水质叶绿素a 的测定分光光度法

'附件3《水质叶绿素a的测定分光光度法》（征求意见稿）编制说明《水质叶绿素a的测定分光光度法》标准编制组二○一五年八月 项目名称：水质叶绿素a的测定分光光度法项目统一编号：939承担单位：辽宁省环境监测实验中心编制组主要成员：王秋丽、赵丽娟、王琳、丁振军、刘畅、徐天赐、姜永伟、秦雨、郭杨、朱广钦、叶明、贺业菊标准所技术管理负责人：周羽化、雷晶、张虞标准处项目负责人：张朔I 目录1项目背景..........................................................................................................................................11.1任务来源...................................................................................................................................11.2工作过程...................................................................................................................................12标准制订的必要性分析..................................................................................................................32.1叶绿素A的环境危害...............................................................................................................32.2相关环保标准和环保工作的需要...........................................................................................43国内外相关分析方法研究..............................................................................................................53.1主要国家、地区及国际组织相关分析方法研究..................................................................53.2国内相关分析方法研究...........................................................................................................84标准制订的基本原则和技术路线................................................................................................104.1标准制订的基本原则.............................................................................................................104.2标准制订的技术路线.............................................................................................................105方法研究报告................................................................................................................................125.1方法研究的目标.....................................................................................................................125.2方法原理.................................................................................................................................135.3试剂和材料.............................................................................