分析化学系列课件 紫外-可见分光光度法学习课件(ppt课件)

'紫外-可见分光光度法UltravioletandVisibleSpectrophotometry;UV-vis《分析化学》系列课件贵阳医学院药学院分析化学教研室 第11章紫外-可见分光光度法紫外-可见分光光度法简介§11.1紫外-可见吸收光谱的基本概念§11.2紫外-可见分光光度法的基本原理§11.3紫外-可见分光光度计§11.4定量分析方法§11.5定性及结构分析（7学时) 紫外/m10110-210-410-610-810-1010-1210-14/s-13×1083×10103×10123×10143×10163×10183×10203×1022无线电波微波红外可见X射线γ射线引言紫外-可见光区的波长范围200~760nm400~760nm200~400nm UV-vis的特点和应用特点：电子光谱，强度大灵敏度高，10-7~10-4g/mL准确度0.2~0.5%应用：定性分析：定性鉴别、纯度检测定量分析：单组分、多组分(计算分光光度法)结构分析：共轭体系信息 11.1紫外-可见吸收光谱的基本概念11.1.1跃迁类型11.1.2紫外-可见吸收光谱中的常用术语11.1.3吸收带及其与分子结构的关系11.1.4影响吸收带的因素 11.1.1跃迁类型能在紫外光区产生吸收的有机化合物：不饱和且具有共轭系统跃迁类型波长范围及特点基团能量→*含杂原子的不饱和基团远紫外区(max<150nm)含杂原子饱和基团饱和烃C-C单键近紫外区跃迁几率大，max>104，强吸收跃迁几率小，max<102，弱吸收C=C（共轭）远近紫外交界处n→*n→*→*Eexample回主目录 分子中价电子能级及跃迁示意图成键反键E*成键反键*非键n→*→*n→*n→* 轨道和轨道示意图+++++–++–+–+–CCCC+––++–CCCC+–+–** 共轭双键的离域作用→跃迁几率↑→↑；E↓→↑E>E１２**３４C=C共轭C=C最低占有轨道最高空轨道回主目录 电荷迁移跃迁电荷迁移跃迁示意图电子给予体电子接受体hνhν[Fe3+SCN-]2+[Fe2+SCN]2+Cl-(H2O)nCl(H2O)n-hνhν电子接受体电子给予体电子接受体电子给予体 配位场跃迁4、5周期过渡金属元素镧系、锕系元素d轨道和f轨道→分裂→d-d跃迁和f-f跃迁必须在配体的配位场作用下才能产生 几种常见的紫外-可见吸收光谱位置lgε5432110100200300400500600700800λ/nmλ/nm10100200300400500600700800远紫外区近紫外区可见区→*n→*→*n→*电荷转移配位场回主目录共轭 课堂练习①CH2=CH–CH2–CH2–OCH3；②上述两个分子能产生哪些类型的电子跃迁？①→*跃迁、→*跃迁、n→*跃迁②→*跃迁、→*跃迁、n→*跃迁有哪些生色团和助色团？①生色团：C=C；助色团：–OCH3②生色团：苯环、C=O 11.1.2紫外-可见吸收光谱中的常用术语吸收光谱的特征生色团和助色团红移与蓝(紫)移增色效应和减色效应强带和弱带强带(strongband)max>104弱带(weakband)max<102回主目录 吸收光谱(absorptionspectrum)的特征Aλ吸收峰↓吸收峰↓谷↓谷↓肩峰(shoulderpeak)末端吸收(endabsorption)maxmaxminminsh回主目录 吸收光谱的特征吸收峰的数目取决于分子结构中不饱和基团的种类吸收峰的位置(λmax)取决于电子能级差吸收峰的强弱(εmax)取决于电子跃迁几率回主目录 