3常见光谱分析法及紫外分光光度法的原理和应用

'常见光谱分析法及紫外分光光度法的原理和应用 光：一种电磁波或电磁辐射。电磁波是广义的光。光谱分析法：建立在物质光学光谱性质上的分析方法。1.光谱及光谱分析法光谱法的发展史：1858～1859年间，德国化学家本生和物理学家基尔霍夫奠定了一种新的化学分析方法—光谱分析法的基础。他2人被公认为光谱分析法的创始人。光谱法的应用：开创了化学和分析化学的新纪元，不少化学元素通过光谱分析发现；已广泛地用于地质、冶金、石油、化工、农业、医药、生物化学、环境保护等许多方面：是常用的灵敏、快速、准确的近代仪器分析方法之一。 电磁波的划分1）按波长区域不同：远红外光谱，红外光谱，可见光谱，紫外光谱，远紫外光谱（真空紫外光谱）2）按光谱的形态不同：线状光谱，带状光谱，连续光谱3）按产生光谱的物质类型不同：原子光谱，分子光谱，固体光谱4）按产生光谱的方式不同：发射光谱，吸收光谱，散射光谱5）按激发光源的不同：火焰光谱，闪光光谱，激光光谱，等离子体光谱等3 2.光谱分析法的特点1）分析速度较快：原子发射光谱用于炼钢炉前的分析，可在l～2分钟内同时给出二十多种元素的分析结果。2）操作简便：有些样品不经任何化学处理，即可直接进行光谱分析，采用计算机技术，有时只需按一下键盘即可自动进行分析、数据处理和打印出分析结果。在毒剂报警、大气污染检测等方面，采用分子光谱法遥测，不需采集样品，在数秒钟内，便可发出警报或检测出污染程度。3）不需纯样品：只需利用已知谱图，即可进行光谱定性分析。4）可同时测定多种元素或化合物：省去复杂的分离操作。4 5）选择性好：可测定化学性质相近的元素和化合物。它们的谱线可分开而不受干扰，成为分析这些化合物的得力工具。6）灵敏度高：可利用光谱法进行痕量分析。目前，相对灵敏度可达到千万分之一至十亿分之一，绝对灵敏度可达10-8g~10-9g7）样品损坏少：可用于古物以及刑事侦察等领域。随着新技术的采用（如应用等离子体光源），定量分析的线性范围变宽，使高低含量不同的元素可同时测定。还可以进行微区分析。局限性：光谱定量分析建立在相对比较的基础上，必须有一套标准样品作为基准，而且要求标准样品的组成和结构状态应与被分析的样品基本一致，这常常比较困难。5 常见的光谱分析法：一、原子吸收光谱分析法二、红外吸收光谱法三、核磁共振波谱法四、荧光光谱法五、紫外-可见分光光度法 一、原子吸收光谱分析法 1.原子吸收光谱法，又称为原子吸收分光光度法原理：物质产生的原子蒸气对特定谱线（待测元素的特征谱线）的吸收作用进行分析，根据特征谱线强度减弱的程度可求出待测元素的含量。与发射光谱的关系：是互相联系的两种相反的过程。原子发射光谱是原子由激发态回到基态时产生的原子发射光谱线。原子由基态跃迁到激发态时要吸收能量，产生原子吸收光谱线。8 共振吸收线使电于子从基态跃迁到第一激发态时产生的吸收线，简称共振线。不同元素，共振线不同，是元素的特征谱线。它易产生，是最灵敏线。原子吸收光谱利用处于基态的待测元素原子蒸气对共振线或其他分析线吸收的程度进行定量分析分析的原理一定波长λ和强度I0的光通过某元素的原子蒸气时，若辐射波长的能量等于原子由基态跃迁到激发态所需能量，蒸气吸收辐射的光能产生原子吸收光谱(定性)。元素浓度越大，吸收的光能越多(定量)。例，镁灯的285.2nm线。若透射光强度为I1，测量气态原子对特定波长的辐射吸收强度(I0/I1)，就可确定该元素的浓度（含量）假定光源理想，无中心波长位移，实验条件稳定，可导出比耳定律9 2.仪器设备的基本构成原子吸收分光光度计主要由光源、原子化器、单色器和检测系统四部分组成：原子吸收分光光度计结构示意图10 光源：作用是发射被测元素的特征谱线。目前常用空心阴极灯和无极放电灯作光源，前者应用最广泛原子化器：作用是提供足够的能量，使试液中的待测元素转变成原子蒸气，是原子吸收光谱分析法中的关键部件之一。