荧光分光光度法测定药液维生素B2的含量

'荧光光度分析法1 一、基本原理在紫外光或波长较短的可见光照射后，一些物质会发射出比入射光波长更长的光--------荧光。以测量荧光的强度和波长为基础的分析方法叫做荧光光度分析法。1.荧光的定义2 假设分子在吸收辐射后被激发到S2以上的某个电子激发单重态的不同振动能级上，处于较高振动能级上的分子，很快地（约10-12~10-14s）发生振动松驰，将多余的振动能量传递给介质而降落到该电子的最低振动能级（V=0），后经由内转化及振动松驰而降落到S1电子态的最低振动能级，处于S1电子态的激发分子，其分子内的去活化作用有如下三种途径：2.分子产生荧光的机理3 （1）发生S1→S0的辐射跃迁而伴随荧光现象；（2）发生S1→S0的内转化过程；（3）发生S1→T1的体系间窜跃。而处于T1态的最低振动能级的激发分子，则可能发生T1→S0的辐射跃迁而伴随磷光现象，也可能发生T1→S0的体系间窜跃。4 v=0iscT1v=0v=02112231VRVRVRiscv=0S1S2S012PicFA1A2ic分子内的光物理过程A1、A2.吸收F.荧光P.磷光ic.内转化isc.体系间窜跃VR.振动松弛5 6 式中K为常数。因此，在低浓度的情况下，荧光物质的荧光强度与浓度呈线性关系。3.荧光强度与浓度的关系对同一物质而言，若abc<<1（＜0.05或0.03），即对很稀的溶液，荧光强度F与该物质的浓度c有以下的关系：F=2.303ФfI0a•b•c式中：Фf－荧光过程的量子效率；I0－入射光强度；a－荧光分子的吸收系数；b－试液的吸收光程。I0和b不变时：F=K•C7 图A为一极稀的溶液，在入射光I0照射下所发生的荧光均匀地分布在液池中；图B为较浓的溶液，入射光被液池前部的荧光体剧烈吸收后而发生较强的荧光，但在液池中、后部分的荧光体，则因入射光强度大大减弱而使所产生的荧光强度大大下降。因而在检测器窗口所探测到的荧光强度反而更低。4.偏离线性关系的原因⑴内滤效应8 I0ItF图AItI0F图B内滤效应示意图返回9 在浓度较高的溶液中，可能发生溶质与溶质间的相互作用，产生荧光物质的激发态分子与其基态分子的复合物或荧光物质的激发态分子与其它溶质基态分子的复合物，从而导致荧光强度的下降。在浓度更大时，甚至可能产生荧光物质基态分子的聚集体，导致荧光强度更严重的下降。⑵激发态分子与基态分子或其它溶质分子形成复合物，甚至产生荧光物质基态分子的聚集体10 假如荧光物质的吸收光谱与它的荧光光谱呈现重叠，便可能发生所发射的荧光被部分再吸收的现象，从而造成荧光强度下降。在这种情况下，浓度增大时会促使再吸收现象的加剧。⑶由于再吸收（自吸）现象11 二、VarianCaryEclipse荧光分光光度计的特点由于荧光物质的荧光强度与激发光源的强度成正比，Eclipse采用了无须预热、耗能12W但脉冲输出能量却高达75KW的闪烁氙（Xe）灯，并利用电子技术控制,使其仅在发出测量指令后才闪烁。这一设计给荧光分析者带来极大的方便.1.硬件及硬件的主要特点⑴高能闪烁光源-----氙灯12 ①可以开着样品室测量由于室内光线的强度不足激发光源的千分之一，不会对测量造成干扰，因此省去了反复开盖、关盖的繁琐。这一特点尤其方便在反应动力学测量过程中往液池内添加反应试剂。②有效避免光敏物质的降解传统的连续Xe灯光源开机后一直处于发射状态，许多荧光物质在其长时间的照射下会发生降解，引起测量误差。而Eclipse通过自定义闪烁次数或闪烁时间，既保证了足够的激发，以避免了光降解作用。③大大延长了Xe灯光源的使用寿命Xe灯可连续工作20,000小时，远长于普通连续Xe灯的500~2,000小时，基本上终生不用更换光源。13 由于荧光分析测量的是分子的绝对发光强度，背景荧光和散射光的干扰越低，灵敏度就越高。Eclipse为有效克服这些干扰，在其激发和发射单色器上都配置了多波长范围的滤光片，一旦选定测量波长，软件可自动调用合适的滤光片。⑵可自动调用的多波长范围滤光片（标准配置）14 一支用于样品信号的测量，一支用于参比信号。这种红敏的光电倍增管在紫外至红外1100nm的波长范围内都具有良好的灵敏度，同时还可以通过软件调整光电倍增管检测电压（强荧光测量用低电压，弱荧光用高电压），在保证合理灵敏度的同时，最大限度地延长其使用寿命，与长寿命光源相匹配，共同确保Eclipse的整机使用寿命。