紫外可见分光光度法.doc

'紫外可见分光光度法——光的吸收定律一.Lambert-Beer定律——光吸收基本定律　　“Lambert-Beer定律”是说明物质对单色光吸收的强弱与吸光物质的浓度（c）和液层厚度（b）间的关系的定律，是光吸收的基本定律，是紫外-可见光度法定量的基础。　　Lambert定律——吸收与液层厚度（b）间的关系　　Beer定律——吸收与物质的浓度（c）间的关系　　“Lambert-Beer定律”可简述如下：　　当一束平行的单色光通过含有均匀的吸光物质的吸收池（或气体、固体）时，光的一部分被溶液吸收，一部分透过溶液，一部分被吸收池表面反射；　　设：入射光强度为Io，吸收光强度为Ia，透过光强度为It，反射光强度为Ir，则它们之间的关系应为：  Io=Ia+It+Ir      (4)　　若吸收池的质量和厚度都相同，则Ir基本不变，在具体测定操作时Ir的影响可互相抵消（与吸光物质的c及b无关）　　上式可简化为：        Io=Ia+It          (5)　　实验证明：当一束强度为I0的单色光通过浓度为c、液层厚度为b的溶液时，一部分光被溶液中的吸光物质吸收后透过光的强度为  It，则  它们之间的关系为：称为透光率，用T%表示。称为吸光度，用A表示　　则          A=-lgT=K·b·c              (7)　　此即  Lambert-Beer  定律  数学表达式。　　L-B定律可表述为：当一束平行的单色光通过溶液时，溶液的吸光度(A)与溶液的浓度(C)和厚度(b)的乘积成正比。它是分光光度法定量分析的依据。　　二.吸光度的加和性　　设某一波长（l）的辐射通过几个相同厚度的不同溶液c1，c2...... cn，其透射光强度分别为 I1， I2...... In，根据吸光度定义：这一吸光体系的总吸光度为　　而各溶液的吸光度分别为： 吸光度的和为：即  几个（同厚度）溶液的吸光度等于各分层吸光度之和。如果溶液中同时含有 n 中吸光物质，只要各组分之间无相互作用（不因共存而改变本身的吸光特性），则：A = K1C1 b1+ K2C2 b2+⋯⋯ KnCn bn= A1+ A2+⋯⋯+ An    (10)应用：①进行光度分析时，试剂或溶剂有吸收，则可由所测的总吸光度 A 中扣除，即以试剂或溶剂为空白的依据；    ②测定多组分混合物；    ③校正干扰。三.吸光系数　　Lambert-Beer  定律中的比例系数“K ”的物理意义是：吸光物质在单位浓度、单位厚度时的吸光度。一定条件（T、 l 及溶剂）下， K 是物质的特征常数，是定性的依据。K 在标准曲线上为斜率，是定量的依据。常有两种表示方法：1.摩尔吸光系数（e）：当 c用mol/L、b 用cm为单位时，用摩尔吸光系数 e  表示，单位为L/mol·cm              A = e ·b·c                (11)e 与 b及 c 无关。e 一般不超过105数量级，通常： e  >104为强吸收；e <102为弱吸收；102 > e  >104为中强吸收。吸收系数不可能直接用1mol/L浓度的吸光物质测量，一般是由较稀溶液的吸光系数换算得到。2.吸光系数当 c 用g/L，b 用cm为单位时，K 用吸光系数 a 表示，单位为L/g·cm              A = a·b·c               (12)e 与 a 之间的关系为：   e = M ·a                (13)e ——通常多用于研究分子结构a——多用于测定含量。四.引起偏离Lambert-Beer  定律的因素根据 L-B  定律，A与c的关系应是一条通过原点的直线，称为“标准曲线”。但事实上往往容易发生偏离直线的现象而引起误差，尤其是在高浓度时。导致偏离L-B定律的因素主要有：1.吸收定律本身的局限性事实上， L-B  定律是一个有限的定律，只有在稀溶液中才能成立。由于在高浓度时（通常 C >0.01mol/L），吸收质点之间的平均距离缩小到一定程度，邻近质点彼此的电荷分布都会相互受到影响，此影响能改变它们对特定辐射的吸收能力，相互影响程度取决于C，因此，此现象可导致 A与 C 线性关系发生偏差。此外，    （ n 为折射率）只有当 c £ 0.01mol/L（低浓度）时，n 基本不变，才能用e 代替e真 。　　2.化学因素    溶液中的溶质可因 c 的改变而有离解、缔合、配位以及与溶剂间的作用等原因而发生偏离 L-B 定律的现象。　　