回主目录生色团和助色团生色团(chromophore)：→*、n→*助色团(auxochrome)：n→*红移(redshift)长移(bathochromicshift)增色效应或浓色效应(hyperchromiceffect)example 11.1.3吸收带及其与分子结构的关系吸收带特点λ(nm)吸收强度(max)跃迁类型吸收基团R带K带B带E带E1E2波长较长弱吸收强吸收中强吸收芳香族化合物特征吸收~300~210~250~230~270重心~256max<100（弱带）max>104（强带）~200强吸收~180~47000中强吸收~200~7000共轭→*n→*芳环共轭→*杂原子不饱和基团共轭双键芳环回主目录芳环的离域大Π键芳环C=C骨架振动及环内→*example B带和E带苯的B带吸收光谱苯蒸气苯的乙醇溶液苯异丙烷溶液的紫外吸收光谱B带E1带E2带 苯乙酮的紫外吸收光谱吸收带max(nm)max(L·mol-1·cm-1)B带R带278319K带24013000110050B带R带苯乙酮的吸收带lgE2带?K带共轭生色团回主目录 11.1.4影响吸收带的因素位阻影响跨环效应溶剂效应pH影响共轭系统共平面性↓→共轭效应↓→max↓（短移），↓溶剂极性↑→K带长移，R带短移max210.5nm,270nm235nm,287nm 二苯乙烯顺反异构体的紫外吸收光谱顺式反式位阻影响 溶剂效应溶剂极性↑(n→*)K带长移R带短移(→*)→*非极性溶剂极性溶剂*E非>n→*极性溶剂对两种跃迁能级差的影响E极非极性溶剂*n极性溶剂E非<E极 §11.2基本原理11.2.1Lambert-Beer定律11.2.1-1Lambert-Beer定律数学表达式11.2.1-2系光吸数11.2.2偏离Beer定律的因素 11.2.1Lambert-Beer定律截面积S厚度l断层dl，含dn个吸光质点含n个吸光质点的吸光介质IxI0IdS=kdn入射光强透射光强 Lambert-Beer定律公式推导dS/S=(kdn)/S∵n=V·C，S=V/l∴n/S=l·C Lambert-Beer定律的数学表达式-lg(I/I0)=ECl透光率(transmitance)：T=I/I0吸光度(absorbance)：A=-lgTA=ECl（A与C成正比关系）T=10-ElC（T与C成指数函数关系）Lambert-Beer定律：当一束平行单色光垂直通过均匀的非散射吸光物质溶液时，其对光的吸光度与溶液的浓度及厚度成正比，A=ECl。 定性和定量的参数吸光系数(absorptivity)摩尔吸光系数(/EM)百分吸光系数()C=1mol/LC=1g/100ml摩尔吸光系数百分吸光系数浓度单位用途mol/Lg/100ml分子结构研究含量测定两种吸光系数的区别两种吸光系数的换算关系： C=2.00mg/100ml=0.002g/100mlA=ECl氯霉素(M=323.15)的水溶液，用纯品配制100ml含有2.00mg的水溶液，=278nm,l=1cm,A=0.614，求、。吸光系数（计算示例） 11.2.2偏离Beer定律的因素吸光度(A)与浓度(C)关系曲线11.2.2-1化学因素11.2.2-2光学因素11.2.2-3透光率测量误差 11.2.2-1化学因素离解：max350nm,450nmmax375nm缔合：溶剂化：减免：控制一定的实验条件（稀溶液、pH范围、溶剂等）I2CCl4→紫色C2H5OH→绿色来源：n=V·C 偏离Beer定律的因素：化学因素（图）水溶液中Cr(Ⅵ)两种离子的吸收曲线亚甲蓝阳离子水溶液的吸收光谱Cr2O72-350nmCr2O72-450nmCrO42-375nmC=6.36×10-6mol/L(单体)660nmC=1.27×10-4mol/L(二聚体)610nmC=5.97×10-4mol/L 