果酒中叶绿素铜钠的测定分光光度法

'研究简报生命科学仪器2008第6卷/1月刊果酒中叶绿素铜钠的测定分光光度法孔鲁裔（国家农业标准化监测与研究中心　黑龙江）摘要研究各种操作条件对分光光度法测定果酒中叶绿素铜钠的影响,得到了较有价值的结论。关键词叶绿酸铜钠；果酒；分光光度法1前言铵，至500mL容量瓶中，用水溶解并稀释至刻度，于棕色试剂瓶中保存。叶绿酸铜钠是用有机溶剂从蚕沙或绿色植物的叶f）解吸液：0.1mol/L氢氧化钠:无水甲醇溶液=茎中提取的叶绿素，再经皂化、铜代所得到的墨绿色1:10（V/V）。粉末，是一种半天然色素。在医药、食品及日用工业g）叶绿素铜钠标准品：≥99.7%上有广泛的用途，可在食品加工中作罐头青豆、苦瓜、h）标准储备溶液：精确称取按其纯度折算为蕨菜以及糖果、蜜饯、饮料、酒等的着色剂。大量食100%质量的叶绿素铜钠标准品0.0500g，于100mL用会造成人体重金属铜中毒、心血管等疾病。我国食棕色容量瓶中，用蒸馏水溶解并稀释至刻度，此溶品添加剂卫生标准（GB2760-96）中规定叶绿素铜钠液浓度为500μg/mL，需当天配置。盐在食品中最大使用量为0.5g/kg，有了规定的限量，2.1.2仪器设备没有定量的方法作正确的检测也就无法监控。为了确a）紫外可见分光光度计。保安全，建立一个高效、准确的测定叶绿素铜钠的方b）砂芯漏斗G3。法是势在必行的。c）溶剂过滤器。本方法是目前对于果酒中叶绿素铜钠的检测最直2.2操作步骤接的方法。叶绿素铜钠的分析方法国外报道的有溶2.2.1标准曲线的制备与测定剂抽提法、氧化铝柱、聚酰胺薄层分析法等。但2.2.1.1标准工作溶液的配制是，柱法操作复杂、时间长，难以避免色素分解、精确移取500μg/mL标准溶液10mL至100mL烧褪色。因此，本方法立足于运用常规的化学检测方杯中，加入0.2mol/L的乙酸铵溶液30mL，用冰乙法，采用了聚酰胺吸附法经过系统改进，试验得到酸调pH至5～6。加入3.0g聚酰胺粉，充分搅拌2min，了快速、简易、良好的效果。避光静置5min，用G3砂芯漏斗抽滤。再用约200mL2检测方法蒸馏水充分洗涤，弃去滤液。用75mL解吸液分三次解吸色素，每次倒入约25mL解吸液，浸泡2min，2.1试剂与仪器再摇匀2min，抽滤并用10mL解吸液洗净抽滤瓶中残2.1.1试剂与材料液。收集滤液，用解吸液定容至100mL，配制成浓度a）聚酰胺粉，80目～120目。为50μg/mL的标准溶液，此溶液临用时配制。b）无水甲醇、冰乙酸、氢氧化钠、乙酸铵，2.2.1.2标准系列的配制及测定均为分析纯。分别吸取标准工作液0mL、5.0mL、10.0mL、c）0.1mol/L氢氧化钠溶液：称取0.400g氢氧化30.0mL、50.0mL，至50mL容量瓶中，用解吸液稀钠至100mL容量瓶中，用水溶解并稀释至刻度，于释至刻度，配制成浓度为0μg/mL、5μg/mL、10试剂瓶中保存。μg/mL、30μg/mL、50μg/mL的标准系列。以d）4mol/L氢氧化钠溶液：称取16.0g氢氧化0μg/mL溶液为空白，用分光光度计以1厘米比色钠，至100mL容量瓶中，用水溶解并稀释至刻度，杯于404nm波长下测定其吸光值。于试剂瓶中保存。2.2.2样品制备e）0.2mol/L乙酸铵缓冲液：称取7.708g乙酸将样品摇匀，准确称取10.00g～20.00g样品至48 研究简报生命科学仪器2008第6卷/1月刊100mL烧杯中,加入0.2mol/L的乙酸铵溶液30mL,在溶于醇和氯仿。在食品加工中做罐头青豆，苦瓜以55℃～60℃的水浴中加热3min～5min。用氢氧化钠及糖果、蜜饯、饮料、酒等的着色剂。溶液和冰乙酸调pH至5～6。预先称取3.0g聚酰铵粉3.2光谱扫描于小烧杯中，加蒸馏水调成浆状，加入样品中，充分对叶绿素铜钠标准品进行紫外光谱分析扫描测其搅拌。将样品溶液转移至G3砂芯漏斗中，抽滤，用最大吸收峰为404nm，如图1。约200mL蒸馏水充分洗涤，弃去滤液。用75mL解吸3.3聚酰胺粉吸附叶绿素铜钠最佳pH值范围的选择液分三次解吸色素（同2.2.1.1），收集滤液，用解吸根据资料显示，聚酰胺粉在酸性条件下吸附性最液定容至50mL。