例：在水溶液中，Cr(Ⅵ)的两种离子存在如下平衡Cr2O42-+H2O⇌2CrO42-+2H+　　Cr2O42-、CrO42-  有不同的 A 值，溶液的 A  值是二种离子的 A 之和。但由于随着浓度的改变（稀释）或改变溶液的 pH 值，[Cr2O42-]/[CrO42-]会发生变化，使C总与 A总 的关系偏离直线。　　消除方法：控制条件。　　3.仪器因素（非单色光的影响）　　L-B 定律的重要前提是“单色光”，即只有一种波长的光；实际上，真正的单色光却难以得到。由于吸光物质对不同l的光的吸收能力不同（ e 不同），就导致对的偏离。“单色光”仅是一种理想情况，即使用棱镜或光栅等所得到的“单色光”实际上是有一定波长范围的光谱带，“单色光”的纯度与狭逢宽度有关，狭缝越窄，他所包含的波长范围也越窄。　　4.其它光学因素　　（1）散射和反射：浑浊溶液由于散射光和反射光而偏离L-B　　（2）非平行光紫外可见分光光度法——光度法显色反应条件和测量条件的选择一.影响显色反应的因素及反应条件的选择　　（一）显色反应的选择　　1.选择性好：干扰少或易排除；　　2.灵敏度高（S）：尤其是对低含量组分，一般选择 e：104~105L/mol·cm　　3.有色化合物稳定、组成恒定　　4.有色化合物与显色剂的颜色差别大　　（二）影响显色反应的因素及反应条件　　1.显色剂的用量M+R⇌MR待测组分显色剂有色化合物　　在被测组分一定及其它实验条件不变的情况下，分别测得加入不同量显色剂测得A值，作A-cR曲线，常见以下二种情况：　　图7吸光度与显色剂加入量的关系 　　(a)在 a 与 b之间任选一点吸光度与显色剂加入量的关系　　(b)严格控制CR　　因此，合适的 cR 通过实验确定。　　2.溶液的酸度　　(1)对金属离子存在状态的影响——防止水解，防止沉淀生成　　(2)对显色剂浓度的影响H2R⇌2H++R2-　　(3)对显色剂颜色的影响　　pKa pKa　　H2R⇌H++HR-⇌2H++R2-　　      6.9     12.4　　黄    橙      红　　适宜的pH通过实验确定：做 A-pH曲线（其它条件并不变），从中找出 A 较大且基本不变的某pH范围。　　3.显色时间：各种显色反应得速度不同，反应完全所需时间不同；有些有色化合物在一定的时间内稳定。　　选择方法：作 A-t（min）曲线，选择在 A 较大且稳定的时间内进行。　　4.显色温度：显色反应一般在室温下进行，但反应速度太慢或常温下不易进行的显色反应需要升温或降温。　　选择方法：作 A-T （℃）曲线，选择在 A 较大的时间内进行。　　5.溶剂：实验确定——选择合适的溶剂（常为有机溶剂），提高反应的灵敏度及加快反应速度。　　二.分光光度法测量误差及实验条件的选择　　（一）测量误差及A范围的选择　　任何一台分光光度计都有光度误差∆T%，但给定的一台分光光度计，∆T 基本上是一常数，一般为±0.002~±0.01，但在不同 T 时同样的 ∆T 对应的∆A 则不同，所以引起的∆C/C (浓度的相对误差)就不同。　　由L-B定律得：      (20)            　　将此式微分得： 　　浓度相对误差为：            (21)　　设当∆T =±0.01时，不同 T% 时所对应的∆c/c 可从相关表查得：　　当 T% =36.8%即 A =0.434时，∆c/c 最小；　　当 T% 在15-65%之间即 A 在0.2~0.8范围内，∆c/c 较小。　　实际测定时：可通过控制溶液的 c 及 b 使 A 在0.2~0.8范围内。　　（二）测量波长选择　　一般根据吸收光谱选择 lmax测定——灵敏度高、A 随波长变化小若有干扰，根据“吸收大，干扰小”原则选择l 。　　如：3，3’-二氨基联苯（DAB）和Se形成配合物Se-DAB的最大吸收波长在340nm波长处，DAB也有很强的吸收，在这种情况下，分析波长应选用次大吸收波长420nm，否则测量误差较大。　　3.狭缝宽度　　理论上，定性分析采用最小的狭缝宽度，在定量分析中，为避免狭缝太小，出射光太弱而引起信噪比降低，可以将狭缝开大一点。通过测定 A 随狭缝宽度的变化规律，可选择出合适的狭缝宽度。狭缝宽度在某个范围内，A 值恒定，狭缝宽度增大至一定程度时 A 减小，因此：合适的狭缝宽度是在吸光度不减小时的最大狭缝宽度。　　（三）空白溶液的选择　　空白溶液是用来调节工作零点即 A=0，T%=100%的溶液，以消除溶液中其它基体组分以及吸收池和溶剂对入射光的反射和吸收所带来的误差。　　