................................................135.4仪器和设备.............................................................................................................................165.5样品的采集和保存.................................................................................................................175.6分析步骤.................................................................................................................................215.7结果计算.................................................................................................................................315.8质量保证和质量控制.............................................................................................................345.9注意事项.................................................................................................................................346方法验证........................................................................................................................................356.1方法验证方案.........................................................................................................................356.2方法验证过程.........................................................................................................................367与开题报告的差异说明................................................................................................................388本标准实施的建议........................................................................................................................399参考文献........................................................................................................................................39II 《水质叶绿素a的测定分光光度法》编制说明1项目背景1.1任务来源（1）2006年6月，根据《关于下达2006年度国家环境保护标准制订项目计划的通知》（环办函[2006]371号），原国家环保总局办公厅下达了制订《水质叶绿素a的测定分光光度法》国家环保标准制修订计划，项目统一编号为：939。（2）《水质叶绿素a的测定分光光度法》项目承担单位为：辽宁省环境监测实验中心。1.2工作过程1.2.1前期调研工作（1）成立标准编制组2006年7月，辽宁省环境监测中心承接了《水质叶绿素a的测定分光光度法》制修订任务以后，成立了标准编制组。（2）查询国内外相关标准和文献资料本标准编制组成员根据《国家环境保护标准制修订工作管理办法》（2006年，第41号公告）的相关规定，查阅和收集了国内外相关标准方法和文献资料。目前国内环境保护部门对于地表水叶绿素测定方面急需建立监测标准方法。通过对文献的研究，确定了本标准制定的原则、方法和技术依据，确定了本标准应该成为适应我国大部分环境监测及相关实验室仪器设备、技术能力的水质叶绿素测定-分光光度法监测方法标准的目标，并确立研究的相关技术路线。