药用基础化学 第二版课件 教学课件 作者 戴静波 主编 第八章 光谱分析法分光光度法.ppt

'第八章光谱分析法 1.掌握分光光度法基本原理—Lambert-Beer定律，能熟练运用Lambert-Beer公式进行有关计算。2.掌握吸光度、透光率、吸光系数、摩尔吸光系数、百分吸光系数的概念。3.熟悉标准曲线法及标准对照法。4.了解物质对光的选择性吸收及吸收光谱。5.了解分光光度计的基本构造；提高测量灵敏度和准确度的方法。本章教学要求 历史1852年Beer定律1868年布特列洛夫1870年杜包斯克目视比色计浦氏光度计1911年贝格尔硒光电池比色计1918年美国国家标准局第一台分光光度计20世纪30-40年代E.B.Sandell“痕迹金属比色测定”20世纪50年代有机显色剂近二、三十年信息技术，高新技术，联用技术 非光谱法不以光的波长为特征讯号例如折射法，浊度法，旋光法光谱法光学分析法基于物质光化学性质而建立起来的分析方法在光（或其它能量）的作用下，通过测量物质产生的发射光、吸收光或散射光的波长和强度来进行分析的方法。分为：吸光光度法，发射光谱法 光谱法与非光谱法的区别：光谱法：内部能级发生变化原子吸收/发射光谱法：原子外层电子能级跃迁分子吸收/发射光谱法：分子外层电子能级跃迁非光谱法：内部能级不发生变化仅测定电磁辐射性质改变 高能辐射区γ射线能量最高，来源于核能级跃迁χ射线来自内层电子能级的跃迁光学光谱区紫外光来自原子和分子外层电子能级的跃迁可见光红外光来自分子振动和转动能级的跃迁波谱区微波来自分子转动能级及电子自旋能级跃迁无线电波来自原子核自旋能级的跃迁电磁波谱：电磁辐射按波长顺序排列，称~。γ射线→X射线→紫外光→可见光→红外光→微波→无线电波波长长 发射光谱吸收光谱例：γ-射线；x-射线；荧光例：原子吸收光谱，分子吸收光谱 三、光谱法仪器——分光光度计主要特点：五个单元组成光源单色器样品池检测器记录装置 基于被测物质的分子对光具有选择性吸收的特性而建立起来的分析方法,叫吸光光度法.包括：比色法：通过比较有色溶液颜色深浅分光光度法：根据物质对一定波长的光的吸收程度真空紫外光度法：10～200nm（远紫外光）紫外吸光光度法：200400nm（近紫外区）可见吸光光度法：400760nm红外光度法：2.51000m依据物质对不同波长范围光的吸收主要有： 特点灵敏度高：测定下限可达10-5～10-6mol·L-1,10-4%～10-5%准确度能够满足微量组分(<1%)的测定要求:相对误差:1%～5%－操作简便快速应用广泛 波动性粒子性E光的折射光的衍射光的偏振光的干涉光电效应光的波粒二象性一、光的基本性质第二节　紫外-可见分光光度法的基本原理 c－真空中光速：~3.0×108m/s－波长：1m=10-6m,1nm=10-9m,1Å=10-10m－频率，单位：赫兹Hz次/秒波动性υ=c 光是以电磁波形式传播的光子流。电磁波能量大小与波长和频率有关。辐射是量子化的，即不连续地、一份一份地发射或吸收，每一份称一个光子。光子的能量与辐射频率成正比、与波长成反比：E=hυ=hc h－普朗克(Planck)常数6.626×10-34J·s－频率E－光量子具有的能量单位：J(焦耳)，eV(电子伏特)1eV=1.602×10－19J微粒性光是由光子流组成，光子的能量： 结论:一定波长的光具有一定的能量，波长越长(频率越低)，光量子的能量越低.波粒二象性 光谱区间射线x射线紫外光红外光微波无线电波10-2nm10nm102nm104nm0.1cm10cm103cm105cm可见光400～750nm0.1nm～10nm~750nm~0.1cm0.1mm～1m1m～1000m10nm~200nm200~400nm远紫外近紫外（真空紫外） 二、物质对光的选择性吸收单色光复合光单一波长的光由不同波长的光组合而成的光白光青蓝青绿黄橙红紫蓝光的互补 1.吸收光与透射光当复合光照射到物体上时，一部分光被吸收，而另一部分光则被透射过去。即：入射光=吸收光＋透射光吸收光透射光互补 物质的颜色与光的关系完全吸收完全透过吸收黄色光光谱示意光的作用方式表观现象示意复合光 /nm颜色互补光400-450紫黄绿450-480蓝黄480-490绿蓝橙490-500蓝绿红500-560绿红紫560-580黄绿紫580-610黄蓝610-650橙绿蓝650-760红蓝绿不同颜色的可见光波长及其互补光蓝黄紫红绿紫黄绿绿蓝橙红蓝绿 将某物质的溶液，用不同波长的单色光作入射光，测定这一溶液吸光度A。每种波长的单色光都有其相对应的吸光度。