紫外可见分光光度法经典案例

'拼搏进取 第十八章紫外—可见吸光光度法教学要求：1、了解紫外—课件吸光光度法特点。2、掌握光的吸收定律及适用范围。3、掌握紫外—可见吸光光度法的分析方法。4、了解显色反应及其条件的选择。5、了解紫外—可见吸光光度法仪器测量的误差及测量条件的选择。6、了解紫外—可见分光光度法在生物学中的应用。7、了解分子荧光分析法。 第十八章紫外—可见吸光光度法18—1概述 一、吸光光度法1、定义：基于物质对光的选择性吸收而建立起来的分析方法。它包括比色法，可见分光光度法及紫外分光光度法。2、特点：（1）灵敏度高：10-5~10-6，10-7~10-8，10-10mol·L-1，（2）准确度高：比色分析，相对误差5~10%，分光光度法，2~5%，1~2%；（3）应用广泛：可测定几乎所有无机物和许多有机物；（4）操作简便仪器设备易普及。 二、光的基本性质1、光是什么：光是一种电磁波，具有波粒二像性。λν=c，E=hν=hc/λ。单色光，复合光 三、物质对光的选择性吸收1、吸收光谱的产生：原子吸收光谱：原子外层电子选择性吸⑴吸收光谱收某些波长电磁波，线光谱分子吸收光谱：带光谱⑵分子振动能级：分子内部价电子运动，分子内原子振动和分子饶其重心的转动。⑶分子能量：E=Ee+Ev+Er⑷分子吸收光谱产生：分子吸收外界能量（光、电、热）引起分子能级跃迁，从基态跃迁到激发态ΔE=E1－E2=hν==hc/λ电子跃迁能级较大，能量在1~20eV,紫外可见吸收光谱在200~780nm ⑸物质的颜色：由于不同的物质结构不同具有不同量子化能级，产生的吸收不同。其颜色和光的吸收、透过、反射有关。 ①互补色光：把两种适当颜色的光按一定的强度比例混合，成为白光，称为互补色光。②无色：对光谱中各种色光透过程度相同。③有色：物质的颜色由它透过或反射的光决定。④黑色:几乎吸收所有的入射光。⑤白色:几乎全部反射入射光。 3、吸收曲线：测量某种物质对不同波长单色光的吸收程度，以波长为横坐标，吸光度为纵坐标，得到的一条吸收光谱曲线。（1）用途：①进行定性分析；②进行定量分析；③选择吸收波长；④判断干扰情况。 1、透光率T与吸光度A一束平行单色光照射溶液时，光的一部分被吸收，一部分透过溶液，一部分被器皿的表面反射。Io=I+Ia+Ir若入射光强度为Io，吸收光的强度为Ia，透过光强度为I，反射光的强度为Ir，它们的关系是Io=I+Ia在吸光光度法中，测定时都是采用同样材质的比色皿，反射光的强度基本上是不变的，约占4％，其影响可以相互抵消，上式可简化为： 透过光强度I与入射光强度Io之比称为透光度或透光率。用T表示：从上式可以看出：溶液的透光度越大，说明对光的吸收越小，浓度低；相反，透光度越小，溶液对光的吸收越大，浓度高。 18-2光的吸收定律一、朗白-比尔定律1、朗白定律（Lambert’sLaw）：1729Bougure,1760Lambert通过实验发现电磁能被物质吸收时，透过能量呈指数减少。假定一辐射能通过光路后被吸收25%，再通过下一个光路时被吸收0.75×25%，剩56.25%，依次类推，在无限大的光路中将吸收全部辐射能写成指数形式T=I/I0=10-kbT称为透光率lgT=lgI/I0=-kbLambert’sLaw 2、比尔定律(Beer’sLaw):1852BeerandBermard发现类似定律，T和吸光物质的浓度有关：T=I/I0=10-k’clgT=lgI/I0=-kcBeer’sLaw3、朗白比尔定律：合并上述两个定律为比尔定律T=I/I0=10–abca是k和k’合并常数lgT=lgI/I0=-abcA=-lgT=lg1/T=lgI0/I=abc,a是吸光系数A是吸光度，大小取决于波长和吸光物质的性质如果c以摩尔浓度表示A=κbc，κ单位L·mol-1·cm-1，表示物质的量浓度为1mol·L-1，液层厚度为1cm时溶液的吸光度。 