好，而在试验中却发现叶绿素铜钠在酸性条件下，生2.2.3样品测定成叶绿酸沉淀。为了选择最佳pH值范围，我们选用取以上样品的制备液，以标准曲线的0μg/mLpH1、2、3、4、5、5.5、6、7、9.5的缓冲溶液各30mL，溶液为空白，用分光光度计以1厘米比色杯于404nm分别加入500μg/mL的叶绿素铜钠标准溶液10mL和波长下测定其吸光值。3.0g聚酰胺粉，经吸附后用100mL氢氧化钠—甲醇解吸液解吸，目测情况如表1。2.3结果计算结果表明，pH5.0～6.0时无明显沉淀，吸附较样品中叶绿素铜钠的含量（g/kg）按式（1）完全，解吸附完全；中性条件下吸附与解吸最好。计算：⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯（1）3.4吸附剂用量的选择分别吸取500μg/mL的叶绿素铜钠标准溶液式中：10mL于6个100mL烧杯中，加入0.2mol/L的乙酸C——样品中叶绿素铜钠的含量，g/kg；铵溶液30mL后用冰乙酸调pH至5～6。分别加入的Ci——从标准曲线上查得的叶绿素铜钠盐的含0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0g聚酰胺粉，制备与测量，μg/mL；定过程同（2.2.1），并计算其回收率，如表2。V——样品定容体积，mL；结果表明，用3.0g聚酰胺粉吸附叶绿素铜钠，回m——称取样品重量，g。收率在90%以上效果最好。计算结果保留到小数点后两位。3.5解吸溶剂的选择3.5.1叶绿素铜钠盐在不同溶剂中的吸收情况3方法的主要技术研究过程吸取500μg/mL的叶绿素铜钠标准溶液1mL于3.1对叶绿素铜钠提取工艺的研究3个50mL容量瓶中，分别加入0.2mol/L的乙酸铵溶叶绿素铜纳是用有机溶剂从蚕沙中提取叶绿素，液（pH7）、0.1mol/L的氢氧化铵—氯化铵溶液再经皂化、铜代所得的墨绿色粉状品，是一种半天（1:10；pH10）及0.1mol/L氢氧化钠—无水甲醇溶然色素。叶绿素铜钠纯品，呈弱碱性易溶于水，略液（1:10；pH11）定容至刻度，用分光光度计以1厘49 研究简报生命科学仪器2008第6卷/1月刊表1　目测吸附情况pH缓冲液吸附情况解吸附情况1.0盐酸-乙酸钠有明显的沉淀,上层液混浊,带绿色------2.0盐酸-乙酸钠有沉淀,上层液混浊,略带淡绿色------3.0盐酸-乙酸钠有沉淀,上层液混浊,无色------4.0盐酸-乙酸钠有沉淀,上层液混浊,无色------5.0盐酸-乙酸钠无明显沉淀,上层液较澄清,略带淡绿色洗脱色素较快,聚酰胺层无色5.5盐酸-乙酸钠无明显沉淀,上层液较澄清,略带淡绿色洗脱色素较快,聚酰胺层无色6.0盐酸-乙酸钠无明显沉淀,上层液较澄清,无色洗脱色素较快,聚酰胺层无色7.0乙酸铵无沉淀,上层液澄清,无色洗脱色素较慢,聚酰胺层无色9.5氢氧化铵-氯化铵无沉淀,上层液澄清,略带淡绿色洗脱色素不完全,聚酰胺层略带淡绿色表3　在不同溶剂中的吸收情况波长0.2mol/L乙酸铵溶液的吸0.1mol/L氢氧化铵—氯化铵0.1mol/L氢氧化钠—无水甲醇光值溶液的吸光值溶液的吸光值404nm0.4910.9920.675表2　吸附剂用量对回收率的影响表4　其它不同解吸液中的解吸附情况吸附剂用量测定浓度回收率解吸液回收率%gμg/mL%0.1mol/L氢氧化钠—无水甲醇溶液930.59.58479.171mol/L氢氧化钠—无水甲醇溶液931.040.07380.150.1mol/L氢氧化钠—无水丙醇溶液滤液混浊无法测定2.041.63783.27表5　标准曲线系列方程及相关系数3.045.11790.234.044.74989.50浓度(μg/mL)吸光值回归方程相关系数5.043.54687.095.00000.1821Y=0.034x+0.0131r=0.999710.0000.358630.0001.058750.0001.6987如表4。结果表明，前两种解吸液都可使用，第三种解吸液滤液混浊，影响比色。所以经综合考虑，本方法米比色杯于404nm波长下测定其吸光值，如下表3。选用第一种解吸液。