1.2.2标准开题论证会情况2009年12月8日，“水质叶绿素a的测定分光光度法”承担单位在北京举行了此标准的开题论证会，标准编制小组向论证会提交了本课题的开题论证报告及标准文本初稿。开题论证会经过论证委员相关质询、讨论，认为标准主编单位提供的材料齐全、内容较完整；对国内外相关标准及文献进行了较为充分的调研；标准技术路线合理可行。论证委员会通过了该标准的开题论证。同时提出了具体修改意见和建议：（1）进一步细化操作过程及过程中的质量控制要求；（2）通过方法验证进一步明确叶绿素a的提取方法；（3）鉴于采样、抽滤等环节对测定结果有很大影响，建议具体细化操作过程。1 1.2.3标准方法研讨会2014年10月《水质叶绿素a的测定分光光度法》承担单位在北京举行了此标准的研讨会，标准编制小组向论证会提交了本课题的征求意见稿和编制说明。专家会议意见：（1）编制说明中补充国内外相关标准的主要技术内容和研究方法的最新进展；（2）完善方法验证方案，细化实验条件；（3）重新核实结果单位表述，结果统一用mg/m3表示；（4）确认过滤后样品保存条件；核实计算公式中的校正系数；（5）在标准文本中，明确方法检出限的取样量和比色皿光程等条件；建议改变比色皿光程和增加取样量，以降低方法检出限；（6）完善方法原理的描述；在样品采集中增加现场过滤内容；（7）完善质量保证和质量控制内容。1.2.4研究并建立标准方法2014年12月～2015年3月，编制组在查询、收集国内外相关标准、文献和技术资料以及专家论证意见的基础上，在标准征求意见稿和编制说明初稿的基础上，细化修改实验条件，对叶绿素测定方法中的技术参数和主要操作过程，如样品保存条件、提取方法（滤膜的选择、研磨、浸泡时间）、质量保证与质量控制等方面做了细致的研究和探讨，并按《环境监测分析方法标准制修订技术导则》（HJ168-2010）的相关要求修改完善标准方法的有关内容。2015年4月7日～17日，组织6家实验室进行方法验证。2015年4月28日，回收验证报告，进行数据的汇总和分析整理。完成验证报告。同时对其标准编制说明及标准文本征求意见稿及验证报告进行完善。1.2.5编写标准征求意见稿和编制说明2014年10月，编写完成《水质叶绿素a的测定分光光度法》的标准征求意见稿和编制说明初稿。2015年5月，编写完成水质叶绿素a的测定分光光度法》的标准征求意见稿和编制说明的修改。2015年6月4日，在北京举行了此标准的研讨会，标准编制小组提交了本课题的征求意见稿和编制说明。专家会议意见如下：1、编制说明中补充国产玻璃纤维滤膜和进口玻璃纤维滤膜性能比较的实验数据；补充不同型号分光光度计比对数据；通过查阅资料，在相关环保标准和环保工作需求上补充我国地表水中叶绿素a的浓度范围；查阅资料和相关实验数据补充叶绿素a计算公式选取的理由。2、标准文本中，规范性引用文件中，去掉ASTMSL。滤膜删除乙酸纤维滤膜。增加空白实验条款，完善计算公式的表述。由于方法标准叶绿素a为水质中叶绿素a的含量，计算结果统一用μg/L表示。2015年6月~8月，按照专家的意见对标准文本及编制说明再次修改完善。2 2标准制订的必要性分析2.1叶绿素a的环境危害2.1.1叶绿素a的基本理化性质叶绿素（Chlorophyll）是植物光合作用中的重要光合色素，可分为a、b、c、d四类。叶绿素不溶于水，而溶于有机溶剂，如乙醇、丙酮、乙醚、氯仿等；叶绿素不很稳定，光、酸、碱、氧、氧化剂等都会使其分解；叶绿素a分子式为C55H72O5N4Mg，酸性条件下，叶绿素a分子很容易失去卟啉环中的镁成为脱镁叶绿素；叶绿素a存在于所有的浮游植物中，大约占有机干重的1%～2%。2.1.2叶绿素a的环境危害叶绿素a本身对环境没有危害，但它是估算浮游植物生物量的重要指标，可以通过测定水中浮游植物叶绿素a的含量，掌握水体的初级生产力情况和富营养化水平，在环境监测中，叶绿素a含量是评价水体富营养化的指标之一。水体出现富营养化现象时，由于浮游生物大量繁殖，往往使水体呈现蓝色、红色、棕色、乳白色等，这种现象在江河湖泊中叫水华。水体富营养化的危害主要表现在三个方面。(1)富营养化造成水的透明度降低，阳光难以穿透水层，从而影响水中植物的光合作用和氧气的释放，同时浮游生物的大量繁殖，消耗了水中大量的氧，使水中溶解氧严重不足，而水面植物的光合作用，则可能造成局部溶解氧的过饱和。溶解氧过饱和以及水中溶解氧少，都对水生动物(主要是鱼类)有害，造成鱼类大量死亡。(2)富营养化水体底层堆积的有机物质在厌氧条件下分解产生的有害气体，以及一些浮游生物产生的生物毒素也会伤害水生动物。(2)富营养化水中含有亚硝酸盐和硝酸盐，人畜长期饮用这些物质含量超过一定标准的水，会中毒致病等等。(3)水体富营养化，常导致水生生态系统紊乱，水生生物种类减少，多样性受到破坏。中国科学院南京地理与湖泊研究所的秦伯强在《湖泊富营养化及其生态系统响应》中指出，我国是一个多湖泊的国家，其中约三分之一是淡水湖泊，主要分布在长江中下游地区。这些湖泊中的绝大部分已处于中营养或富营养水平。