分光光度法测定蛇足石杉中总黄酮含量

'　　分光光度法测定蛇足石杉中总黄酮含量作者：马燮何笑聪杨郭汤秀华【摘要】目的建立蛇足石杉中总黄酮含量的测定方法。方法以芦丁为对照品，采用分光光度法在510nm处测定蛇足石杉中总黄酮的含量。结果芦丁浓度在8.16～57.12μg/ml范围内与吸光度值呈良好的线性关系，回归方程为A=10.649C+0.00557，r=0.9982，平均回收率为96.88%，RSD=2.53%。结论该测定方法简便、快速，准确，可作为测定蛇足石杉中总黄酮含量的方法。【关键词】蛇足石杉；总黄酮；芦丁；分光光度法Abstract：ObjectiveToestablishamethodfordeterminingthecontentoftotalflavonoidsinHuperziaserrata.MethodsRutinasreferencesample,thetotalflavonoidscontentinhuperziaserratainedbyspectrophotometryat510nm.ResultsThelinearrelationshipofrutin8.16to57.12mg/ml,A=10.649C-0.00557,r=0.9982.Theaveragerecoveryethodissimple,rapidandaccurate.ItcanbeusedfordeterminingthecontentoftotalflavonoidsinHuperziaserrata. Keyetry蛇足石杉Huperziaserrata，别名千层塔，蛇足草，为石杉科（Huperiaceae）石杉属(HuperziaBernh)的一种药用蕨类植物。蛇足石杉性喜阴湿，所适应的生态环境为中亚热带常绿阔叶林和南亚热带季风常绿阔叶林及其次生生态系统，在我国分布广泛［1］，在民间常用来治疗跌打损伤、淤血肿痛、精神分裂等疾病［2］。蛇足石杉成分复杂，目前国内外研究较多的是其生物碱成分，其中石杉碱甲（HuperzineA）具有高效、低毒、可逆并高选择性抑制乙酰胆碱酯酶的作用而备受关注，但石杉碱甲在蛇足石杉中的含量很低，仅为万分之几［3～4］。黄酮类化合物具有抗肿瘤、抗心脑血管疾病、抗炎镇痛、免疫调节、抗病毒、抗衰老以及抗辐射等作用而格外引人瞩目，为了对该药用植物资源进行综合利用，采用乙醇为溶剂，以芦丁为对照品，采用分光光度法对其中的黄酮类物质进行了研究，为进一步有效地开发和综合利用蛇足石杉资源提供参考［5，6］。1材料与仪器1.1材料蛇足石杉，购自四川峨眉，经鉴定为蛇足石杉全草，60℃烘干，粉碎过20目筛备用。对照品芦丁，购自成都思科华生物技术有限公司（HPLC＞98%），其余试剂均为分析纯，实验用水为实验室自制去离子水。 1.2仪器UV-2102PC型紫外分光光度计K［尤尼柯（上海）仪器有限公司］；RE52-86A型旋转蒸发器（上海亚荣生化仪器厂）；MAS-1型常压微波辅助合成萃取反应仪（上海新仪微波化学科技有限公司）。2方法与结果2.1供试品溶液的制备取5g蛇足石杉粗粉，加入适量的80%乙醇-水溶液（V/V），静置10min，于微波炉中在600in，加入80%乙醇溶液100ml，80℃回流提取2次，每次30min，合并2次滤液，置于250ml的容量瓶中，加80%乙醇-水溶液至刻度，待用。蛇足石杉中总黄酮含量按下式计算：总黄酮含量（%）=CV1V31000V2m×100%其中C-样品溶液浓度（mg/ml）；V1-比色管中的定容体积（ml）；V2-移取到比色管中的提取液体积（ml）；V3-提取液体积（ml）；m-蛇足石杉粗粉质量（g）。2.2对照品溶液的配置称取干燥至恒重的芦丁标准品10.2mg，用60%的乙醇-水溶液（V/V）溶解，定容至50ml，摇匀得0.2040mg/ml的芦丁贮备液。