⑶两支R928型光电倍增管（标准配置）15 减少了测量所需的样品体积（标准10mm液池仅需0.5mL样品）。同等条件下，由于检测到的样品体积比垂直狭缝大得多，因此，Eclipse的灵敏度比传统垂直狭缝设计高出5~30倍。⑷水平狭缝16 仪器内部结构示意图17 仪器光路示意图闪烁Xe灯狭缝反光镜光栅激发单色器发射单色器滤光片反光镜棱镜光电倍增管（参比信号）液池光电倍增管（样品信号）参比检测器18 在指定所用溶剂后，Eclipse的预扫描功能可自动识别出该溶剂的拉曼、瑞利以及二级散射峰，并在扫描结束后自动给出最佳的激发/发射波长，方便初学者确定多吸收/发射带化合物的荧光测量参数。除激发、发射和同步扫描外，Eclipse还具备固定波长间隔（0.15－30nm）和三维谱图的扫描功能，以获取最佳的分辨率和最丰富的光谱信息，并具备对扫描结果进行加、减、1-4阶导数等的运算功能。尤其方便的是扫描结果可以加上图注后直接插入到Word文件中，方便文章发表。2.软件应用上的主要功能⑴扫描19 操作者仅需准备标准溶液和样品，数据的读取、工作曲线、回归方程、相关系数等的运算都由Eclipse自动完成，并生成标准报告。⑵浓度测量⑶动力学测量80点/秒的数据采集速度满足快反应的测量要求，对于慢反应，数据采集时间长达20000分钟，并可针对反应速度的不同区段，程序设定数据采集间隔。20 用户可根据所遵守规范的要求随时对诸如杂散光水平、波长准确性、灵敏度等多达17项性能指标进行检验，随时了解仪器的状态。⑷仪器性能认证21 三、VarianCaryEclipse荧光分光光度计使用方法1.扫描测量2.浓度测量3.动力学测量4.仪器性能认证22 THEEND荧光光度分析法介绍到此结束，接下来介绍荧光分光光度法测定VB2含量23 一、VarianCaryEclipse荧光分光光度计测定物质浓度的一般步骤（标准曲线法）：1、仪器参数设定2、制作工作曲线3、测定待测液浓度荧光分光光度法测定VB2含量24 二、本实验的一些要求1、本实验4人1组，每组配制1套标准溶液和1个待测液。2、玻璃仪器清洗洁净。3、准确使用吸量管、正确使用石英比色皿。4、用坐标纸认真绘制工作（标准）曲线。计算工作曲线的斜率、截距，确定回归方程。5、计算待测液浓度及药片中维生素B2含量，每人单独完成实验报告。25 26 浓度测定1、如何进行校准和浓度测定按以下步骤，调整仪器，以便获取数据第1步：点击视图中的开始(Stare)按扭，指向程序(Program)→CaryEclipse，然后选择扫描(Scan)即显示扫描功能框。第2步：点击设置(Setup)，进入设置(Setup)对话框，指定检测方法的参数27 28 第3步：（从对话框中，点击Cary，进入Cary页面）a.在数据模式(Datamode)中，点击荧光(Fluorescence)模式b.在激发光波长(EX.Wavelength)中，设定所需的激发单色器的波长c.在发射光波长(EM.Wavelength)中，设定发射单色器的波长d.设定激发单色器的狭缝宽度（注：通常，在发射单色器的狭缝宽度固定时，激发荧光强度随着激发单色器的狭缝宽度的增大而增强。）e.设定发射单色器的狭缝宽度（注：通常，在激发单色器的狭缝宽度固定时，发射单色器的狭缝宽度每增加两成，发射荧光强度将增加四成。反之亦然。）f.在平均时间(AveTime)中，输入所需值。建议设定为0.1秒。29 30 第4步：(从对话框中，a.点击选项(Options)，进入选项(Options)页面b.输入坐标轴的最小和最大荧光强度值Y值。c.设定激发滤光片(Excitationfilter)，建议设定为自动(Auto)模式（默认模式）。系统将依据所选择的激发光波长，把滤光片的轮子自动地移动到合适的位置。d.设定激发滤光片和发射滤光片(Emissionfilter)，为了减少设定次数，建议发射滤光片设定为打开(Open)模式。e.设定EHT或样品检测器的光电倍增管。设定值取决于样品激发荧光的强弱，例如，对强激发的样品，建议设定为较低(Low)值；而对弱激发的样品，建议设定为较高(High)值。31 32 第5步：点击附件(accessories)，确保所有附件选项未被选定。第6步：a.点击标准(Standards)，进入标准(Standards)页,设定与数据采集有关的标准参数。b.设定合适的单位(Units)。