湖泊富营养化(Eutrophication)是指水体中氮、磷等植物生长所必需的生命元素大量增加，使得水生态系统的生产力(或者是光合作用速率)增加。湖泊富营养化是当前我国湖泊面临的主要生态环境问题之一。湖泊富营养化后会导致一系列的生态系统异常响应。这些响应包括沉水植物消亡、蓝藻水华频发、微生物的生物量与生产力增加，生物多样性下降，营养盐的循环与利用效率加快等。整个湖泊生态3 系统，也会伴随着富营养化的发展，呈现出生物多样性下降、生物群落结构趋于单一、生态系统趋于不稳定的现象。他在《太湖富营养化与蓝藻水华引起的饮用水危机原因与对策》中指出，我国面积1km2以上的湖泊有2759个，总面积达91019km2，其中只有约1/3的湖泊是淡水湖泊，并且绝大部分是富营养化浅水湖泊，主要分布在长江中下游地区和东部沿海地区，太湖就是这众多浅水富营养化湖泊的典型代表。蓝藻水华的爆发是一个水体富营养化的主要特征，能够形成蓝藻水华的藻类包括微囊藻等。但是淡水水体爆发的水华出现过池塘裸藻水华，河流中硅藻水华等。中国环境科学研究院的许秋瑾等起草的《湖库富营养化防治技术政策》中指出，我国湖泊、水库和江河富营养化的发展趋势非常迅速。2008~2010年，我国不同区域主要湖泊的TLI营养状态指数评价结果显示：处于富营养的湖泊数量已占多数，占调查总数的78.7%，其中，处于轻度富营养、中度富营养和重度富营养湖泊数量分别占调查总数的50.7%、21.3%和6.7%；处于中营养的湖泊数量占调查总数的14.6%，且不断向富营养化湖泊转变；处于贫营养状态的湖泊数量只占调查总数的6.7%，主要分布于青藏高原湖区与云贵高原湖区。我国湖泊富营养化形势已非常严峻。湖库水环境问题有别于河流，主要是水体富营养化引发的水华问题，例如“三湖”（太湖、巢湖和滇池）。长期受富营养化和有害蓝藻水华的影响，严重影响饮用水供水安全与生态系统健康。浮游植物的大量生长是水体富营养化的主要现象，其中叶绿素a是所有浮游植物门类都含有的叶绿素类型．不仅作为水体营养状态划分的重要指标，而且可用于表征浮游植物的现存量．因此，叶绿素a在水体富营养状况评价中起关键性作用。2.2相关环保标准和环保工作的需要国际上，经济合作与发展组织（OECD）规定了关于评定湖泊营养状态的叶绿素a划分标准，见表1；我国原地表水环境质量标准（GHZB1-1999）中规定了叶绿素a标准值，但是现行有效的地表水环境质量标准（GB3838-2002）没有叶绿素a的标准值。表1OECD规定的评价湖泊富营养状态的叶绿素a划分标准贫营养中营养富营养重富营养叶绿素a＜3μg/L3～11μg/L11～78μg/L＞78μg/L此次制订的《水质叶绿素a的测定分光光度法》是《国家环境保护标准“十二五”规划》列出的需制定的标准之一。《中国淡水藻类-系统、分类及生态（胡鸿钧）》中指出，水体中4 的藻类植物细胞含有各式各样的色素，但所有的藻类的光合色素系统中都含有叶绿素a，在光合作用中释放出氧气。因此，选择测定叶绿素a将为掌握水体的初级生产力情况和富营养化水平提供基础性数据，对于保护水体环境、保障人民健康，具有重大意义。中国环境科学研究院李子成《中国湖库营养状态现状调查分析》，根据我国2005～2007年我国183个湖泊、541个水库的调查资料，对湖库的营养状态进行了分析，以了解我国湖泊的富营养现状。近年来，随着经济的高速发展，我国湖库氮、磷污染负荷增加，富营养化问题有增无减，已经成为我国湖库面临的重大环境问题。因此制定环境监测的叶绿素a标准势在必行。其选择了最有代表性的项目，包括叶绿素a等的四项指标，作为湖泊（水库）营养状态的评价项目。湖泊、水库营养状态评价分级标准(叶绿素a)见表2。同时中国环境监测总站制定的我国湖泊(水库)富营养化评价方法及分级技术规定中，叶绿素a作为评价指标，对湖泊（水库）营养状态进行分级。表2湖泊、水库营养状态评价分级标准单位：mg/m3营养分级营养状态定性评价叶绿素a贫营养优1.6中营养良好10轻富营养轻度污染26中富营养中度污染64重富营养重度污染1603国内外相关分析方法研究3.1主要国家、地区及国际组织相关分析方法研究3.1.1美国材料与试验协会ASTMD3731-87(2012)《测量地表水中藻类叶绿素含量的规程》ASTMD3731-87(2012)标准方法采用90%丙酮为提取试剂，玻璃纤维滤膜过滤水样，研磨后4℃浸泡提取浮游植物的叶绿素。测定叶绿素的主要步骤如下:（1）过滤：抽滤前加入碳酸镁悬浊液防止色素分解。负压不能超过50kPa。（2）叶绿素的提取：先研磨，将滤膜放置于组织研磨器中，加入4-5ml的90%丙酮溶液，500r/min研磨3min。破碎滤膜上浮游植物藻类细胞。然后浸泡提取：将破碎后的细胞提取液转移至15ml离心管中，用90%丙酮溶液冲洗研磨器及研磨杵一并转入离心管，定容至10ml。混匀后4℃暗处浸泡提取。浸泡时间为15min至24h。过程中要颠倒混匀数次。最后离心澄清：1000g离心20min或过滤，将上清液转移至旋塞玻璃小瓶中。（3）测定方法：分光光度法，三色方程测定664nm、647nm、630nm、750nm吸光度计算叶绿素a、b、c叶绿素含量。单色方程测定脱镁叶绿素a校正后的含量。