11.2.2-2光学因素非单色光杂散光(straylight)散射光和反射光非平行光谱带宽度(bandwidth,S)末端吸收处产生假吸收溶液混浊空白对比实际光程l↑→A↑ 11.2.2-3透光率的测量误差(T)来源：仪器噪音(noise)性质：随机误差种类：暗噪音(darknoise)散粒(讯号)噪音(signalshotnoise)暗噪音与迅号噪音的误差曲线暗噪音迅号噪音测量最适宜范围：A=0.2~0.7(或T=20~65%) §11.3紫外-可见分光光度计11.3.1主要部件11.3.2常见光路类型11.3.3一般光学性能 11.3.1紫外-可见分光光度计的主要部件光源：提供能量激发被测物质单色器：将来自光源的连续光谱按波长顺序色散，并从中分离出一定宽度的谱带，获得所需单色光吸收池：盛放溶液并提供一定吸光厚度检测器：检测光讯号，并将光讯号转变为电讯号讯号处理及显示器：迅号放大、数学换算 11.3.2紫外-可见分光光度计的光路类型单光束分光光度计光栅吸收池特点：一束单色光要求：光源稳定校零 双光束分光光度计光栅扇面镜参比池样品池I0II0扇面镜优点：减免光源不稳误差；改变波长不需校零；T=I/I0缺点：不适于浑浊溶液的测定特点：两束同波长单色光 双波长分光光度计单色器1单色器2样品池A=A1-A212特点：两束不同波长单色光优点：无需参比；可测浑浊溶液；可得一阶导数光谱 双重单色器分光光度计光多道二极管阵列检测器分光光度计特点：经先后两次分光优点：单色光较纯，杂散光降得很低(<0.001%)特点：多个二极管阵列紧密排列作为检测器优点：扫描时间极短，1/10秒内完成一张紫外-可见全光光谱 §11.4UV-vis定量分析方法11.4.1单组分定量分析方法11.4.2多组分定量分析方法11.4.3光电比色法 11.4.1单组分定量分析方法测定波长的选择原则吸光系数要大（max）尽可能不选末端吸收尖峰/平坦峰测定波长>溶剂截止波长A尖A平>单组分定量分析方法吸光系数法校正曲线法对照法 11.4.1-1吸光系数法适用：单色光较纯，符合Beer定律方法：绝对法：比较法： UV-vis单组分定量分析方法：吸光系数法（例题）例1:VB12max361nm:E1%1cm=207,A=0.414,l=1cm，求C=？g/100ml例2:样品VB1225.0mg→1000ml，max361nm：A=0.507，l=1cm，求VB12(%)=?C=25mg/1000ml=0.0025g/100ml=20g/ml 11.4.1-2校正/标准/工作曲线法适用：单色光不纯，不完全符合L-B定律（曲线不过零点，线性稍差）方法：标准序列固定条件A~C曲线样品同上条件AxCx曲线回归方程：A=ElC=KCAx校正曲线法示意图Cx UV-vis单组分定量分析方法：校正曲线法（例题）例3:芦丁的含量测定:标准品(0.200mg/ml)0~5ml→25ml样品3.0mg→25ml0.710mg/25ml0.845回归方程：A=0.0105+1.162C(r=0.9996) 11.4.1-3对照法（外标一点法）适用：线性关系较好要求：相同测定条件Cs与Cx相近方法：对照法示意图As=ECsl；Ax=ECxl UV-vis单组分定量分析方法：对照法（例题）例4:VB12的含量测定VB12注射液：2.50mL→10.00mL对照品溶液：25.00mg→1000mLmax361nm:l=1cm,Ax=0.508,As=0.518,求C=?