4、κ的含义（也可用ε表示）（１）κ是吸光物质在一定波长和物质中的特征常数，反映该吸光物质的灵敏度．κ值越大，表示该吸光物质对此波长光的吸收能力越强，显色反应越灵敏，在最大吸收波长处的摩尔吸光系数常以κmax表示；（２）根据朗伯－比耳定律，κ＝A/bc由实验结果计算，以总浓度代替吸光物质的浓度，κ为表观摩尔吸收系数，κ=Ma,M是摩尔质量；（３）桑德尔（Sandell）灵敏度S仪器检测限为A=0.001时，单位截面积(cm2)光程内所含吸光物质的最低含量，其单位是μg·cm-2,S=M/κ 吸光度A：若光全部透过溶液，Io=I，A=0。若全部被吸收，I=0，A=∞。吸光度A是用来衡量溶液中吸光物质对单色光λ的吸收程度，A值越大，其吸收程度越大；反之亦然。 5、A和T的关系:透光率T=I/I0A=-lgT=lg1/T=lgI0/I=abcA=-lgT=lg1/T=lgI0/I=εbc百分透光率T%=I/I0×100%A=2.00－lgT% 6、例题铁（Ⅱ）浓度为5.0×10-4g·L-1的溶液，与1，10-邻二氮菲反应，生成橙红色络合物。该络合物在波长508nm，比色皿厚度为2cm时，测得A=0.19。计算1，10-邻二氮菲铁的a及κ。需要知两个公式A=abc以及κ=Ma,解：先求a，再求κ已知M(Fe)=55.85a=A/bc=0.19/2×5.0×10-4=190L·g-1·cm-1κ=Ma=55.85×190=1.1×104L·mol-1·cm-1 二.偏离比尔定律的原因1、非单色光引起的偏离严格地说，比尔定律只适用于单色光。溶液a和b，ca＞cb，入射光为λ2~λ3一段复合光，简化为λ1λ2的复合光。从图，表看出：吸光度产生负误差，浓度越高，误差越大。结论：用单色光纯度高仪器；选最大吸收波长测定；用适当低的浓度测定。 图9-8复合光对比尔定律的影响2、介质不均匀引起的偏离：胶体、乳浊液或悬浮物质液吸收、散射；3、由于溶液本身的化学反应引起的偏离：物质的解离、缔合、形成化合物或互异构；HAH++A-Cr2O72-+H2O2H++2CrO42- 18-3目视比色法及光度计的基本部件一、目视比色法1、定义：用眼睛比较溶液颜色深浅以测定物质含量的方法。2、测定方法：标准系列法。3、优点：设备简单，操作方便，不要求严格遵守比尔定律。4、用途:用在要求不高的常规分析中。5、缺点：准确度不高，标准系列制作麻烦，容易受干扰。 二、分光光度法及光度计1、分光光度法：使用分光光度计进行测定的方法。2、与比色法比较：（1）是用仪器代替人眼进行测量，消除了人的主观误差，提高了准确度；（2）待测溶液中有其它有色物质共存时，可以选择适当的单色光和参比溶液来消除干扰，因而提高选择性；（3）在分析大批试样时，使用标准曲线法可以简化手续，加快分析速度。 1、光源：应有足够的发射强度而且稳定，如钨丝灯、氘灯等。2、单色器：采用棱镜或光栅获得单色光。3、吸收池：比色皿，厚度有0.5、1、2、3cm等。4、检测器：光电池或光电管。