3.1.2EPA446.0《海水和淡水藻类中叶绿素a、b、c1＋c2的测定可见分光光度法》5 EPA446.0采用90%丙酮为提取试剂，玻璃纤维滤膜过滤水样，研磨后4℃浸泡提取藻类的叶绿素。主要测定步骤如下:（1）抽滤采用玻璃纤维滤膜。将玻璃纤维滤膜放置在连接有真空泵的抽滤器上，负压不超过20Kpa。轻轻搅拌或颠倒混匀样品，准确量取一定体积的水样，缓慢减压，水样完全通过滤膜时结束抽滤。用镊子将滤膜取出，带有样品一面向内对折，用滤纸吸干剩余水分。如不及时提取，应将滤膜放入培养皿中，外面包裹一层铝箔，样品滤膜-20℃暗处冷冻保存。（2）研磨：将滤膜剪成小块放入组织研磨器管底，用大肚移液管加入4ml丙酮（90%），电动研磨500转/分提取1分钟，注意保持避光及低温。将悬浊液转移至15ml带旋帽的离心管中，再用6ml丙酮冲洗研磨棒及玻璃管转移至离心管中。定容至10ml。时间5min。然后冷暗处保存。用清水及丙酮清洗研磨器后再处理下一个样品。最后做一个空白膜。（3）低温浸泡：然后用力震荡离心管，4℃浸泡2～24小时，期间至少震荡2到3次。充分提取。（4）离心：浸泡后提取后，675g离心15分钟。（5）测定方法：分光光度法，于750、664、647、630nm处测定吸光度值，三色方程计算叶绿素a、b、c1＋c2；单色方程测定脱镁叶绿素校正的含量。90%丙酮调零，弱光中倾倒或用移液管将离心上清液转移至玻璃比色皿中，750nm吸光度值应＜0.005AU，否则应再次离心或通过玻璃纤维针式滤器。3.1.3EPA445.0标准的前处理操作同446.0，用荧光计进行测定。3.1.4EPA447.0标准的前处理操作同446.0，提取液离心后，过0.45µm针式滤器过滤，取50~200µl样品进入高效液相色谱进行分析，检测波长为440nm。3.1.5热乙醇分光光度法《ISO10260-1992》、《英国标准协会BSISO10260：1992（2014）》、《日本JISK0400-80-10：2000》。采用热乙醇分光光度法测定叶绿素。主要步骤如下：（1）提取方法：可采用热乙醇水浴法，准确量取20～25ml乙醇（90%），浸泡滤膜，拧紧聚四氟乙烯帽的玻璃小瓶旋塞。轻微震荡悬浮滤膜。将玻璃瓶放入75℃水浴锅中，液面与样品一致。水浴5min，轻微震荡。取出室温冷却15min。滤膜过滤或者离心，取上清液分光光度测定。也可采用热乙醇研磨法：加入75℃热乙醇30～50ml。用棒式研磨器研磨3min。过玻璃纤维滤膜，转移至100ml（或50）容量瓶中，定容。（2）测定方法：将前处理后的上清液转移至比色皿中，并留有足够体积用于酸化待测。90%乙醇调零，测定665nm6 及750nm吸光度值。注意：665nm吸光度值0.01～0.8之间，所以应合适选择过滤水样体积、提取剂体积、比色皿量程。建议开始时选择0.5L水样。用HCL（3mol/L）酸化提取液，用量每10mL加0.01ml。震荡，5～30min后在665nm处测定吸光度。国外相关标准分析方法见表3。比较国外测定叶绿素的方法可知，EPA447.0高效液相色谱法能够很精确的测定各种光合色素的含量，但是仪器昂贵，分析操作步骤繁琐，EPA445.0荧光光度计也能够精确的测定叶绿素a的含量，特别是能够测定叶绿素含量较低的样品，但是分析过程中容易受其他色素或色素衍生物的干扰，因此这两种方法难以作为常规的监测方法，而分光光度法由于操作简单，成为最常用的叶绿素a的测定方法。表3国外相关分析方法对比美国材料与试验协标准名称EPA日本英国标准协会会BSISO10260：ASTMD3731-87JISK0400-80-10：1992（2014）标准号Method446.0(2012)2000ISO10260：1992（E）滤膜玻璃纤维滤膜试剂90%丙酮75℃乙醇研磨后浸泡研磨后浸泡2h～提取方法75℃乙醇研磨或水浴提取-离心15min～24h离心24h离心三色方程664、647、630、750nm叶绿测定方法素和HCl酸化664、665nm脱镁叶绿素665nm、HCl酸化脱镁叶绿素校正校正表4国内相关分析方法对比海洋监测规范（海湖泊富营养化调水和废水监测分标准名称水利行业标准水）查规范（第二版）析方法第四版方法标准号GB17378.7-2007第九章10节-SL88-2012滤膜玻璃纤维滤膜或微玻璃纤维滤膜乙酸纤维滤膜玻璃纤维滤膜7 孔滤膜提取试剂90%丙酮不研磨浸泡14-24h研磨浸泡8-24h-40℃低温冰箱提取方法研磨-离心离心离心冷冻750、664、647、750、663、645、750、664、647、测定方法630nm三色法测定750、665nm测定630nm测定叶绿630nm三色法测叶绿素a、b、c素a定叶绿素a、b、c3.2国内相关分析方法研究3.2.1《水和废水监测分析方法（第四版）》在抽滤器上装好乙酸纤维滤膜，倒入定量体积的水样进行抽滤，抽滤时负压不能超过50kPa。水样过滤后，取出带有浮游植物的滤膜，在冰箱内低温干燥6～8h后放入组织研磨器中，加入少量碳酸镁粉末及2～3ml90%丙酮，充分研磨，提取叶绿素a。