有火焰原子化器和无焰原子化器两类分光系统单色器：作用是把要测量的吸收谱线同其他谱线分开分光部件有棱镜和光栅两种类型检测系统：作用是接受光信号，并把光信号转换成电信号，经放大和运算处理，给出分析结果。主要由检测器、放大器、读数和记录系统等组成11 2．原子吸收光谱分析的应用原子吸收光谱分析现已广泛应用于各个分析领域，主要有四个方面：理论研究，元素分析，有机物分析，金属化学形态分析。(1)在理论研究中的应用原子吸收可作为物理和物理化学的一种实验手段，对物质的一些基本性能进行测定和研究。电热原子化器容易做到控制蒸发过程和原子化过程，所以用它测定一些基本参数有很多优点。用电热原子化器所测定的一些参数有元素离开基体的活化能、气态原子扩散系数、解离能振子强度、光谱线轮廓的变宽、溶解度、蒸气压等。 (2)在元素分析中的应用原子吸收光谱分析，由于其灵敏度高、干扰小、分析简便快速，现已广泛用于许多领域。目前原子吸收已成为金属元素分析的最有力工具之一而且在许多领域已成为标准分析方法。原子吸收光谱分析的特点决定了它在地质和冶金分析中的重要地位，它不仅取代了许多一般的湿法化学分析，而且还与X射线荧光分析，甚至与中子活化分析有着同等的地位。目前原子吸收法已用来测定地质样品中40多种元素，并且大部分能够达到足够的灵敏度和很好的精密度。钢铁合金和高纯金属中多种痕量元素的分析现在也多用原子吸收法。 (2)在元素分析中的应用原子吸收法在食品分析中的应用也越来越广泛。食品和饮料中的20多种元素已有满意的原子吸收分析方法。生化和临床样品中必需元素和有害元素的分析现已采用原子吸收法。有关石油产品、陶瓷、农业样品、药物和涂料中金属元素的原子吸收分析的文献报道近年来越来越多。水体和大气等环境样品的微量金属元素分析已成为原子吸收分析的重要领域之一。利用间接原子吸收法尚可测定某些非金属元素。 (3)在有机物分析中的应用利用间接法可以测定多种有机物。8-羟基喹啉(Cu)、醇类(Cr)、醛类(Ag)、酯类(Fe)、酚类(Fe)、联乙酰(Ni)、酞酸(Cu)、脂肪胺(Co)、氨基酸(Cu)、维生素C(Ni)、氨茴酸(Co)、雷米封(Cu)、甲酸奎宁(Zn)、有机酸酐(Fe)、苯甲基青霉素(Cu)、葡萄糖(Ca)、环氧化物水解酶(Pb)、含卤素的有机化合物(Ag)等多种有机物，均可通过与相应的金属元素之间的化学计量反应而间接测定。 (4)在金属化学形态分析中的应用通过气相色谱或液相色谱分离然后用原子吸收光谱加以测定，可以分析同种金属元素的不同有机化合物。例如，汽油中的5种烷基铅，大气中的5种烷基铅、烷基汞、烷基胂、烷基锡、有机铬，生物中的烷基铅、烷基汞、有机锌、有机铜等多种金属有机化合物，均可通过不同类型的色谱-原子吸收联用方式加以鉴别和测定。 二、红外吸收光谱法 二、红外吸收光谱法1.红外吸收光谱法原理红外吸收光谱法（IR）是分子吸收光谱分析法的一种。它利用物质分子对红外光区辐射的选择性吸收特性进行物质成分结构分析、定性鉴定、定量测定的一种分析方法，又称为红外光分光光度分析法。多用于有机物分析在红外吸收光谱分析中，通常把红外光区分成三部分：近红外区、中红外区和远红外区。三个区域的波长（wavelength）和波数（wavenumber）如下页表示。如此分类，是因为在测定这些区的光谱时，所用的仪器不同，各区所得信息也不同注意：波长与波数的关系：倒数，但单位不同41110/cm/cm/m18 名称波长/（m）波数/（cm-1）近红外区0.786～212820～5000中红外区2～255000～400远红外区25～300400～33使用较多的是2m～25m的中红外区19 原理和特点物质吸收辐射需满足两个条件：A、辐射具有刚好满足物质跃迁所需的能量；B、辐射与物质之间有偶合作用。中红外区域红外具有适合的能量能导致振动跃迁的产生。一定频率的红外照射分子，若分子中某基团的振动频率和外界辐射频率一致，即满足了第一个条件。吸收光谱主要由分子中原子的振动和转动能级跃迁产生。故又称分子振动转动光谱。