①对照法：②吸光系数法：C=98.2mg/LC=0.00982g/100ml=98.2mg/L UV-vis测定一元弱酸HA的Ka酸式体：AHA=HAC碱式体：AA-=A-CA=AHA+AA-=HA[HA]+A-[A-] UV-vis测定一元弱酸HA的Ka（例题）例5:吸光度法求VB6的pKaVB625mg→100ml→贮备液，l=1cm，pH=2:酸式体max230~375nmpH=7:碱式体 11.4.2多组分定量分析方法数值计算计算分光光度法数值计算数学变换条件：符合Beer定律、满足吸光度加合性、各组分吸收光谱有较大差异数学模型：A=KC方法：图解法（等吸收双波长消去法、系数倍率法）、信号处理方法、矩阵解法 两组分混合物的吸收光谱吸收峰互不重叠a、b互不干扰吸收峰部分重叠a对b干扰，b对a无干扰1：A1a→单组分定量Ca=A1a/E1al2：A2a+b=A2a+A2b=E2aCal+E2bCbl1：A1a→单组分定量Ca=A1a/E1al2：A2b→单组分定量Cb=A2b/E2bl 11.4.2-1等吸收双波长消去法吸光度加和性适用：浑浊溶液、吸收光谱重叠的混合组分原理：双波长型分光光度计A=A2-A1=(2–1)Cl=KC干扰组分b：Ab=A1b-A2b=0待测组分a：Aa较大选择波长1和2的两个基本条件：吸收峰相互重叠a、b互有干扰 等吸收双波长消去法示意图（消去b，测定a）21A1b=A2bAaA=A1a+b-A2a+b=A1a+A1b-A2a-A2b=A1a-A2a=Aa=(E1a-E2a)Cal=EaCal=KCa数学运算：A∝Ca UV-vis多组分定量分析方法：等吸收双波长消去法（消a测b）等吸收双波长消去法示意图（消去a，测定b）21A1a=A2aAbA=A1a+b-A2a+b=A1a+A1b-A2a-A2b=A1b-A2b=Ab=EbCbl=KCb数学运算：A∝Cb优点：无需空白参比，可消除本底吸收及浑浊干扰，显著提高测定灵敏度和准确度。 11.4.2-2系数倍率法适用：干扰组分无合适等吸收波长或不呈峰形掩蔽系数K=A1/A2A=KA2–A1=0优点：待测组分信号同时放大，Ax增大，提高检测灵敏度。原理：一般K放大5~7倍 系数倍率法示意图待测组分21A1yA2yKA2yA1y/A2y=KKA2y=A1y1：A1=A1x+A1y2：A2=K(A2x+A2y)干扰组分y：Ay=KA2y–A1y=0A=A2–A1=K(A2x+A2y)-(A1x+A1y)=KA2x-A1x+(KA2y-A1y)=AxCxl=(KE2x-E1x)Cxl=K"Cx干扰组分=A∝Cx 11.4.2-3导数光谱法（数学变换）应用：定性鉴别、结构分析及痕量测定原理：A=f()C一阶导数光谱(A/-)：(A/)i=(Ai+1–Ai)/(i+1-i)二阶导数光谱(2A/2-)：2A/2=(A/)/……导数光谱：对普通光谱原函数求导所得图象。 导数光谱的特点零阶光谱的极大在奇数阶为0，偶数阶为极值（极大、极小交替出现）。导数光谱的优点：突出特征，增加信息量，分辩率提高，消除杂质干扰。零阶光谱的拐点，在奇数阶为极值，偶数阶为0。阶数n增高，极值数目增加(n+1)，峰形尖锐，分辨率增高。高频信号随导数阶数增高而增大；低频信号（干扰组分）反之——通过对吸收曲线求导，消除干扰。极大极大00极小拐点极小极大00 导数光谱的定量原理导数光谱法对干扰吸收的消除比尔定律：A=C(l=1cm)一阶导数：dA/d=(d/d)C二阶导数：d2A/d2=(d2/d2)C三阶导数：d3A/d3=(d3/d3)C……导数信号∝CA=C0+C1+C22+C33+……+CnnA"=C1+C2+C32+C43+……+Cnn-1微分级数↑→消除阶次较低的背景干扰微分对求导吸光系数在特定波长下的变化率 导数光谱定量数据的测量方法采用导数光谱上适宜振幅作为定量信息导数光谱的求导定量方法：标准对比法求导条件：单色光的谱带宽度(狭缝宽)；波长间隔p.