紫外分光光度法测蛋白质含量uv-4802

'紫外分光光度法测定蛋白质含量1、学习紫外分光光度法测定蛋白质含量的原理；2、掌握紫外分光光度法测定蛋白质含量的实验技术；3、掌握UV-4802紫外-可见分光光度计的使用方法并了解此仪器的主要构造。二、实验原理：紫外-可见吸收光谱法又称紫外-可见分光光度法，是以溶液中物质的分子或离子对紫外和可见光谱区辐射能的选择性吸收为基础而建立起来的一类分析方法。紫外光波长在10-400nm之间，可见光波长在400-780nm之间，可被人们的眼睛所感觉。紫外-可见吸收光谱的特点：带光谱、分子光谱。  紫外分光光度法根据最大吸收波长可做定性分析；根据朗伯-比尔定律（标准曲线法和标准加入法）可做定量分析。  a.定性分析原理：根据吸收曲线可以判断吸收峰的数目、位置、相对强度以及吸收峰的形状。  b.定量分析原理：  根据朗伯－比耳定律：A=εbc，当入射光波长λ及光程b一定时，在一定浓度范围内，有色物质的吸光度A与该物质的浓度c成正比。  定量分析常用的方法是标准曲线法即只要绘出以吸光度A为纵坐标，浓度c为横坐标的标准曲线，测出试液的吸光度，就可以由标准曲线查得对应的浓度值，即未知样的含量。  （5）仪器组成部件:  各种类型的紫外-可见分光光度计，从总体上来说是由五个部分组成，即光源、单色器、吸收池、检测器和信号显示记录装置。  2.本实验采用紫外分光光度法测定蛋白质含量。  （1）蛋白质中酪氨酸和色氨酸残基的苯环含有共轭双键，所以蛋白质溶液在275--280nm具有一个吸收紫外吸收高峰。在一定浓度范围内，蛋白质溶液在最大吸收波长处的吸光度与其浓度成正比，服从朗伯-比耳定律，因此可作定量分析。该法测定蛋白质的浓度范围为0.1—1.0mg/mL。  （2）由于不同蛋白质中酪氨酸和色氨酸的含量不同，所处的微环境也不同，所以不同蛋白质溶液在280nm的光吸收职也不同。据初步统计，浓度为1.0mg/mL的1800种蛋白质及蛋白质亚基在280nm的吸光度在0.3—3.0之间，平均值为1.25+/-0.51。所以此种方法测量的准确度差一点。   （4）蛋白质的肽键在200—250nm有强的紫外吸收。其光吸收强度在一定范围与浓度成正比，其波长越短，光吸收越强。若选用215nm可减少干扰及光散射，用215nm和225nm光吸收差值与单一波长测定相比，可减少非蛋白质成分引起的误差，因此，对稀溶液中蛋白质浓度测定，可选用215nm和225nm光吸收差法。常用下列经验公式：蛋白质浓度（mg/mL）=0.144（A215-A225），（A215和A225分别为蛋白质溶液在215nm和225nm处测得的吸光度值）。三、仪器与试剂：【仪器】1．UV-4802紫外-可见分光光度计(已配备石英比色皿1cm2个）2．50mL容量瓶8个,100mL1个,500mL2个3．移液管：2mL1支，10mL1支4．刻度吸管：10mL、5mL各1支6．玻璃棒1支7．烧杯500ML2个8．吸耳球1个【试剂】1、标准牛血清白蛋白溶液：5.00mg/mL溶液、2、0.9%NaCl溶液、3、待测蛋白质溶液（牛血清白蛋白）。四、实验步骤：（一）基本操作：  1、启动计算机，打开主机电源开关，启动工作站并初始化仪器,预热半小时。  2、用吸量管分别吸取0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6mL5.00mg/mL标准蛋白质溶液于5只50mL容量瓶中，用0.9%NaCl溶液稀释至刻度，摇匀。用1cm石英比色皿，以0.9%NaCl溶液为参比.  3、在工作界面上选择测量项目为光谱扫描，设置扫描参数（起点：400nm，终点：250nm，速度：中，间隔：1.0nm，单次扫描）  4、将两个均装有0.9%NaCl溶液的1cm石英比色皿放入测量池中，进行基线扫描。  （二）吸收曲线的制作:  将放在前面的比色皿中溶液换为0.3mg/mL的蛋白质溶液，点击START进行扫描，得到如下吸收曲线，从曲线中我们可以看出此标准蛋白质溶液的最大吸收波长为279nm。   3.标准曲线的制作：  在工作界面上选择测量项目为光度测量设置测量条件（测量波长：279.00nm）。用1cm石英比色皿，以0.9%NaCl溶液为参比，在279nm处分别测定以上所配标准溶液的吸光度A279，记录所得读数。浓度（mg./mL）  0.4  0.5  0.6   0.7  0.8A279            以蛋白质浓度为横坐标，吸光度为纵坐标绘制标准曲线：4、样品测定：取待测蛋白质溶液2mL，按上述方法测定279nm处的吸光度。根据样品溶液的吸光度，从标准曲线上查出待测蛋白质的浓度。误差分析：主要是由于溶液浓度在配制过程中的误差引起。'