根据情况不同，常用空白溶液有如下选择：　　1.溶剂空白：当溶液中只有待测组分在测定波长下有吸收，而其它组分无吸收时　　—用纯溶剂作空白；　　2.试剂空白：如果显色剂或其它试剂有吸收，而待测试样溶液无吸收　　—则用不加待测组分的其它试剂作空白；　　3.试样空白：如果试样基体有吸收，而显色剂或其它试剂无吸收　　—则用不加显色剂的试样溶液作空白；　　4.平行操作空白：用溶剂代替试样溶液，以与试样完全相同的分析步骤进行平行操作，用所得的溶液作空白。紫外可见分光光度法——定性及定量分析方法一.定性分析  选择合适的溶剂（非极性），使用有足够纯度单色光的分光光度计，在相同的条件下测定相近浓度的待测试样和标准品的溶液的吸收光谱，然后比较二者吸收光谱特征：吸收峰数目及位置、吸收谷及肩峰所在的位置（ l ）等；分子结构相同的化合物应有完全相同的吸收光谱。　　二.定量分析　　（一）单组分定量分析方法 　　1.标准曲线法：配制一系列（5~10）个不同c的标准溶液，在适当l ——通常为 lmax下，以适当的空白溶液作参比，分别测定A，然后作 A-c 曲线同条件下测定试样溶液吸光度 Ax ，查找对应的 cx 。　　2.直接比较法：已知试样溶液基本组成，配制相同基体、相近浓度的标准溶液，分别测定吸光度A标、A样　　根据 L-A 定律： A标= K·b·c标        A样= K·b·c样　　则  　　　　　　　　　　          (18)　　（二）多组分定量分析  混合组分的吸收光谱相互重叠的情况不同，测定方法也不相同，常见混合组分吸收光谱相干扰情况有以下三种：  图5  混合组分吸收光谱的三种相干情况示意图　　1.第一种情况：各种吸光物质吸收曲线不相互重叠或很少重叠，则可分别在l1 及 l2 处测定 a  及 b 组分的 c；　　2.第二种情况  部分重叠：先在 l1 处测得 ca  ,再在 l2 处测得混合组分的吸光度 Aa+b ，根据吸收定律加和性：　　即可求得cb。[应先求得 ea(l2) ，与 ea(l2) ，并使用相同 b ]　　3.第三种情况:两吸收曲线互相重叠，但服从 L-B 定律　　(1)解方程组法：　　若试样中需要测定两种组分，则选定两个波长l1 及 l2 ，测得试液的吸光度为 A1和 A2，则可解方程组求得组分a、b 的浓度ca、cb：　　如果混合物含有 n 个组分，可不经分离，在 n 个适当波长处进行 n 次测量，获得 n个吸光度值，然后解 n 个联立方程以求得各组分的浓度。　　（2）等吸光度双波长（消去）法吸收光谱重叠的d、e两组分共存，现设法把一种组分(a)的吸光度消去。方法如下： 图6  二组分混合物吸收光谱用作图法选择l1、l2（双波长分光光度法）　　选取两个适当的波长l1 和 l2 ，　　使 e1d= e2d，而尽可能大，则用这两个波长l1 和 l2测得混合物溶液吸光度之差∆A 应只与 ce 成正比（而与cd无关），直接测得ce ：　　因为          　　所以    　　若用1cm吸收池  若需测定另一组分 d 时，也可用同样方法，选择另一个l1’ 和 l2’ ，先消去的 e 的干扰，直接求cd紫外可见分光光度法——分子吸收光谱一.分子吸收光谱的产生（一）分子能级与电磁波谱  分子中包含有  原子和电子，分子、原子、电子都是运动着的物质，都具有能量，且都是量子化的。在一定的条件下，分子处于一定的运动状态，物质分子内部运动状态有三种形式：①电子运动：电子绕原子核作相对运动；②原子运动：分子中原子或原子团在其平衡位置上作相对振动；③分子转动：整个分子绕其重心作旋转运动。  所以：分子的能量总和为          E分子= Ee +Ev +Ej +⋯ (E0 +E平)          (3)  分子中各种不同运动状态都具有一定的能级。三种能级：电子能级 E（基态 E1与激发态 E2）              振动能级 V=0，1，2，3⋯               转动能级 J =0，1，2，3⋯  当分子吸收一个具有一定能量的光量子时，就有较低的能级基态能级 E1跃迁到较高的能级及激发态能级 E2 ，被吸收光子的能量必须与分子跃迁前后的能量差∆E 恰好相等，否则不能被吸收。图1  双原子分子的三种能级跃迁示意图对多数分子        对应光子波长        光    谱∆E 约为1~20eV       1.25~0.06㎛  紫外、可见区(电子)∆E 约为0.5~1eV        25~1.25㎛        (中)红外区(振动)∆E约为10-4~0.05eV      1.25cm~25㎛      （远）红外区(转动)    分子的能级跃迁是分子总能量的改变。