峰谷法d.基线法(正切法)z.峰零法导数阶数：二至五阶。阶数↑→分辩率↑→抗干扰性↑→S/N↓。奇数阶导数光谱易分辨，利于鉴别；偶数阶导数光谱易得到极值，利于测定。几何法代数法 导数光谱分析示例导数光谱法检定乙醇中痕量苯定性鉴别定量分析空白醇的吸收光谱醇中含苯1ppm的吸收光谱醇中含苯10ppm的吸收光谱醇中含苯10ppm的二阶导数光谱醇中含苯10ppm的四阶导数光谱含苯胺和苯酚5ppm的吸收光谱含苯胺和苯酚5ppm的四阶导数光谱FN∝C(苯胺)DC∝C(苯酚)导数光谱法测定废水中苯胺和苯酚的含量 11.4.3光电比色法显色反应的类型：配位反应、氧化还原反应、缩合反应、重氮化偶合反应显色反应的要求化学计量关系确定组成恒定，化学性质稳定选择性好(max≥60nm)试剂和产物的吸收区别明显(max≥60nm)灵敏度高(=103~105)可见分光光度法：对能吸收可见光的有色溶液进行测定的方法。 光电比色法的显色反应条件试剂（显色剂）：灵敏度、稳定性、选择性用量：一般过量；影响产物组成NH4SCN作显色剂测Fe3+：0.01mol/L：Fe3++SCN-→Fe(SCN)2+淡红色0.1mol/L：Fe3++2SCN-→Fe(SCN)2+淡血红色≥0.2mol/L：Fe3++4SCN-→Fe(SCN)4-血红色溶剂控制：条件实验(A-C)影响物质对光的吸收显色反应产物稳定性控制：有机溶媒可提高生成物稳定性 酸碱度酸度过大：影响配合物离解酸度太小：金属离子水解沉淀不同pH范围：生成配合物颜色不同控制：条件实验(A-pH)；缓冲溶液时间时间太短：反应不完全时间太长：有色配合物再次分解控制：条件实验(A-t)温度影响反应速度合适温度：促使正反应迅速完全；防止副反应发生控制：条件实验(A-T) UV-vis定量分析方法小结单组分定量分析方法吸光系数法校正曲线法对照法多组分定量分析方法双波长法导数光谱法光电比色法（单色光较纯）（单色光不纯）（线性关系较好）（等吸收双波长消去法、系数倍率法）（显色反应条件） UV-vis定性及结构分析定性鉴别的一般方法（光谱比较法）纯度检测方面的应用有机化合物结构研究 UV-vis定性鉴别定性鉴别的依据：吸收峰数目吸收峰位置max吸收峰强弱max吸收光谱形状吸收光谱的特征定性鉴别的一般方法：标准对比法比较光谱特征数据——max、min、sh比较A（或max）的比值比较光谱一致性 对比吸收光谱特征数据安宫黄体酮(M=386.53)炔诺酮(M=298.43)max=240±1nmmax=240±1nm3344 对比吸光度（或吸光系数）比值适用：存在几个吸收峰的样品，可消除仪器、浓度、厚度或其它原因造成的误差。V-B12鉴别：max=278、361、550(nm)中国药典规定：A361/A278=1.7~1.88A361/A550=3.15~3.45 对比吸收光谱的一致性三种甾体激素的紫外吸收光谱(10g/ml甲醇溶液）醋酸泼尼松醋酸氢化可的松醋酸可的松 杂质检查UV-vis纯度检测吸收峰位置：化合物无吸收→杂质有吸收→检出吸光系数变化：化合物强吸收吸收光谱变形杂质无(弱)吸收→吸光系数↓杂质吸收更强→吸光系数↑ 杂质限量检测吸光度上限值肾上腺素与肾上腺酮的紫外吸收光谱max=310nm肾上腺酮肾上腺素 峰谷吸光度比值药典规定：C=2mg/ml,l=1cm,max=310nm,A≤0.05杂质吸收峰处无(弱)吸收吸收谷处有吸收 