光源单色器检测系统吸收池 Agilent6010紫外/可见分光光度计分光光度计 热电Unicam 3、光度计组成： 3、光度计组成：光源—单色器—吸收池—检测系统(1)光源：要求稳定，强度高，常用6~12V钨丝灯或卤钨灯，2600~2870K,发320nm~2500nm的连续光谱，可见光部分用其360~800nm;(2)单色器：将光源发出的连续光谱分解为单色光的装置，分为棱镜和光栅两种；光栅的分辨率比棱镜大，可用的波长范围也较宽。 （3）比色皿：也称吸收池，长方体，两面透明，有玻璃和石英玻璃两种，规格有0.5，1.0，2.0，5.0cm等；（4）检测器：检测器的作用是接受从吸收池发出的透射光并转换成电信号进行测量。分为光电池、光电管、光电倍增管和光电二极管阵列。显示装置：检流计，数显，记录仪，CRT。 练习题1、人眼能感觉到的光称为可见光，其波长范围是A。400~780nmB。200~320nmC。200~780nmD。200~1000nm答案：A2、符合比尔定律的一有色溶液，当其浓度增大时，最大吸收波长和吸光度分别是A。不变，增加B。不变，减少C。增加，不变D。减少，不变答案：A 3、下列表述不正确的是A。吸收光谱曲线，表明了吸光度随波长的变化关系B。吸收光谱曲线中,最大吸收处的波长为最大吸收波长C。吸收光谱曲线，以波长为纵坐标,以吸光度为横坐标D。吸收光谱曲线，表明了吸光物质的吸收特性答案：C4、影响有色物质摩尔吸收系数的因素是A。吸收池厚度B。入射光波长C。有色物质溶液的浓度D。入射光的强度答案：B 5、某有色物质溶液，遵守比尔定律，当其浓度为c时，用1.00cm比色皿测得其透光度为T，，当浓度减小为0.50c时，，在同样条件下测定，其透光率应为A。T2B。2TC。T1/2D。T/2答案：clg1/T=εbc6、紫外可见分光光度计在可见区测量时所用光源是A。氢灯B。钨灯C。空心阴极灯D。红外灯答案：B7、在光度计的检流计上刻有A和T，二者关系为8、某有色物质溶液，遵守比尔定律，当其浓度为c时，吸光度A=0.30，那么当浓度为2c时，该溶液的吸光度A=。A=-lgT=lg1/T。0.60 上课了！大家安静！ 18-4显色反应及显色条件的选择显色反应：将待测组分转变为有色化合物的反应。显色剂：与待测组分形成有色化合物的试剂。一、显色反应的选择：1、显色反应的类型：配位反应和氧化还原反应。2、对显色反应的要求：⑴灵敏度足够高:κ＞105超高灵敏，κ=(6~10)104高灵敏,κ=(2~6)104中等，κ＜2×104不灵敏⑵显色剂在测定波长处无明显吸收，试剂空白小。对比度：两有色物质最大吸收波长之差Δλ=|λMAXMR-λMAXR|≥60nm⑶有色化合物组成及化学性质稳定以及选择性好干扰小。 二、显色条件的选择1、显色剂的用量：M+RMR待测组分显色剂有色配合物2、溶液的酸度：M+HRMR+H+⑴影响显色剂浓度和颜色；⑵影响Mn+的存在状态;⑶影响配合物的组成。显然，增大酸度对显色反应不利。 3、显色温度的选择：一般在室温，有时需加热，通过实验确定 4、显色反应时间：制作吸光度-时间曲线5、溶剂：降低有色化合物离解度，增加灵敏度如在Fe(SCN)3的溶液中加入与水混溶的有机试剂（如丙酮），由于降低了Fe(SCN)3的解离度而使颜色加深，提高了测定灵敏度。