只有在振动的周期内发生偶极矩变化的振动才能产生红外吸收光谱，即正、负电荷中心不重合的分子才能产生；正、负电荷中心重合的分子如N2、O2不能产生红外吸收光谱。原因：仅当偶极矩变化时，分子才与辐射发生相互作用(振动偶合)而增加它的振动能，分子由原基态振动跃迁至较高振动能级。称这种振动为红外活性的，反之称为非红外活性的。20 当一定频率的红外光照射分子时，若分子中某基团的振动频率和它一样，二者会产生共振，光的能量通过分子偶极矩的变化传递给分子，这个基团就吸收一定频率的红外光，产生振动跃迁；若红外光的振动频率与分子中各基团振动频率不符合，则该部分红外不会被吸收。故若用连续改变频率的红外光照射某试样，则得一谱带。振动能级的跃迁伴随着转动能级的跃迁。红外吸收光谱不是简单的吸收线而是一个个吸收谱带，这也正是分子吸收光谱的特征。这些特征反映了物质分子的组成和结构。对红外吸收光谱进行剖析，便可以对物质进行定性和定量分析分子振动的形式双原子分子较简单，多原子分子可分为伸缩振动，变形或弯曲振动等六种形式，如CO2的几种振动方式21 2.红外吸收光谱仪是测定红外吸收光谱的仪器，也称红外光分光光度计。主要由红外光源、试样池、分光系统、检测系统四部分组成22 测试原理光源有硅碳棒和奈恩斯特灯两种。加热至1200℃～1800℃时，发出红外光，分成两束能量相同的光，分别照射样品池和参比池，经切光器进入分光器系统。经色散后射向检测器，信号经放大，由记录器得到红外吸收光谱图。分光系统有棱镜和光栅两种。棱镜多用碱金属卤化物，如氯化钠、溴化钾制成，极易潮解，应严格去湿防潮。检测器部分常用热电偶、热敏电阻、高雷池、硫化铅光导管等数据表示与处理横坐标：以波长m或波数cm-1表示。波数是每厘米长度红外光波的数目41110/cm/cm/m23 纵坐标多以百分透光率T％表示。自下而上由0％至100％标度。随吸收强度降低，曲线向上移动，无吸收部分的曲线在图的上部。这和紫外可见光分光光度以吸光度为纵坐标的习惯不同。因此，红外吸收光谱的所谓吸收“峰”实际上是向下的“谷”。某化合物的红外吸收光谱图如下图所示24 三、核磁共振波谱法 概况定义：用电磁波照射处于强磁场中的待测物质分子所得到的波谱称NMR。与红外、紫外光谱一样，都是吸收光谱原理：NMR波长位于无线电波范围(10m～100m)，能量小，仅引起电于子及核在其自旋态能阶之间的跃迁。电磁波照射分子，不会引起分子振动能级或转动能级及电子能级跃迁。但电磁波能与暴露在强磁场中的某些特定的原子核作用，并在某些特定磁场强度处产生强弱不同的吸收信号，以这种原理建立起来的分析方法称核磁共振波谱法应用：NMR与元素分析、紫外光分光光度分析法、红外吸收光谱法、质谱配合使用，可测定有机化合物的结构，检验化合物的纯度，某些核磁共振主要信号不重叠的混合物的分析26 1.核磁共振波谱法基本原理核磁共振现象：核自旋产生的磁场与外加磁场之间会相互作用发生回旋运动。回旋运动的频率n与外加磁场强度H成正比。核磁共振谱的分类：按测定的核：测定氢核的称为氢谱（1HNMR）；测定碳—13核的称为碳谱（13CNMR）。27 2.核磁共振波谱仪核磁共振波谱仪由磁铁、射频振荡器、扫描发生器、样品管、检测器和记录器组成1一扫描发生器2一磁铁3一射频振荡器4一样品管5一检测器6一记录器28 （1）磁铁：供给一个强而均匀的磁场。核磁共振要求磁铁功效大，高度稳定，磁场均匀，反复使用后磁场稳定（2）射频振荡器：产生供给一个固定频率的电磁波，也称兆周频率发生器，测定氢核时常用60MHz或100MHz的电磁波，产生核磁共振信号的磁场强度分别为1.41T和2.36T（3）试样管：由玻璃制成。常量试样管的容量0.4ml，试样数十毫克微量样品管的容量0.1ml，试样数毫克。管中受照射的试样承受的磁场强度必须均匀，否则不同部位的核对各不相同的频率发生共振吸收，从而产生宽吸收带信号，降低分辨能力（4）扫描发生器：在磁铁上绕一磁场扫描线圈，在线圈中通以直流电，电流由小到大可作线性调节，产生的附加磁场叠加到磁铁固有磁场上去就成了可调节磁场强度。