用离心机（3000～4000r/min）离心10min。将上清液倒入5ml或10ml容量瓶中。再用2～3ml的90%丙酮，继续研磨提取，离心10min，并将上清液再转入容量瓶中。重复1～2次，用90%的丙酮定容为5ml或10ml，摇匀。1cm比色皿，90%丙酮为参比溶液，750、663、645、630nm处测定吸光度值。3.2.2SL88-2012《叶绿素a的测定分光光度法》水利行业标准测定叶绿素的具体操作步骤如下：（1）抽滤：将玻璃纤维滤膜放置在连接有真空泵的抽滤器上，根据水样中叶绿素的浓度准确量取一定体积的混匀水样进行抽滤，负压不超过20kPa，逐渐减压，在水样刚刚完全通过滤膜时结束抽滤，用镊子小心将滤膜取出，将有样品一面对折，用滤纸吸干剩余水分。如果样品不能及时提取，应将吸干水分的滤膜放入培养皿中，外面包裹一层铝箔，放入﹣20℃冰箱中保存。（2）提取：将过滤后的滤膜放入具塞玻璃离心管中，盖紧塞帽。放入﹣40℃低温冰箱中冷冻20min，取出放置于室温下5min，此过程反复三次。向玻璃离心管中加入10ml90%丙酮溶液，盖紧塞帽剧烈摇振片刻，放置于4℃冰箱中，避光浸泡4～12h备用，在浸泡过程中，应摇动2～3次。（3）离心：将离心管放入离心机，以3500r/min的速度离心15min。（4）将离心后的上清液倒入1cm比色皿中，以90%丙酮做参比，分别在750、664、647、630nm波长处测定吸光度值。3.2.3《湖泊富营养化调查规范》将滤膜剪碎，放入研钵或匀浆器中，加入6~8ml90%丙酮，在500~1000r/min转速下研磨1~3min，滤膜完全磨成糊状后，将匀浆器中的样品倒入离心管中，再用少许90%丙酮冲洗匀8 浆器2~3次，倒入离心管中，盖上管塞，摇动后置于黑暗低温处（冰箱）静置，提取时间不少于8小时和不多于20小时，将离心管放入离心机中，在3000~4000r/min转速下离心10~15分钟，将上清液移入具刻度离心管，再加少量90%丙酮于原抽提用的离心管中，再次悬浮沉淀物并离心，再将上清液合并，此操作应重复1~2次，直至沉淀物不含色素为止，最后将提取后的上清液定容到10ml。测定665nm和750nm处的吸光度，用0.1N盐酸酸化后再测定750和665nm处的吸光度，代入公式计算叶绿素a和脱镁叶绿素a的浓度。国内相关标准分析方法对比见表4。综上所述，比较国内外标准中叶绿素a测定的关键步骤在于：提取试剂、滤膜类型、样品保存方法、是否研磨及研磨后是否需要浸泡、计算方法。国内外方法中的各种实验条件总结如下：（1）提取试剂：除热乙醇方法，国内外标准方法均采用90%丙酮作为提取试剂。EPA446.0指出，90%丙酮溶液可以有效提取大部分藻类细胞中的叶绿素a，而且不产生其它衍生物。丙酮是国际上较为公认的提取叶绿素的试剂。（2）滤膜：除《水和废水监测分析方法（第四版）》采用乙酸纤维滤膜外，均采用玻璃纤维滤膜。（3）样品保存方法：样品的保存条件各种方法略有不同，但水样采集后均保证4℃冷藏保存，样品滤膜可冷冻保存。而且叶绿素a测定样品滤膜冷冻后再研磨，可提高提取效率。暨南大学水生生物研究所的林少君在《浮游植物中叶绿素a提取方法的比较与改进》的研究结果。如采样后不立刻测定，-18℃下冰冻，再于室温条件下融解，利用细胞内冰粒的形成和细胞液浓度的增高引起溶涨，使胞壁结构破碎引起叶绿素溶出。（4）是否研磨及研磨后是否需要浸泡虽然研磨的方法较为费力，但是该方法操作简单，仪器设备要求低，常温操作不会对叶绿素a造成破坏，细胞破碎完全，对叶绿素的提取速度快，效率高，并在环境监测系统广泛应用，考虑到方法的经典性和数据的可沿用性，新的技术路线中关于对叶绿素a的提取步骤沿用《水和废水监测分析方法（第四版）》中的研磨方法，研磨提取叶绿素a，主要通过机械作用破坏藻类的细胞壁和叶绿体使叶绿素a溶解于丙酮，并在此基础上进行改进。目前国内也有很多文献报道了对上述叶绿素a提取方法的改进研究，如延长提取时间。水利部行业标准《叶绿素a的测定分光光度法》（SL88-2012）叶绿素测定的主要操作是低温反复冷冻提取-避光冷藏浸泡-离心，在EPA的446.0的基础上改进了提取方法。考虑到不同地区仪器设备的能力差异，-40℃的超低温冰箱不是所有的环境监测部门均具备的仪器设备，9 所以将样品滤膜的冷冻作为辅助的提取条件。（5）计算公式及波长关于计算方法，主要有三色法和单色法，三色法主要考虑了叶绿素b和叶绿素c对测定的干扰，测定的是表观叶绿素a的含量（包括叶绿素a与脱镁叶绿素a之和），单色法考虑脱镁叶绿素a的干扰.从方法的简便性来说，三色法操作简单，产生误差几率小，耗时比单色法短；目前《水和废水监测分析方法（第四版）》中测定叶绿素a的方法在地表水环境监测中应用最为广泛，该方法采用丙酮研磨提取叶绿素a，用三色法计算叶绿素a的浓度。考虑到与历史数据的比较与衔接，参考《水和废水监测分析方法（第四版）》中测定叶绿素a的方法，对提取过程进行细化，并明确质量保证和质量控制要求，提高样品测定的准确性和精密性。4标准制订的基本原则和技术路线4.1标准制修订的基本原则本标准制订依据《国家环境保护标准制修订工作管理办法》和《环境监测分析方法标准制订技术导则》的要求，以国内外相关标准为基础编制。