结果表明，在相同条件下叶绿素铜钠盐在3.6对试验方法中标准品的标准曲线及线性关系进0.1mol/L氢氧化钠—无水甲醇（1:10；pH11）溶剂行研究中的吸光值最大测定灵敏度最高。配置不同浓度的标准溶液进行测定（同2.2.1），3.5.2叶绿素铜钠盐在其它不同解吸液中的解吸附情况画出不同浓度范围内的标准曲线并计算其相关系分别吸取500μg/mL的叶绿素铜钠标准，溶液数，如表5、图2。结果表明，以吸光值为纵坐标，10mL于3个100mL烧杯中，吸附过程同（2.2.1），叶绿素铜钠标准品含量为横坐标对其进行线性回归分别用下列三种解吸液分数次解吸色素，并分别收分析。回归方程为Y=0.034x+0.0131，相关系数为集滤液，用上述解吸液各自定容至100mL，于404nmR2=0.9997。下用1cm比色杯测定其吸光值，并计算其回收率，3.7对方法进行重现性、精密度和准确度的测试50 研究简报生命科学仪器2008第6卷/1月刊表6　方法重现性和精密度的测试序号测定吸光值测定浓度，μg/mL平均值，μg/mL标准偏差，%相对标准偏差，%10.859625.00125.0030.0030.01220.859825.00830.859625.00140.859725.00450.859625.00160.859625.001表7　方法的准确度计算序号测定吸光值测定浓度平均值真实值绝对误差相对误差μg/mLμg/mLμg/mLμg/mL%10.859625.00125.00325.0000.0030.01220.859825.00830.859625.00140.859725.00450.859625.00160.859625.001表8样品含量及重现性的测试名称序号测定吸光值测定浓度，μg/mL样品称样量，g测定样品含量，g/kg平均值，g/kg青苹果酒10.09192.7128M1=10.000.01360.013720.09122.68980.013430.09212.71690.013640.09452.78770.013950.09432.78100.013960.09432.78330.0139青葡萄酒70.23146.2165M2=10.000.03110.031380.23206.23240.031290.23296.25710.0313100.23346.27080.0314110.23346.27040.0314120.23206.23240.0312表9　样品精密度的测试样品名称平均值，g/kg标准偏差，%相对标准偏差，%青苹果酒0.01370.00021.5000青葡萄酒0.03130.00010.319551 研究简报生命科学仪器2008第6卷/1月刊表10　样品的准确度计算样品名称序号测定值，g/kg平均值，g/kg绝对误差，μg/mL相对误差，%青苹果酒10.01360.0137-0.0001-0.729520.0134-0.0003-2.190030.0136-0.0001-0.729540.01390.00021.459950.01390.00021.459960.01390.00021.4599青葡萄酒70.03110.0313-0.00020.639080.0312-0.00010.319590.031300100.03140.00010.3195110.03140.00010.3195120.0312-0.0001-0.3195表11　样品第一次加标的回收率计算样品名称样品平均值样品的加标量测定的加标量样品回收率，%μg/kgg/kg平均值，g/kg青苹果酒0.0137加入0.50mL500μg/mL0.0259103.6的标准溶液于10.00g样品中，T1=0.0250g/kg青葡萄酒0.0313加入0.50mL500μg/mL0.024497.6的标准溶液于10.00g样品中，T2=0.0250g/kg表12样品第二次加标的回收率计算样品名称样品平均值样品的加标量测定的加标样品回收率，%μg/kgg/kg量平均值，μg/kg青苹果酒0.0137加入1.00mL500μg/mL0.0513102.6标准溶液于10.00g样品中，T1=0.0500g/kg青葡萄酒0.0313加入1.00mL500μg/mL0.0531106.2标准溶液于10.00g样品中，T2=0.0500g/kg表13　