按磁场强度改变的数值换算成相应的频率被检测记录29 （5）检测器和记录器：检测线圈垂直于磁场扫描线圈和射频振荡线圈，检测器与射频振荡器频率须调成一致。当氢原子核的回旋频率与射频振荡器频率匹配时，检测器就能检测到吸收信号。信号放大后送人记录器。自动记录下核磁共振波谱图形a）低分辨NMRb）高分辨NMR核磁共振波谱图纵坐标表示信号强度，它反映被测定核的数目。横坐标表示磁场强度或频率，即一个个核磁共振吸收峰。30 应用：定性鉴别：核磁共振谱比红外光谱能提供更多的信息。它不仅给出基团的种类，而且能提供基团在分子中的位置，是研究有机化合物尤其是高分子构型和共聚物序列分布等结构问题的有力手段。定量：高分辨1HNMR能根据磁偶合规律确定核及电子所处环境的细小差别，13CNMR主要提供高分子碳一碳骨架的结构信息。核磁共振谱法是高分子材料剖析的最重要的技术之一。可用核磁共振研究反应过程、反应机理，确定异构体，如顺反异构、立体异构等。此外，还可研究化学键性质，测定化合物含量。由于核磁共振波谱法测定时不破坏样品，对研究天然产物、生理现象等难以获得的物质提供方便。近年来，核磁共振波谱法不仅应用于有机化学、药物化学、石油化工、农药等方面，而且己深入到生命科学的研究，如胰岛素、核血红蛋白等结构的推断等31 四、分子荧光光谱法 参考光束经过衰减器将其能量减小到与样品光路的荧光辐射能量相当，经过光电倍增管后也进入检测器，与样品光路信号对比放大，计算后通过记录仪得到荧光光谱图。荧光光谱仪与吸收光谱仪相比不同之处主要有两点：一是它有两个单色器，分别设在样品池前后，都可单独进行扫描；二是在垂直于入射光方向检测荧光强度。荧光光谱仪的主要部件也具有更高或特殊要求。 光源：荧光光谱分析，对光源的强度要求比吸收光谱分析高，故荧光光谱仪一殷常用氖灯或高压汞灯(而不用钨灯或氢灯)作光源。一个新发展是使用激光作为荧光仪的激发光源，激光具有光通量大、峰值功率高、单色性好、发光的光脉冲持续时间短等优点，因此具有较高的灵敏度和选择性。常用的有氢分子激光器、氩离子激光器等。这种光源有时不需要激发单色器，并可进行时间分辨荧光法分析。单色器：现代荧光分光计，大都采用光栅作单色器，并用步进马达驱动。通过微机和专用软件控制可实现同步扫描荧光光谱分析(synchronousfluorescence)。检测器：荧光信号强度较低，光电倍增管的放大倍数要求更大。样品池：一般为圆柱形或矩形，用玻璃或硅材料制成。样品室经过精心设计以减少散射对检测器的干扰。 应用荧光分析方法在有机化合物及其它领域中的应用也很广泛。在一般的有机物和生物化学物质方面包括100多类物质分析，例如，腺嘌呤、氨茴酸、芳香多环碳氢化合物、半光氨酸、胍、吲哚、萘酚、蛋白质、水杨酸及尿酸等；在医药试剂分析方面，有50多类可用荧光方法进行分析，例如，肾上腺素、烷基吗啡、氯奎、青霉素、普鲁卡因、利血平及本巴比妥等；还包括甾类化合物和酶、辅酶等；在植物制品方面包括叶绿素、萝芙藤螺旋生物碱、黄烷酮类及鱼藤酮类等；还包括维他命及维他命制品等，以及食品和天然产品的分析。荧光分析方法较高的灵敏度和选择性使得它在这些领域成为一种特别有用的分析工具。 五、紫外分光光度法----原理和应用 紫外-可见吸收光谱（UltravioletandVisibleSpectroscopy,UV-VIS）统称为电子光谱。紫外-可见吸收光谱法是利用某些物质的分子吸收200～800nm光谱区的辐射来进行分析测定的方法。这种分子吸收光谱产生于价电子和分子轨道上的电子在电子能级间的跃迁，广泛用于有机和无机物质的定性和定量测定。 分光光度法的特点(1)测定的灵敏度高。常用于测量质量分数为10-3％~1％的微量组分，甚至可测定质量分数低至10-5％~10-4％的痕量组分。(2)测定的准确度高。一般吸光光度法测定的相对误差为2％~5％，若使用精密仪器,相对误差可降至1％~2％，完全可以满足微量组分测定的要求。 (3)仪器设备简单，操作简便、快速，选择性好。