(1)标准方法应满足相关环保标准和环保工作的要求：经济合作与发展组织（OECD）规定了关于评定湖泊营养状态的叶绿素a划分标准范围，现行有效的地表水环境质量标准（GB3838-2002）没有叶绿素a的标准值。本标准叶绿素a的测定方法应满足地表水样品的分析要求。(2)方法准确可靠，满足各项方法特性指标的要求，检出限应能够满足相关环境监测工作的需要。对环境水质监测的湖泊、水库、河流、池塘的地表水样品进行精密度和准确度的测定，结果良好。(3)方法应具有普遍适用性，易于推广使用：本标准方法采用丙酮研磨分光光度法测定水质叶绿素a。实验主要仪器设备有分光光度计、离心机；适应我国大部分环境监测及相关实验室仪器设备、技术能力的要求。4.2标准制修订的技术路线4.2.1分析测试技术方案本标准采用分光光度法测定水质叶绿素a。参考《水和废水监测分析方法第四版》方法中丙酮研磨提取水中的叶绿素a，通过研究国内外叶绿素a测定的实验条件，优化测定叶绿素a的方法标准。由于叶绿素光照易分解，采样后应低温（0～4℃）避光保存，低温运输。采10 样后24h内用滤膜过滤水样；水样中立刻加入碳酸镁悬浊液防止酸化引起色素溶解；使用90%丙酮溶液作为提取剂，通过研磨可以有效提取大部分藻类中的叶绿素a；采用玻璃纤维滤膜过滤水样，膜呈化学惰性，不含粘合剂，吸水膨胀，但不发生溶解；藻类细胞的破碎比较完全；研磨后浸泡提取，可以提高叶绿素a的提取效率；提取液离心后过0.45μm有机相针式滤器；测定其吸光度值。综上所述，本标准选用分光光度法测定水质叶绿素a的含量，将水样用玻璃纤维滤膜过滤，以90%丙酮为提取液，研磨提取地表水中的叶绿素a，研磨后浸泡、离心后测定其750nm、664nm、647nm、630nm波长下的吸光度值。计算叶绿素a的含量。4.2.2技术方案前景分析目前国内环境监测工作中对水质叶绿素a的测定，通常采用分光光度法进行分析。从样品的过滤、样品滤膜的研磨、离心、吸光度值的测定的仪器配备方面，基本是非常普遍进行配置的。因此本标准在目前国内环境监测工作中的推广和应用，是完全可以普遍适用的。4.2.3技术路线图标准编制组通过比较美国材料与试验协会、美国环境保护局、日本、国际标准化组织、英国标准协会、水利部行标等标准中测定叶绿素a的方法，优化《水和废水监测分析方法第四版》主要操作步骤及实验条件。对于水质叶绿素a测定的分光光度法的关键步骤如提取试剂、滤膜类型、样品保存方法、研磨后浸泡时间、计算方法及实验室质量控制等进行研究。最终确定标准内容。本标准制订的技术路线，见图1。11 任务下达成立标准编制组资料收集及调研（包括国内外标准ISOEPAASTMJIS水利部等）确定实验方案及开展研究滤膜的选择、样品保存条件过滤、研磨、提取条件计算公式及波长的确定实验室质量控制根据研究结果确定实验室内的检出限、测定下限、精密度等确定标准内容方法验证：检出限、精密度、准确度编制标准方法文本和编制说明（征求意见稿、征求意见并汇总处理、送审稿、技术审查及完成报批稿）图1本标准制订的技术路线图5方法研究报告5.1方法研究的目标（1）明确方法的适用范围。本方法的适用范围借鉴《水和废水监测分析方法（第四版）》：适用于江河、水库、湖泊、池塘水中叶绿素a的测定，江河、水库、湖泊、池塘水均属于地表水，因此将方法的适用范围定为地表水。（2）参照《水和废水监测分析方法（第四版）》编写标准文本。（3）通过实验和验证确定方法的可行性和适用性。现行有效的地表水环境质量标准12 （GB3838-2002）没有叶绿素a的标准值。叶绿素a作为湖泊(水库)富营养化评价指标，通过本标准的制订，使监测方法的检出限、测定下限、精密度、准确度等满足相关评价方法及规范中贫营养、中营养、富营养水体对叶绿素a测定的要求。方法拟达到的特性指标要求：检出限预期达到2.5μg/L，相对标准偏差小于20%、加标回收率70%~110%。5.2方法原理将一定量水样用玻璃纤维滤膜过滤，以90%丙酮为提取液研磨提取水中浮游植物的叶绿素，离心后测定其750nm、664nm、647nm、630nm波长下的吸光度值，计算叶绿素a的含量。5.3试剂和材料（1）90%丙酮溶液表5国内外方法中提取试剂序号标准方法提取试剂试剂纯度1ASTMD3731−87(2012)90%丙酮溶液分析纯2EPA（446.0）90%丙酮溶液HPLC（色谱纯）3水利行业标准（SL88-2012）90%丙酮溶液分析纯4海洋监测规范GB17378.7-200790%丙酮溶液分析纯5湖泊富营养化调查规范（第二版）90%丙酮溶液-6日本JISK0400-80-10：200090%热乙醇溶液纯度99.5%以上7英国标准协会BSISO10260：199290%热乙醇溶液分析纯8ISO10260：199290%热乙醇溶液分析纯9水和废水监测分析方法第四版90%丙酮溶液分析纯国内外标准中，除热乙醇方法外，90%的丙酮溶液是提取水中浮游植物叶绿素a的试剂。