆南星中总胆酸含量的仪器分析报道。根据张能荣研究的牛、羊、猪胆汁的15种成分的结果，只有鹅去氧胆酸是3种胆汁共有成分[7]，因此，采用鹅去氧胆酸作为指标成分，对胆南星中总胆酸的含量进行测定。3.2供试品溶液的制备3.2.1提取溶剂考察[8]以60%冰醋酸溶液为空白，用UV法在200～400nm波长间扫描各样品的最大吸收波长，并在（377±2）nm处进行含量测定，结果氯仿+乙醇（2：1，V/V）作为提取溶剂，胆酸的浓度最高（0.548mg/mL），但UV扫描得到其最大吸收波长为292nm，与对照品的最大吸收波长（377±2）nm不符，乙酸乙酯与对照品的最大吸收波长亦不符，故不予采用；氯仿作为提取溶剂，提取液进行UV扫描得到其最大吸收波长为377nm，但由于其稳定性差（样品放置20min，其最大吸收波长变为292nm），同时考虑氯仿毒性较大，不建议采用。因此，选用乙酸乙酯+活性炭为提取溶剂。3.2.2提取时间考察分别采用乙酸乙酯回流提取1.5，2，2.5，3.5h，依法操作，并在(377±2)nm处进行吸光度的测定，结果回流时间4h，胆酸成分的浓度最大（0.3300mg/mL），但进行UV光谱扫描得到其最大吸收波长为292nm，与对照品的最大吸收波长(377±2)nm不符，而提取3h，其最大吸收波长仍在376nm处；因此，提取时间定为3h。3.2.3提取方法考察参考文献[3，5，8]，胆酸成分的提取多采用水浴回流法，故实验选用回流法，不再进行提取方法的考察。3.3活性炭用量考察实验发现活性炭的加入对胆南星提取液中的干扰成分有较好的吸收，而对胆酸类成分吸收较小，且活性炭用量对最大吸收波长有一定影响。参考活性炭常用量，选用0.35g及0.6g作为考察水平。结果表明：加入0.35g活性炭，其最大吸收为(291±2)nm波长处；而加入0.60g活性炭得到的供试品溶液，进行UV光谱扫描，其最大吸收为(377±2)nm波长处，与对照品光谱扫描结果一致，且稳定性及重复性好，故活性炭用量为0.60g。3.4高效液相色谱法（HPLC）测定鹅去氧胆酸含量实验曾探索采用HPLC测定样品中鹅去氧胆酸含量[9～10]。色谱条件：岛津LC-20AT高效液相色谱仪，色谱条件：KP100-5C184 色谱柱（4.6mm×150mm，5μm），柱温：35℃；流动相甲醇-水（70：30）；流速0.8mL/min；检测波长：203nm。精密吸取的鹅去氧胆酸对照品溶液10μL进样，结果在60min仍没有色谱峰出现，后又将流动相调整为甲醇-水（82：18），依然没有峰值检出。后考虑到胆汁酸类成分无紫外吸收基团，故采用柱前衍生法对具有紫外吸收基团的衍生产物进行色谱检测[11]，以对溴乙酰基硝基苯为衍生化试剂，18-冠醚-6为相催化剂。但经多方联系，均未购买到18-冠醚-6，故其实验研究待下一步展开。【参考文献】[1]中华人民共和国药典委员会.中国药典[S].北京：化学工业出版社，2005：110.[2]赵中杰，江佩芬，罗金明，等.紫外分光光度法测定牛黄中胆酸的研究[J].天然产物研究与开发，1992，4（1）：24.[3]李先端，钟银燕，游修琪，等.中药炮制辅料牛胆汁中总胆酸含量测定[J].中药材，2008，31（5）：654.[4]贲永光，李康，李坤平，等.胆南星的薄层色谱鉴别[J].广东药学院学报，2009，25（2）：160.[5]张绍轩，黄青，王学农，等.胆南星的薄层色谱鉴别[J].长春中医药大学学报，2008，24（4）：147.[6]张厚宝，康纯.胆南星中胆汁成分的检测[J].中药材，1991，14（3）：37.[7]张能荣.牛羊胆汁质量的研究[J].中草药，1983，14(7)：15.[8]何念民.紫外分光光度法测定消溶胆石片中胆酸含量[J].中成药，1995，17（1）：18.[9]郑兴.熊去氧胆酸与鹅去氧胆酸的对比研究[J].内蒙古科技与经济，2008，2（156）：28.[10]唐玉红.HPLC法测定熊去氧胆酸的含量[J].现代仪器，2007，1：62.[11]郑兴，金东日.柱前衍生反相高效液相色谱法测定鹅去氧胆酸的含量[J].延边大学学报（自然科学版），2008，34(4)：269.4'