由于新的显色剂和掩蔽剂不断发现，提高了选择性，一般不需分离干扰物质就能进行测定。(4)应用广泛。几乎所有的无机离子和具有共轭双键的有机化合物都可以直接或间接地用吸光光度法进行测定。 1.光度分析基本原理转换方向：吸收光谱、发射光谱光谱法作用物：分子光谱、原子光谱波长：X-射线光谱、紫外、红光学分析法外光谱等。非光谱法旋光法、折射法 波长范围辐射类型光谱类型0.1~10nmX射线X光电子能谱10~200nm远紫外真空紫外光谱200~400nm近紫外紫外-可见（吸收、400~760nm可见光发射）光谱及荧光光谱0.76~2.5μm近红外红外光谱2.5~50μm红外50~1000μm远红外微波波谱0.001~1m微波核磁共振光谱1~1000m无线电波 2.紫外光谱的产生、波长范围紫外吸收光谱是由于分子中价电子的跃迁而产生的。分子中价电子经紫外或可见光照射时，电子从低能级跃迁到高能级，此时电子就吸收了相应波长的光，这样产生的吸收光谱叫紫外光谱紫外吸收光谱的波长范围是100-400nm(纳米),其中100-200nm为远紫外区，200-400nm为近紫外区,一般的紫外光谱是指近紫外区。 有机分子电子跃迁类型可以跃迁的电子有：电子,电子和n电子。跃迁的类型有：*,n*,*,n*。各类电子跃迁的能量大小见下图： 既然一般的紫外光谱是指近紫外区，即200-400nm，那么就只能观察*和n*跃迁。也就是说紫外光谱只适用于分析分子中具有不饱和结构的化合物。 2.1非共轭有机化合物的紫外吸收饱和化合物饱和烷烃：σ*，能级差很大，紫外吸收的波长很短，属远紫外范围。例如：甲烷125nm，乙烷135nm含饱和杂原子的化合物：σ*、n*，吸收弱，只有部分有机化合物（如C-Br、C-I、C-NH2）的n*跃迁有紫外吸收。 同一碳原子上杂原子数目愈多，λmax愈向长波移动。例如：CH3Cl173nm，CH2Cl2220nm，CHCl3237nm，CCl4257nm小结：一般的饱和有机化合物在近紫外区无吸收，不能将紫外吸收用于鉴定；反之，它们在近紫外区对紫外线是透明的，所以可用作紫外测定的良好溶剂。 烯、炔及其衍生物非共轭*跃迁，λmax位于190nm以下的远紫外区。例如：乙烯165nm（ε15000），乙炔173nmC＝C与杂原子O、N、S、Cl相连，由于杂原子的助色效应，λmax红移。小结：C＝C，C≡C虽为生色团，但若不与强的助色团N，S相连，*跃迁仍位于远紫外区。 含杂原子的双键化合物1.含不饱和杂原子基团的紫外吸收（如下页表所示）σ*、n*、ππ*属于远紫外吸收nπ*跃迁为禁戒跃迁，弱吸收带－R带2.取代基对羰基化合物的影响当醛、酮被羟基、胺基等取代变成酸、酯、酰胺时，由于共轭效应和诱导效应影响羰基，λmax蓝移。3.硫羰基化合物R2C=S较R2C=O同系物中nπ*跃迁λmax红移。0 2.2共轭有机化合物的紫外吸收共轭体系的形成使吸收移向长波方向共轭烯烃的ππ*跃迁均为强吸收带，≥10000，称为K带。共轭体系越长，其最大吸收越移往长波方向，且出现多条谱带。 共轭烯烃及其衍生物Woodward-Fieser规则：取代基对共轭双烯λmax的影响具有加和性。应用范围：非环共轭双烯、环共轭双烯、多烯、共轭烯酮、多烯酮注意：①选择较长共轭体系作为母体；②交叉共轭体系只能选取一个共轭键，分叉上的双键不算延长双键；③某环烷基位置为两个双键所共有，应计算两次。 2.3常用的术语生色团：最有用的紫外-可见光谱是由π→π＊和n→π＊跃迁产生的。这两种跃迁均要求有机物分子中含有不饱和基团。这类含有π键的不饱和基团称为生色团。简单的生色团由双键或叁键体系组成，如乙烯基、羰基、亚硝基、偶氮基-N＝N-、乙炔基、腈基-C≡N等。 助色团：有一些含有n电子的基团(如-OH、-OR、-NH２、-NHR、-X等)，它们本身没有生色功能(不能吸收λ>200nm的光)，但当它们与生色团相连时，就会发生n-π共轭作用，增强生色团的生色能力(吸收波长向长波方向移动，且吸收强度增加)，这样的基团称为助色团。 