其中EPA446.0指出：使用90%丙酮溶液作为提取剂，可以有效提取大部分藻类中的叶绿素a，所以本标准采用90%丙酮溶液，实验室常用的丙酮试剂级别为分析纯，为验证分析纯丙酮能否满足实验要求，进行了空白样品测定，结果表明分析纯丙酮可以满足实验要求，750nm小于0.005。丙酮溶液：φ（CH3COCH3）=90%，取900ml丙酮，加100ml去离子水。ASTM标准方法规定为防止吸收峰漂移，对于丙酮提取液的配制要严格遵守90份丙酮比10份水（体积比）的配比。（2）碳酸镁粉末碳酸镁的作用是作为pH缓冲液，防止叶绿素a分子酸化失去镁原子转变成脱镁叶绿素a。ASTMD3731-87(2012)中要求采样后，每升水样中立刻加入1ml碳酸镁悬浊液，且避13 光，防止酸化引起色素溶解。实验室常用的碳酸镁试剂级别为分析纯，为验证分析纯碳酸镁能否满足实验要求，进行了空白样品测定，结果表明分析纯碳酸镁可以满足实验要求。碳酸镁悬浊液：ω=1%，称取1.0g碳酸镁粉末，加入100ml去离子水，搅拌成悬浊液。使用前混匀。碳酸镁悬浊液可防止酸化引起色素溶解。研磨过程中碳酸镁加入量不宜过多，称重约为0.01-0.02g左右。否则碳酸镁悬浊液会影响比色测定时的吸光度值。而且较难通过0.45μm针式滤器。（3）玻璃纤维滤膜或乙酸纤维滤膜国内外标准方法中过滤水样的滤膜类型见表6。国外标准方法中推荐使用玻璃纤维滤膜，《水和废水监测分析方法（第四版）》采用的是乙酸纤维滤膜。为确定本方法滤膜类型，研究不同类型滤膜对叶绿素a测定结果的影响。首先比较不同滤膜90%丙酮提取的吸光度。具体方法如下：将乙酸纤维滤膜和玻璃纤维滤膜放入研钵中，加入90%丙酮。每组实验设3个平行。与样品按相同步骤操作，90%丙酮作为参比溶液，测定630nm、647nm、664nm、750nm处的吸光值，比较3种滤膜90%丙酮吸光度。结果表明乙酸纤维滤膜和玻璃纤维滤膜在750nm处吸光度均小于0.005，见表7。再研究玻璃纤维滤膜和乙酸纤维滤膜对水样叶绿素a测定结果的影响。国外标准方法中推荐使用WhatmanGF/F滤膜。优点是玻璃纤维膜呈化学惰性，不含粘合剂，吸水膨胀，但不发生溶解。缺点是：价格较高，750元/100片。乙酸纤维滤膜部分溶于丙酮，遇丙酮融化成糊状，糊状的滤膜不容易完全转移，且不容易判断研磨是否充分。虽然研磨玻璃纤维滤膜时需要的机械力比较大，但对于藻类细胞的破碎比较完全。测定结果表明（见表8）玻璃纤维滤膜对叶绿素的提取效率较好。所以本方法采用玻璃纤维滤膜进行样品的过滤。考虑到WhatmanGF/F滤膜需要进口，在环境监测领域大规模使用有困难。因此选用0.7μm进口和国产的玻璃纤维滤膜，比较国产玻璃纤维滤膜和进口玻璃纤维滤膜测定康平县卧龙湖（辽宁省第一大平原淡水湖）水样。通过比较实验，国产滤膜和进口滤膜测定湖泊样品中叶绿素a结果无显著性差异，均可满足实验要求。（见表9）显微镜下观察抽滤液，没有藻类细胞即可。绝大多数蓝藻、绿藻、硅藻等藻类大小均大于1μm。每个实验室可根据实际情况，选择合适的滤膜进行水样的过滤。必要时，镜检样品滤液。表6国内外方法标准中使用的滤膜序号标准方法滤膜要求1ASTMD3731−87(2012)玻璃纤维滤膜2EPA（446.0）玻璃纤维滤膜孔径0.7μm，WhatmanGF/F3水利行业标准（SL88-2012）玻璃纤维滤膜：直径为47mm、孔径为0.7μm14 玻璃纤维滤膜：直径为47mm、WhatmanGF/C4海洋监测规范GB17378.7-2007或孔径为0.45μm的纤维素酯微孔滤膜玻璃纤维滤膜：直径为47mmWhatman5湖泊富营养化调查规范（第二版）GF/C1.2μm、或上海红光造纸厂“7.9”6日本JISK0400-80-10：2000玻璃纤维滤膜（无粘合剂）：直径20-50mm，7英国标准协会BSISO10260：1992可以过滤99%的直径大于1μm的颗粒。8ISOBSISO10260：19929水和废水监测分析方法第四版0.45μm乙酸纤维滤膜表7乙酸纤维滤膜和玻璃纤维滤膜对90%丙酮吸光度吸光度（3次测定平均值）方法滤膜种类750nm664nm647nm630nm乙酸纤维滤膜0.0010.0020.0010.00190%丙酮玻璃纤维滤膜WhatmanGF/F0.0000.0010.0010.000研磨法国产玻璃纤维滤膜0.0010.0020.0010.000表8玻璃纤维滤膜和乙酸纤维滤膜过滤水样叶绿素a测定结果序号玻璃纤维滤膜乙酸纤维滤膜119.416.5219.518.8319.516.0419.416.1519.417.2620.615.4平均值19.616.7标准偏差0.51.2相对标准偏差%2.47.2表9国产玻璃纤维滤膜和进口玻璃纤维滤膜测定结果比较序号国产玻璃纤维滤膜进口玻璃纤维滤膜15 156.752.4255.654.7358.456.7457.854.7555.151.1652.853.5平均值56.153.9标准偏差2.02.0相对标准偏差%3.63.6（1）F检验H0：221=2双侧检验X1=56.1，X2=53.9，F=S22max/Smin=1.07=0.05，查F0.05（5,5）=5.05F