6、干扰及其消除：（1）控制溶液酸度；（2）加入络合掩蔽剂或氧化还原掩蔽剂；（3）利用氧化还原反应改变离子的状态；（4）选择适当的波长，要求吸收大，干扰小；（5）选择合适的参比溶液；（6）采用适当的预先分离的方法。 三、显色剂1、无机显色剂：应用不多，因其生成络合物不稳定，灵敏度选择性也不高。目前有使用价值的主要有；硫氰酸盐：测定Fe3+、Mo(Ⅵ)、W(Ⅴ)、Nb5+等。钼酸铵：测定P、Si、W等。过氧化氢：测定V5+、Ti4+等 2、有机显色剂：⑴特点：有机显色剂大多能与金属离子生成极其稳定的螯合物，具有特征颜色，其选择性，灵敏度均高。不少螯合物易溶于有机溶剂，可以进行萃取比色。有机显色剂多是含有生色团和助色团的化合物。⑵生色团：含有不饱和键的基团，如-N=N-,＞C=C＜,-N=O,＞C=O,＞C=S、醌基等。⑶助色团：某些含有孤对电子的基团,它们与生色团上的不饱和键相互作用,影响其吸收,使颜色加深（红移）。如-OH,-RH,-NH2,-NHR,-SH,-Cl,-Br,-I等。⑷类型：①偶氮类：偶氮胂Ⅲ，偶氮氯膦，PAR等；②三苯甲烷类：铬天青S，二甲酚橙，结晶紫等；③其它型：OO,NN,含S型等。 茜素偶氮胂Ⅲ铬变酸二苯硫卡巴腙 8-羟基喹啉亚硝基R盐1，10-邻二氮菲N-苯基苯氧肟酸1-（2-吡啶）2-萘酚二甲基二硫代甲氨酸钠硫氢酸钾 四、多元络合物多元络合物是由三种或三种以上的组分所形成的络合物。目前应用较多的是由一种金属离子与两种配位体所组成的三元络合物，三元络合物在吸光光度分析中应用较普遍。主要特点为；1、稳定性强；2、对比度和灵敏度高；3、选择性好。 18-5吸光度测量条件的选择一、入射光波长的选择1、原则：“吸收最大，干扰最小”，κ大，A变化小的区域。选520nm进行测定 二、参比溶液的选择1、蒸馏水：试液、显色剂均无色时，用蒸馏水作参比；2、试剂空白：显色剂有色时，用不加试样溶液的试剂空白作参比；3、试液空白：试液中有其它有色离子时，用不加显色剂的被测液作参比；4、褪色空白：显色剂和试液均有色时，加一掩蔽剂掩蔽被测组分，以此溶液作参比；5、不显色空白：改变加入试剂的顺序，使被测组分不发生显色反应，以此溶液作参比。 三、吸光度读数范围的选择A=-lgT=κbc,(1)dA=-dlgT=-0.434dlnT=-0.434dT/T=κbdc(2)=(2)÷(1)以有限值表示：=一般光度计ΔT约为±0.2%~±2%。假定为0.5%，代入上式计算不同浓度相对误差如下表和下图。令上式导数为零求出当T=0.368(A=0.434)时,Et最小(1.36%)。 四、标准曲线的制作1、制作依据：比尔定律A=κbc吸光度与吸光物质的含量呈正比关系2、制作方法：在选择的实验条件下，从低浓度到高浓度分别测量一系列（不少于5）不同含量的标准溶液的吸光度，以标准溶液中待测组分的含量为横坐标，吸光度为纵坐标作图，得到一条通过原点的直线，称为标准曲线（或工作曲线）。此时再测量待测溶液的吸光度，在标准曲线上就可以查到与之相对应的被测物质的含量。3、标准曲线不通过原点原因：参比选择不当；吸收池厚度不等；吸收池位置不妥；吸收池不清洁等。 练习题1、以M表示被测物质的摩尔质量，则摩尔吸收系数κ与吸光系数a之间的关系为A。κ=a/MB。κ=aMC。κ=aM/1000D。κ=(a/M)×1000答案：B2、在光度分析中，选择参比溶液的原则是A。一般选蒸馏水B。一般选试剂溶液C。根据加入试剂和被测试液的颜色性质选择D。一般选褪色溶液答案：C 3、下列几组吸光度范围，测量相对误差较小的是A。