红移与蓝移：有机化合物的吸收谱带常常因引入取代基或改变溶剂使最大吸收波长λmax和吸收强度发生变化:λmax向长波方向移动称为红移，向短波方向移动称为蓝移(或紫移)。浓色效应和淡色效应：吸收强度即摩尔吸光系数ε增大或减小的现象分别称为增色效应或减色效应，如下图所示。 吸收带：1.R带：从德文Radikal(基团)得名为n→π*跃迁引起的吸收带。如羰基-CO-,-NO2、-CHO等，其特点为吸收强度弱，ε＜100，吸收峰波长一般在270nm以上；2.K带：从德文Konjugation(共轭作用)得名，为π→π*跃迁引起的，如共轭双键。该吸收带的特点为吸收峰很强，ε＞104，最大吸收峰位置一般在217～280nm。共轭双键增加，λmax向长波方向移动，εmax也随之增加； 3.B带：从德文Benzenoid(苯的)得名，为芳香化合物(包括杂环芳香化合物)的特征吸收带。这是由于π→π*跃迁和苯环的振动重叠引起的。苯蒸气在230～270nm处出现精细结构的吸收光谱，称为笨的多重吸收带或精细结构吸收带。在极性溶剂中或苯环上有取代基时，复杂的B吸收带简化，精细结构消失，出现一宽峰，中心在256nm，ε=220。 4.E带：是由苯环结构中三个乙烯的环状共轭系统的跃迁所产生的。分为E1和E2吸收带，其中E1在185nm附近，ε=47000，E2在204nm，ε=7900，均为强吸收。 若苯环上有助色团：如-OH、-Cl等取代时,由于n-π共轭，使E2吸收带向长波方向移动,但一般在210nm作用；若有发色团取代且与苯环共轭(π-π共轭)，则E2吸收带与K带合并并且发生红移。 羰基双键与苯环共轭：K带强；苯的E2带与K带合并，红移；取代基使B带简化；氧上的孤对电子：R带，跃迁禁阻，弱； 3.光度法的原理吸光光度法是基于被测物质的分子对光具有选择吸收的特性而建立的分析方法。光的波长范围10-2nm10nm102nm104nm0.1cm10cm103cm105cmx紫红微无射射外外波线线线光光电波可见光61 物质对光的吸收物质的颜色与光的关系光谱示意表观现象示意完全吸收完全透过吸收黄色光62 吸收光谱示意图1A34122λλmaxλshλmin1-吸收峰；2-谷；3-肩峰；4-末端吸收 朗伯-比尔定律透光度IT=It/I0rII0t吸光度IA=-lgTa 影响物质对光吸收程度的因素：物质的本性入射光波长溶剂种类溶液温度溶液浓度光路长度 Lambert-Beer定律A=kbcb：液层厚度，即吸收池厚度，单位cmc：溶液浓度当单位为mol/L时，k为摩尔吸光系数，用ε表示，单位为：L·mol-1·cm-11%当单位为g/ml时，k为比吸光系数，用E1cm表示，单位为：mL·g-1·cm-11%E=ε×10/M1cm 定性分析与定量分析的基础B定性分析基础AA物质对光的选择吸收(A)()maxmaxB定量分析基础A增在一定的实验条件下，大物质对光的吸收与物C质的浓度成正比。67 分光光度法的误差待测组分浓度过高化学反应的影响谱带宽度过大偏离朗伯-比尔定律pH值的影响杂质的影响光散射的影响光电池灵敏性差仪器测量误差光源不稳定读数不准 偏离朗伯-比耳定律的原因标准曲线法测定未知溶液的浓度时，发现：标准曲线常发生弯曲（尤其当溶液浓度较高时），这种现象称为对朗伯—比耳定律的偏离。引起这种偏离的因素（两大类）：一类是物理性因素，即仪器的非理想引起的；另一类是化学性因素。 （1）物理性因素朗-比耳定律的前提条件之一是入射光为单色光。难以获得真正的纯单色光。分光光度计只能获得近乎单色的狭窄光带。复合光可导致对朗伯—比耳定律的正或负偏离非单色光、杂散光、非平行入射光都会引起对朗伯—比耳定律的偏离，最主要的是非单色光作为入射光引起的偏离。 近似单色光，在低浓度范围内，不发生偏离。若浓度较高，即使｜Δε｜很小，A总≠Ａ1，且随着c值增大，A总与A1的差异愈大，在图上则表现为A-c曲线上部(高浓度区)弯曲愈严重。