UV-vis结构研究简介有机化合物的紫外吸收光谱饱和碳氢化合物：→*，短，远紫外区化合物max(nm)→*n→*CH3OH150180CH3Cl157173CH3I180255 不饱和脂肪族化合物孤立双键：CH2=CH2(max=193nm)共轭双键：CH2=CH—CH=CH2(max=220nm,>104)E>E最低占有轨道最高空轨道→跃迁几率↑→↑C=C共轭C=C(→*);E↓→↑ 含孤立助色团和生色团的饱和有机化合物孤立助色团：n→*跃迁，长孤立生色团：n→*(275~295nm),n→*(~190nm),→*(150~180nm)α、β-不饱和醛、酮、酸和酯共轭C=C：K带(max=200~260nm，>104)C=O：R带(max=310~350nm，<100)共轭→K带、R带都长移酸、酯的K带比醛、酮长移得多酸、酯的R带比醛、酮长移得少 芳香族化合物苯和取代苯苯吸收带E1E2B（精细结构）max(nm)180220265max470007000~200取代→吸收带长移，B带精细结构消失单取代苯助色团取代：n→*共轭，E带、B带↑→↑生色团取代：E带和K带合并↑，↑B带↑，有时被K带掩盖C=O→R带→极性溶剂↓ 不同溶剂对苯酚吸收光谱的影响环己烷己醇NaOH(0.1mol/L) 双取代苯各种取代基长移效应强弱次序：邻、对位定位基：N(CH3)2>NHCOCH3>O->NH2>OCH3>OH>Br>Cl>CH3间位定位基：NO2>CHO>COCH3>COOH>COO-,CN->SO2NH2>NH3+对位二取代~200nm381nm，=181nm>>52+30=82nm265nm，只比硝基苯(252nm)长13nm邻、对位基间位基252nm,=52nm230nm,=30nm 邻、间位二取代317.5nm273.5nm278.5nm芳杂环类（五元或六元）：饱和：<200nm不饱和：n→*、→* 推断官能团（可能性）有机化合物分子结构研究220~800nm无吸收峰：脂肪族饱和化合物或仅含一个双键的烯烃270~350nm弱吸收：羰基250~300nm中等强度吸收，重心~256nm：苯环210~250nm强吸收：含有两个双键的共轭系统260~350nm强吸收：3~5个共轭系统化合物有色：共轭生色团≥5吸收峰延伸至可见光区：长链共轭或稠环化合物 推断构型和构象结构异构体松香酸左旋松香酸S-trans构型S-cis构型max(nm)283273max151007100 顺反异构体maxEtOH(nm)280295.5max1050029000顺式：短，小反式：长，大位阻效应 确定构象互变异构现象max247nm310nmmax(直立键）>max(平伏键）共轭↑→↑ 推断化合物骨架紫外吸收光谱一致：具有相同的生色团VK11，4-萘醌max(nm)249，260，325250，330lg4.28，4.26，3.284.6，3.8 推断化合物结构水合氯醛可能有两种结构：R带，290nm√ UV-vis重点内容小结掌握基本概念：电子跃迁类型、生色团与助色团、透光率与吸光度基本理论：吸收带类型、特点及影响因素Lambert-Beet定律的物理意义、数学表达式及偏离因素吸光系数的物理意义、表达形式及其相互关系和有关计算紫外-可见分光光度法单组分定量的各种方法 紫外-可见分光光度计的基本部件、工作原理及光路类型紫外-可见分光光度法多组分定量方法用紫外吸收光谱进行定性鉴别及纯度检测的各种方法熟悉光电比色法的原理及应用紫外吸收光谱与有机物分子结构的关系了解 [课后练习]教材P226思考题与习题：1、3、4、12、13、14、16'