0.2~0.8B。0.1~0.8C。0.3~0.6D。0.2~0.6答案：C4、下列表述中错误的是A。吸收峰随浓度增加而增高，但最大吸收波长不变B。透射光与吸收光互为补色光，黄色和兰色互补C。比色法又称分光光度法D。在公式A=κbc中，κ称摩尔吸收系数，其数值越大，反应越灵敏答案：C 5、某有色物质溶液的吸光度值较小时，则表明A。该物质的浓度较小B。该物质摩尔吸收系数较小C。所用比色皿较薄D。上述三者都可能答案：D6、一有色溶液在一定波长下，测定其吸光度为0.740，如果溶液及比色皿都减小一半，则其吸光度为A。2.96B。0.740C。0.370D。0.185答案：D 7、为使某待测物质测定的灵敏度较高，则应选择A。较高浓度的待测溶液B。采用具有较大吸收系数的体系C。在较长的波长下进行D。用较强的光源答案：B 献给勤奋学习的同学们！ 18-6吸光光度法的应用一、单一组分的测定１．绝对法cx=A/κ·b２．直接比较法As=κbcsAx=κbcx两者κ，b值相同，所以cx＝Ax/As·cs３．加入法Ax=κbcx（1）As=κbcs（2）根据加合性Ax＋s=Ax+As=Ax+κbcs（3）则Ax＋s－Ax=κbcs（4）两式相除（1）÷（4）,得cx＝Axcs/(Ax＋s－Ax)４．工作曲线法（5） 二、示差分光光度法与普通分光光度法比较主要不同之点、：用一个已知浓度的标准溶液作参比，与未知浓度的试样溶液比较，克服普通分光光度法在测定组分浓度过高或过低时产生较大误差的不足。原理：设标液浓度cs，待测液为cx，且cx＞cs，根据比尔定律得到：Ax=κbcxAs=κbcs两式相减，得A相对=ΔA=Ax－As=κb（cx－cs）=κbc相对 1、高吸收法：用于高含量组分的测定。操作方法：在未受光时先调节仪器T%为零，以比试样溶液浓度稍低的标准溶液作参比，调节T%至100%，然后再测定样品溶液。 2、低吸收法：用于痕量组分的测定操作方法：先用纯溶剂调节T%至100%，再用比试样溶液浓度高的标准溶液作参比，调节T%至0%，然后测定样品溶液。 3、最佳精度法：操作方法：选择两个组分和试样溶液相同但浓度不同的标准溶液（一个比试样浓度高一个低）做参比，先用比试液高的标液调节T%到0%，再用比试液低的标液调T%至100%，然后测定样品溶液。最好能选择标准溶液使样品溶液的透光率在36.8%附近，或吸光度在0.434附近。 4、示差分光光度法误差公式A相对=κbc相对，dA相对=-dlgT相对=-0.434dlnT相对=-0.434dT/T=κbdc二式相除0.434T相对lgT相对·T1dT相对dc/c=参比T1愈小，误差愈小且小得范围愈宽。可用Δ代替d 三、多组分分析：以两组分为例1、吸收光谱不重叠：同单组分2、吸收光谱重叠：列方程组求解Aλ1=κλ1xbcx+κλ1ybcyAλ2=κλ2xbcx+κλ2ybcy 练习题1、高浓度有色物质的光度法测定常用的方法是A。示差法B。摩尔比法C。光度滴定法D。目视比色法答案：A2、用普通分光光度法测得标液c1的透光率为20%，试液的透光率为12%，若以示差法测定，以c1为参比，则试液的透光率为A。40%B。50%。C。60%D。70%答案：C 3、多组分分光光度法可用解联立方程的方法求得各组分的含量，这是基于A。各组分在不同波长下有吸收B。各组分在同一波长下吸光度有加和性C。各组分的浓度有一定函数关系D。各组分的摩尔吸收系数相同答案：B '