故朗伯-比耳定律只适用于稀溶液为克服非单色光引起的偏离，首先应选择比较好的单色器。此外还应将入射波长选定在待测物质的最大吸收波长且吸收曲线较平坦处。 （2）化学性因素：朗—比耳定律的假定：所有的吸光质点之间不发生相互作用；假定只有在稀溶液(c<10-2mol/L)时才基本符合。当溶液浓度c>10-2mol/L时，吸光质点间可能发生缔合等相互作用，直接影响了对光的吸收。故：朗伯-比耳定律只适用于稀溶液 紫外分光光度仪 紫外-可见分光光度计光源单色器样品吸收池检测器指示器1、光源：要求发射强度足够、稳定，具有连续光谱的光源热光源(如钨丝灯及碘钨灯)：>350nm，可见光区气体放电光源(如氢灯或氘灯)：150~400nm，紫外区2、单色器：将来自光源的连续光谱按波长顺序色散，并从中分离出一定宽度的谱带。色散元件：三角棱镜和光栅3、吸收池：（比色皿)有普通玻璃和石英玻璃 4、检测器将所接收的光信息转变为电信息，有硒光电池、光电倍增管、光二极管阵列检测器等。5、指示器有光点检流计、微电流计、数字显示器等单光束分光光度计类型双光束分光光度计双波长分光光度计 (一)光源在整个紫外光区或可见光谱区可以发射连续光谱，具有足够的辐射强度、较好的稳定性、较长的使用寿命。可见光区：钨灯或卤钨灯作为光源，其辐射波长范围在360～2500nm。紫外区：氢、氘灯。波长范围185～400nm的连续光谱。 氘灯—紫外卤钨灯--可见 (二)分光系统将光源发射的复合光分解成单色光并可从中选出一任波长单色光的光学系统。①入射狭缝：光源的光由此进入单色器；②准直镜：使入射光成为平行光束；③色散元件：将复合光分解成单色光；棱镜或光栅；④聚焦装置：将分光后所得单色光聚焦至出射狭缝；⑤出射狭缝。 棱镜λ1白光λ2出射狭缝入射狭缝准直透镜棱镜聚焦透镜 在镀铝的玻璃表面刻有数量很大的等宽度等间距条痕(600、1200、2400条/mm)。原理：利用光通过光栅时发生衍射和干涉现象而分光。 (三)吸收池(比色皿)样品室放置各种类型的吸收池（比色皿）和相应的池架附件。吸收池主要有石英池和玻璃池两种。在紫外区须采用石英池，可见区一般用玻璃池。要求：匹配性（对光的吸收和反射应一致） (四)检测系统利用光电效应将透过吸收池的光信号变成可测的电信号，常用的有光电池、光电管、光电倍增管或光二极管阵列。 (五)信号显示系统检流计、数字显示、微机进行仪器自动控制和结果处理记录装置 单波长单光束分光光度计0.575光源单色器检测器显示吸收池 单波长双光束分光光度计光束分裂器比值光源单色器吸收池检测器显示88 2、显色条件的选择选择显色反应的一般标准:(1)选择性要好(2)灵敏度要高(3)对比度要大如果显色剂有颜色，则有色化合物与显色剂的最大吸收波长的差别要大，一般要求在60nm以上。(4)有色化合物的组成要恒定,化学性质要稳定。(5)显色反应的条件要易于控制。 3、选择适当的参比溶液测定吸光度值并归零内含溶剂、显色剂以及其他进行显色反应必要的试剂 仪器的操作（７２１型）1）预热仪器。为使测定稳定，将电源开关打开，使仪器预热20min，为了防止光电管疲劳，不要连续光照。预热仪器时和在不测定时应将比色皿暗箱盖打开，使光路切断。2）选定波长。3）固定灵敏度档。4）调节“0”点。轻轻旋动调“0”电位器，使读数表头指针恰好位于透光度为“0”处（此时，比色皿暗箱盖是打开的，光路被切断，光电管不受光照）。5）调节T=100％。将盛蒸馏水（或空白溶液或纯溶剂）的比色皿放入比色皿座架中的第一格内，有色溶液放在其它格内，把比色皿暗箱盖子轻轻盖上，转动光量调节器，使透光度T=100％，即表头指针恰好指在T=100％处。6）测定。轻轻拉动比色皿座架拉杆，使有色溶液进入光路，此时表头指针所示为该有色溶液的吸光度A。读数后，打开比色皿暗箱盖。7）关机。实验完毕，切断电源，将比色皿取出洗净，并将比色皿座架及暗箱用软纸擦净。 比色皿的使用方法：①拿比色皿时，手指只能捏住比色皿的毛玻璃面，不要碰比色皿的透光面，以免沾污。