2.3检测波长的确定取5.00ml的0.2040mg/ml芦丁标准溶液置于25ml比色管中，用60%的乙醇水溶液稀释至10.0ml，再加入1.00ml5%的亚硝酸钠溶液，摇匀，静置6min，加入1.00ml的10%硝酸铝溶液，摇匀，再静置6 min，加入4.00ml的10%氢氧化钠溶液，定容至25ml。放置15min后，以试剂空白作参比，波长间隔为1nm，用1cm的玻璃比色皿在400～700nm波长范围内用紫外可见光分光光度计进行扫描，扫描曲线如图1中实线所示：取“2.1”项中的待测液4.00ml于25ml的比色管中，加入60%的乙醇-水溶液至10.0ml，再加入1.00ml5%的亚硝酸钠溶液，摇匀，静置6min，加入1.00ml的10%硝酸铝溶液，摇匀，再静置6min，加入4.00ml的10%氢氧化钠溶液，定容至25ml。放置15min后，用1cm的玻璃比色皿在400～700nm波长范围内用紫外可见光分光光度计进行扫描，扫描曲线如图1中虚线所示。根据图1可知，蛇足石杉总黄酮提取物经铝盐显色后最大吸收波长在510nm处，与芦丁标准溶液显色后的扫描曲线相似，因此，本方法选用510nm为测定波长。2.4标准曲线的建立分别取1.00，2.00，3.00，4.00和5.00，6.00ml，7.00ml的0.2040mg/ml芦丁标准溶液置于25ml的比色管中，用60%的乙醇-水溶液稀释至10.0ml，再加入1.00ml的5%的亚硝酸钠溶液，摇匀，静置6min，加入1.00ml的10%硝酸铝溶液，摇匀，静置6min，加入4.00ml的10%氢氧化钠，定容至刻度。放置15min后，以试剂空白作参比，用1cm的玻璃比色皿于510 nm波长处用紫外可见光分光光度计测定其吸光度。以吸光度（A）为纵坐标，以芦丁标准溶液的浓度（mg/ml）为横坐标绘制标准曲线，如图2所示。用最小二乘法进行回归，得到芦丁浓度（C）与吸光度（A）关系曲线的回归方程式：A=10.649C+0.00557，r=0.9982，n=7，P＜0.0001，式中：C为芦丁标准溶液的浓度（mg/ml），A为吸光度。2.5精密度实验分别取“2.1”项中所得的蛇足石杉中黄酮类化合物的提取液5份，各4.00ml于25ml的比色管中用60%的乙醇水溶液稀释至10.0ml，再加入1.00ml的5%的亚硝酸钠溶液，摇匀，静置6min，加入1.00ml的10%硝酸铝溶液，摇匀，静置6min，加入4.00ml的10%氢氧化钠，定容至刻度。放置15min后，以试剂空白作参比，用1cm的玻璃比色皿于510nm波长处用紫外可见光分光光度计测定其吸光度，代入回归方程计算黄酮含量。2.6稳定性实验分别取2.00ml的对照品和4.00ml供试品溶液，按“2.3”项下方法显色后，每隔5min测定一次吸光度值，结果表明，对照品溶液在2h内吸光度值较为稳定，而供试品溶液在显色后30min内吸光度值较稳定，因此，提取液应在显色后30min内测定。表1精密度测试结果2.7加标回收率取供试品溶液4.00ml各5份于25 ml的比色管中，分别加入0.5ml，1.00ml，1.50ml，2.00ml和2.50ml的0.2040mg/ml芦丁标准溶液，按“2.3”项下方法显色后测定总黄酮含量，计算加标回收率，结果见表2。表2加标回收率实验结果实验结果表明，总黄酮含量在8.16～57.12mg/ml线性范围内，回收率在94.06～100.54%之间，平均回收率为96.88%，RSD=2.53%。3结论研究表明，在510nm下，在浓度为8.16～57.12mg/ml范围内，芦丁浓度与吸光度值呈良好的线性关系，回归方程为A=10.649C+0.00557，r=0.9982；平均加标回收率为96.88%，RSD为2.53%；经测定，样品中总黄酮含量为0.879%。该测定方法简便、快速，准确，可作为测定蛇足石杉中总黄酮含量的方法。【参考'