方法检出限的测定稀释倍数标准溶液含量g/kg测定浓度，μg/mL回收率，%稀释10倍0.002500.5021100.42稀释20倍0.001250.2509100.36稀释25倍0.001000.2031101.55稀释30倍0.000830.133580.10052 研究简报生命科学仪器2008第6卷/1月刊3.7.125μg/mL叶绿素铜钠标准使用液的配制3.9方法检出限的测定精确移取500μg/mL叶绿素铜钠标准使用液5mL将标准曲线中的5μg/mL的标准溶液，逐级稀于100mL烧杯中，配制过程同（2.2.1.1），配制成释，测定本标准检出限为0.001g/kg，如表13。浓度为25μg/mL的标准使用液。4讨论3.7.2方法重现性和精密度的测试分别配制6个25μg/mL叶绿素铜钠标准使用液聚酰胺粉吸附色素时，如果pH太低，叶绿素（重复配制过程同上3.7.1），分别以配制成的铜钠盐要生成叶绿酸沉淀，太高时吸附又不完全，试25μg/mL的标准使用液为样品溶液，6个样液按上验证明在pH6.5～7范围内，色素既不沉淀，吸附又不述条件，测定其浓度，计算标准偏差和相对标准偏差。完全。结果表明，本方法重现性好，达到一定的精密度，如样品制备时，由于样品本身含有天然叶绿素，表6。但经发酵和高温杀菌后色泽变黄，不被聚酰胺所吸3.7.3计算方法的准确度附，所以在抽滤洗涤时要用蒸馏水充分洗涤干净后根据上述测定结果，已知6个样液配制浓度为才能进行解吸，否则影响测定结果。25μg/mL，计算测定值与真实值的绝对误差和相对解吸色素时，加入解吸液后，要让其与聚酰胺吸误差。结果表明，本方法的准确度良好，如表7。附层有充分作用的时间，然后再抽滤，直至色素全部3.8样品含量、样品重现性、精密度及准确度的测定解吸完，否则解吸液用量太多，超过定容体积，而3.8.1样品含量及样品重现性的测定且也不易完全。选择有代表性的两种样品，用以上确定的外标在加热驱除二氧化碳时，温度不易过高，否则叶法重复测定其叶绿素铜钠盐含量数次，求平均值，绿素铜钠盐容易分解褪色。如表8。如果发现解吸液混浊时，可重新用G3漏斗自然3.8.2计算样品标准偏差和相对标准偏差过滤，或用离心机（4000转/分）离心后取清夜进针对以上测得的数据，计算样品标准偏差和相行比色。对标准偏差。所得结果表明，本方法测定的样品重现性和精密度良好，如表9。参考文献3.8.3样品准确度的计算[1]《中国农业百科全书》（酒卷）[M]，北京：农业出版针对以上已知含量的样品进行多次测量，计算社，1983；其准确度。所得结果表明，本方法测定的样品准确[2]李华，《现代葡萄酒工艺学》[M]，西安：陕西人民出度良好，如表10。版社，1995；3.8.4样品的回收率测试；[3]魏克民等，《蚕副产品在中医药领域综合利用的现状与优势》[M]，浙江：中医药研究院，2005；针对样品加入不同浓度的标准物质，按以上方[4]王正平，《叶绿素铜钠盐的制备及稳定性的研究》[J]，法进行处理并测定其含量，计算回收率，结果表明哈尔滨：工程大学化工学报，2004。样品均能达到一定的回收率如表11、12。MethodfordeterminationofsodiumcopperchlorophyllininratafeebyspectrophotometricmethodLuyiKong（NationalAgricultureStandardizationMonitorandResearchCenter（Heilongjiang）,Heilongjiang,harbin150000China）AbstractWestudytheaffectionforthespectrophotometricmethoddeterminationofsodiumcopperchlorophyllininratafeeofallkindsofcoefficiantofvariationandobtainvaluableresults.Keywordssodiumcopperchlorophyllin，ratafee，spectrophotometricmethod53'