②清洗比色皿时，一般先用水冲洗，再用蒸馏水洗净。如比色皿被有机物沾污，可用盐酸-乙醇混合洗涤液（1∶2）浸泡片刻，再用水冲洗。不能用碱溶液或氧化性强的洗涤液洗比色皿，以免损坏。也不能用毛刷清洗比色皿，以免损伤它的透光面。每次做完实验时，应立即洗净比色皿。③比色皿外壁的水用擦镜纸或细软的吸水纸吸干，以保护透光面。④测定有色溶液吸光度时，一定要用有色溶液洗比色皿内壁几次，以免改变有色溶液的浓度。另外，在测定一系列溶液的吸光度时，通常都按由稀到浓的顺序测定，以减小测量误差。⑤在实际分析工作中，通常根据溶液浓度的不同，选用液槽厚度不同的比色皿，使溶液的吸光度控制在0.2～0.7。93 溶剂对紫外、可见吸收光谱的影响溶剂对紫外-可见光谱的影响较为复杂。改变溶剂的极性，会引起吸收带形状的变化。例如，当溶剂的极性由非极性改变到极性时，精细结构消失，吸收带变向平滑。改变溶剂的极性，还会使吸收带的最大吸收波长发生变化。下表为溶剂对亚异丙酮紫外吸收光谱的影响。CHCl3CH3OHH2O正己烷*max/nm230238237243n*max/nm329315309305 由上表可以看出，当溶剂的极性增大时，由n*跃迁产生的吸收带发生蓝移，而由*跃迁产生的吸收带发生红移。 由于溶剂对电子光谱图影响很大，因此，在吸收光谱图上或数据表中必须注明所用的溶剂。与已知化合物紫外光谱作对照时也应注明所用的溶剂是否相同。在进行紫外光谱法分析时，必须正确选择溶剂。 选择溶剂时注意下列几点：（1）溶剂应能很好地溶解被测试样，溶剂对溶质应该是惰性的。即所成溶液应具有良好的化学和光化学稳定性。（2）在溶解度允许的范围内，尽量选择极性较小的溶剂。（3）溶剂在样品的吸收光谱区应无明显吸收。 用仪器测定时应尽量使溶液透光度值在T%=20～65％(吸光度A=0.70～0.20)。可求出浓度相对误差最小时的透光度Tmin为：Tmin＝36.8%,Amin＝0.434 紫外分光光度法的应用1.推断官能团如果一个化合物在紫外区有强的吸收，表明它可能存在共轭体系，吸收波长越长，共轭体系越大。2.判断异构体不同的异构体可能具有不同的紫外光谱，以此来判断属哪个异构体。3.推断分子结构(可结合Woodward规则的计算结果) 4.分子量的测定5.定量分析的应用－反应速度的测定朗伯-比尔定律6.医药研究抗癌药物对DNA变性影响的研究人血清与癌细胞关系的研究 有机化合物紫外光谱解析了解共轭程度、空间效应、氢键等；可对饱和与不饱和化合物、异构体及构象进行判别。紫外-可见吸收光谱中有机物发色体系信息分析的一般规律是：⑴若在200～750nm波长范围内无吸收峰，则可能是直链烷烃、环烷烃、饱和脂肪族化合物或仅含一个双键的烯烃等。 ⑵若在270～350nm波长范围内有低强度吸收峰(ε=10～100L·mol-1·cm-1),（n→π跃迁），则可能含有一个简单非共轭且含有n电子的生色团，如羰基。⑶若在250～300nm波长范围内有中等强度的吸收峰则可能含苯环。⑷若在210～250nm波长范围内有强吸收峰，则可能含有2个共轭双键；若在260～300nm波长范围内有强吸收峰，则说明该有机物含有3个或3个以上共轭双键。⑸若该有机物的吸收峰延伸至可见光区，则该有机物可能是长链共轭或稠环化合物。 一、定性鉴别 二、定量分析法—标准曲线法例：精密称取B样品25.0mg，用水溶液配成12100ml。精密吸取10.00ml，又置100ml容量瓶中，加水至刻度。取此溶液在1cm的吸收池中，于361nm处测定吸光度为0.507，求B的百分含量？120.507－3－5c==2.45×10g/100mL=2.45×10g/mLi207×122.5010105C2.5010g/mL样1001005Ci2.4510B%100%100%98.0%12C5样2.5010 标准曲线法例如：芦丁含量测定分别移取0.200mg/mL标样0~5mL→25mL样品3.0mg→25mL 0.710mg/25mL'