1252紫外分光光度法快速测定小麦胚芽脂肪氧化酶活力论文

'　　1252紫外分光光度法快速测定小麦胚芽脂肪氧化酶活力论文徐斌董英胡庆松余雅斌刘筠钧【关键词】紫外分光光度法小麦胚芽脂肪氧化酶活力1引言小麦胚芽(L0.1mol/L醋酸盐缓冲液(pH4.5)，4℃下搅拌30min，悬浮液12000r/min离心30min，获得酶提取液。用醋酸盐缓冲液稀释10倍，作为酶测定液。2.3底物的配制取111μL亚油酸，无水乙醇定容到10mL，取3.55mL，加入40μLTL0.05mol/LNa2HPO4溶液中，1mol/LNaOH调pH至9.0。底物中亚油酸浓度为2.53mmol/L。2.4酶活的测定检测波长234nm，温度25℃;反应液：2.0mL缓冲溶液，200μL底物溶液，50μL粗酶液;参比液：2.0mL缓冲溶液，200μL底物溶液，50μL钝化处理的粗酶液。【关键词】紫外分光光度法小麦胚芽脂肪氧化酶活力1引言小麦胚芽(L0.1mol/L醋酸盐缓冲液(pH4.5)，4℃下搅拌30min，悬浮液12000r/min离心30min，获得酶提取液。用醋酸盐缓冲液稀释10倍，作为酶测定液。 2.3底物的配制取111μL亚油酸，无水乙醇定容到10mL，取3.55mL，加入40μLTL0.05mol/LNa2HPO4溶液中，1mol/LNaOH调pH至9.0。底物中亚油酸浓度为2.53mmol/L。2.4酶活的测定检测波长234nm，温度25℃;反应液：2.0mL缓冲溶液，200μL底物溶液，50μL粗酶液;参比液：2.0mL缓冲溶液，200μL底物溶液，50μL钝化处理的粗酶液。3结果与讨论3.1底物在不同pH条件下的稳定性底物溶液分别用pH4.5～9.0的缓冲溶液稀释10倍，随着时间的延长，由于亚油酸在酸性条件下溶解度下降，产生浑浊，由于光散射导致吸光度增大。pH值越低，吸光度变化速度越快;pH4.5时达0.19%。而pH8.0和9.0的底物溶液比较稳定，吸光度在2h内基本保持不变。选择pH7.0缓冲液稀释底物，每隔15min测定粗酶液酶活一次。由于亚油酸溶解度的下降，参与催化反应的底物量减少，导致同样的酶液LOX酶活力2h后测定值仅为初始值的69%。为此，本实验采用亚油酸Tin，再加入待测酶液，能有效消除在中性和酸性缓冲体系下，亚油酸溶解度下降产生的误差。3.2底物浓度的优化将不同浓度(0.31～15mmol/L)的底物溶液，用pH 7.0缓冲溶液稀释10倍，进行全波长扫描。随着底物亚油酸浓度的增加，234nm处吸光度逐渐上升;当底物浓度大于5.0mmol/L时，溶液的吸光度为0.77，如再加入酶液，反应体系的吸光度很快上升到2.0，将产生较大误差。底物浓度小于2.5mmol/L，溶液的初始吸光度则低于0.23。酶活测定时，反应体系吸光度3min内上升到1.23，符合分光光度分析吸光度在0.1～1.0时线性关系最佳的要求。当底物浓度小于6.25×10-4mol/L，由于亚油酸浓度过低，线性关系差。亚油酸的适合浓度范围为1.25～2.50mmol/L。3.3Tmol/L)，测定酶活。结果表明，Tg/L。在粗酶液添加量5～70μL范围内对LOX酶活进行分析，得到线性方程ΔA234/min=0.0053V-0.0075(ΔA234/min为每分钟吸光度的变化;V为加酶量，μL)，r=0.9984。添加20μL粗酶液，添加回收率为88.3%，RSD=6.9%(n=8)。'