c.在标准(Standards)栏中，输入标准样的数目。d.然后在浓度(Conc)栏中，输入每一个标准样的浓度。e.选择校准所需的曲线类型(FitType)f.在Min（最低）R2中输入所需的R2值或相关系数。该值越接近1.0000越好，经典值为0.950033 34 第7步：a.点击样品(Samples)，进入样品(Samples)页b.在样品数目(No.ofSamples)栏中，输入样品数目。c.在样品名称(Samplenames)中，输入每一个样品名称（输入字符≤20个）。d.若样品编号不同而名称相同，在输入第一个样品名后，点击增添按钮即可。35 36 第8步：a.点击重量/体积修正b.在方法重量(MethodWeight)中，输入样品的假定重量，这一重量为该方法所需使用的样品重量（每一样品的实际重量(ActualWeight)，在样品名称(SampleNames)列表中输入）。c.在重量单位(Weightunits)中输入单位。d.在方法体积(MethodVolume)中，输入样品的假定体积，这一体积为该方法所需使用的样品体积（每一样品的实际体积(ActualVolume)，在样品名称(SampleNames)列表中输入）。e.在体积单位(Volumeunits)中输入单位。f.在样品名称(SampleNames)表中，输入每一样品的实际重量(ActualWeight)和实际体积(ActualVolume)。37 38 第9步：a.点击报告(Reports)表，显示报告(Reports)页，确定检测报告的细目b.在姓名(Name)中输入你的姓名c.在注释(Comment)栏中输入对实验的注释d,在选项(Options)组中，通过选择合适的checkbox框，设立报告类型例如选择自动打印(Autoprint)，系统将自动打印结果报告。选择参数(Parameters)框，报告将列出实验参数。选择图形(Graph)框，校准曲线将打印在报告中39 40 第10步：a.点击自动保存(Autostore)，进入自动保存(Autostore)页b.当保存选项设立为关(Off)时，所采集的数据和报告将不会自动保存，可以在采集结束时手动保存第11步：在设置页面中，点击状态显示(StatusDisplay)框，显示当前的有关信息第12步：一旦你确认所做的改变能满足方法要求时，选择OK，并清除设置(Setup)对话框41 42 第11步：在设置页面中，点击状态显示(StatusDisplay)框，显示当前的有关信息第12步：一旦你确认所做的改变能满足方法要求时，选择OK，并清除设置(Setup)对话框仪器调零(Zerotheinstrument)第13步：a.从浓度测定视图中，点击调零(Zero)按钮将系统调零；或者从命令(Commands)菜单中点击调零(Zero)命令，进入调零(Zero)对话框，点击调零按钮将系统调零。b.将空白样放入样品池中，并选择OK。43 44 第14步a.点击开始(Start)按钮或从命令菜单中点击开始(Start)，将显示标准/样品选择(Standards/SampleSelection)对话框。b.选择用于分析中的标准和样品（缺省时，将选择所有的标准和样品。）c.选择OK，以清除标准/样品选择(Standards/SampleSelection)对话框。d.系统将会立即显示当前标准（PresentStandard）对话框，将合适的标准放入样品池中，按下OK按钮进行标样的测定。e.重复第14步d，直至测完所有的标样，TheCaryEclipse将会计算校正方程和相关系数。注：如果设置的相关系数值（比实际所得值高），CaryEclipse将迅速告知你“最小相关系数值试验失败”45 46 测定样品浓度(Measuresampleconcentration)第15步a.一旦测完所有标样，系统将立即显示当前样品（PresentSample）对话框。将样品放入样品池中，点击OK按钮进行样品浓度的测定。b.重复第15步,直至测完所有的样品保存数据(Saveyourdata)第16步：a.一旦操作完毕，从文件(File)菜单中，点击保存为(SaveAs)b.在文件名(Filename)中输入相应的文件名c.点击保存(Save),系统将以批文件的形式保存47 请爱护公共仪器和设备！请节约每一滴水！请保护环境！谢谢合作！48'