当发生电子能级跃迁时，则同时伴随有振动能级和转动能级的改变，即“电子光谱”——均改变。    因此，分子的“电子光谱”是由许多线光谱聚集在一起的带光谱组成的谱带，称为“带状光谱”。  由于各种物质分子结构不同®对不同能量的光子有选择性吸收®  吸收光子后产生的吸收光谱不同®  利用物质的光谱进行物质分析的依据。二. 紫外-可见吸收光谱与有机分子结构的关系（一）电子跃迁的类型  许多有机化合物能吸收紫外-可见光辐射。有机化合物的紫外-可见吸收光谱主要是由分子中价电子的跃迁而产生的。  分子中的价电子有：        成键电子：s电子、p电子（轨道上能量低）        未成键电子：n电子（  轨道上能量较低）    这三类电子都可能吸收一定的能量跃迁到能级较高的反键轨道上去，见图-2： 图2  分子中价电子跃迁示意图1.s-s*跃迁  s-s*的能量差大®所需能量高®吸收峰在远紫外(l<150nm)  饱和烃只有s、s*轨道，只能产生s-s*跃迁，例如：  甲烷吸收峰在125nm；乙烷吸收峰在135nm(<150nm)  (因空气中O2对<150nm辐射有吸收，定量分析时要求实验室有真空条件，要求一般难达到）2.p-p*跃迁  p-p*能量差较小®所需能量较低®吸收峰紫外区(l200nm左右)  不饱和烃类分子中有p电子，也有p*轨道，能产生p-p*跃迁：CH2=CH2,吸收峰  165nm。（吸收系数e大，吸收强度大，属于强吸收）3.n-s*跃迁  n-s*能量较低®收峰紫外区  (l 200nm左右)  （与p-p*接近）  含有杂原子团如：-OH，-NH2，-X，-S等的有机物分子中除能产生s-s*跃迁外，同时能产生n- s *跃迁，例如：三甲基胺(CH3)3N-的n-s*吸收峰在227nm，e约为900L/mol·cm，属于中强吸收。4.n-p*跃迁  n-p*能量低®吸收峰在近紫外、可见区  (l 200~700nm)含有杂原子的不饱和基团，如  -C=O，-CºN等，例如：  丙酮：n-p*跃迁， lmax280nm左右（同时也可产生p-p*跃迁），属于弱吸收，e<500L/mol·cm.  各种跃迁所需能量大小次序为：s-s*>n-s*³p-p*>n-p*  紫外-可见吸收光谱法在有机化合物中应用主要以：p-p*、n-p*为基础。（二）吸收峰的长移和短移        长移：吸收峰向长λ 移动的现象，又称红移；        短移：吸收峰向短λ移动的现象，又称紫移；        增强效应：吸收强度增强的现象；        减弱效应：吸收强度减弱的现象。（三）发色团和助色团  p-p*、n-p*跃迁都需要有不饱和的官能团以提供p轨道，因此，轨道的存在是有机化合物在紫外-可见区产生吸收的前提条件。1.发色团：具有p轨道的不饱和官能团称为发色团。  主要有：-C=O，-N=N-，-N=O，-CºC-等。但是，只有简单双键的化合物生色作用很有限，其有时可能仍在远紫外区，若分子中具有单双键交替的“共轭大p键”（离域键）时，如：  丁二稀      CH2=CH—CH=CH2   由于大p键中的电子在整个分子平面上运动，活动性增加，使p与p*间的能量差减小，使p-p*吸收峰长移，生色作用大大增强。2.助色团  本身不“生色”，但能使生色团生色效应增强的官能团——称为助色团  主要有：–OH、  –NH2、  –SH、–Cl、–Br等（具有未成键电子轨道n的饱和官能团）  当这些基团单独存在时一般不吸收紫外-可见区的光辐射。但当它们与具有轨道的生色基团相结合时，将使生色团的吸收波长长移（红移），  且  使吸收强度增强。（助色团至少要有一对与生色团p电子作用的孤对电子）（四）溶剂效应（溶剂的极性对吸收带的影响）        p-p*跃迁：溶剂的极性   ®长移三. 吸收光谱吸收光谱：又称吸收曲线，是以波长（l）为横坐标、吸光度（A）为纵坐标所描绘的图形。特征：吸收峰  曲线上比左右相邻处都高的一处；lmax吸收程度最大所对应的l（曲线最大峰处的l）谷曲线上比左右相邻处都低的一处；lmin最低谷所对应的l；肩峰介于峰与谷之间，形状像肩的弱吸收峰；末峰吸收  在吸收光谱短波长端所呈现的强吸收而不呈峰形的部分。图3  吸收曲线示意图定性分析：吸收光谱的特征（形状和lmax）定量分析：一般选lmax测吸收程度（吸光度A）'