然后以A为纵坐标，波长为吸收光谱中与吸收峰对应的波长称为最大吸收波长，maxmax=515A480520560nm2.物质的吸收光谱横坐标作图，所得曲线即为该溶液的吸收光谱。 吸收光谱说明，一种物质对不同波长的光的吸收程度是不同的下图是三（邻二氮菲）合铁配合物的吸收光谱。表明一种物质的不同浓度的溶液，吸收光谱的形状基本相同，最大吸收波长也一样吸收光谱体现了物质的特性：吸收曲线的形状和max是定性分析的基础溶液的浓度愈大吸光度愈大是定量分析的基础 吸收光谱（吸收曲线）：最大吸收最小吸收特征值→定性依据肩峰末端吸收 1.透光率(透射比,Transmittance)透光率定义:T取值为0.0%~100.0%全部吸收T=0.0%全部透射T=100.0%入射光强度I0透射光强度It一束平行单色光二、光吸收的基本定律 2.吸光度(Absorbance)T=0.0%A=∞T=100.0%A=0.0溶液的T越大,说明对光的吸收越小,浓度低;T越小，溶液对光的吸收越大，浓度高1.00.50AcA100500T%TA,T,C三者的关系 例1.有一浓度为C的溶液,T=83.7%,在同样的条件下,浓度为2C的溶液的T%是多少?解:T1=83.3%A1=-logT=-log83.3%=0.0793A2=2A1=0.0793×2=0.159T2=10-A2=10-0.159=69.4%浓度增大一倍时,透光率从T降至T2表明单色光通过吸光介质后,透光率T与浓度之间的关系是指数函数关系. 3.光吸收基本定律:Lambert-Beer定律K--吸光系数b--吸光液层的厚度(光程)，cmc--吸光物质的浓度，g/L,mol/L当一束平行单色光通过均匀、透明的吸光介质时，其吸光度与吸光质点的浓度和吸收层厚度的乘积成正比. 吸光度与光程的关系A=Kbc0.10b0.202b0.00光源检测器显示器参比朗伯定律(1760) 吸光度与浓度的关系A=Kbc0.10c0.202c0.00光源检测器显示器参比比尔定律(1852) 续前 朗伯-比尔定律的适用条件a.单色光应选用max处或肩峰处测定.b.吸光质点形式不变离解、络合、缔合会破坏线性关系,应控制条件(酸度、浓度、介质等). 朗伯-比尔定律的适用条件c.稀溶液浓度增大，分子之间作用增强.d.该定律适用于固体、液体和气体样品e.同一波长下，各组分吸光度具有加和性应用：多组分测定 4、吸光系数和吸收光谱（1）吸光系数的物理意义：单位浓度、单位厚度的吸光度2．吸光系数两种表示法：1）摩尔吸光系数ε：在一定λ下，C=1mol/L，L=1cm时的吸光度2）百分含量吸光系数/比吸光系数：在一定λ下，C=1g/100ml，L=1cm时的吸光度3）两者关系 摩尔吸光系数ε的讨论摩尔吸光系数ε(L·mol-1·cm-1)在数值上等于浓度为1mol/L,液层厚度为1cm时该溶液在某一波长下的吸光度,吸收物质在一定波长和溶剂条件下的特征常数在温度和波长等条件一定时，ε仅与吸收物质本身的性质有关，与待测物浓度无关；同一吸光物质在不同波长下的ε值是不同的。在最大吸收波长λmax处的摩尔吸光系数，以εmax表示表明了该吸收物质最大限度的吸光能力，也反映了光度法测定该物质可能达到的最大灵敏度。 吸光光度法的灵敏度的表示方法>105超高灵敏度=(6～10）×104高灵敏=(2～6)×104中等灵敏度;<2×104不灵敏.越大,灵敏度越高: KKa吸光系数，L·g–1·cm-1c：mol/Lc：g/Lc：g/100mLK比吸光系数,100mL·g-1·cm-1吸光系数(K)入射光波长物质的性质温度与浓度无关,取值与浓度的单位相关摩尔吸光系数，L·mol–1·cm-1 摩尔吸光系数是如何求得的呢？例如：已知含Fe3+浓度为500μg/L的溶液，用KCNS显色，在波长480nm处用2cm比色皿测得吸光度A=0.19，计算摩尔吸光系数。500×10-6[Fe3+]==8.9×10-6（mol/L）55.85A=cbA0.19===1.1×104（L/mol·cm）cb8.9×10-6×2 续前5．吸光度测量的条件选择：1）测量波长的选择：2）吸光度读数范围的选择：3）参比溶液(空白溶液)的选择：选A=0.2~0.7注：采用空白对比消除因溶剂和容器的吸收、光的散射和界面反射等因素对透光率的干扰 溶液浓度的测定A＝bc工作曲线法(校准曲线)01.02.03.04.0c(mg/mL)A。。。。*0.800.600.400.200.00Axcx6．朗伯-比尔定律的分析应用 偏离朗伯—比耳定律的原因标准曲线法测定未知溶液的浓度时，发现：标准曲线常发生弯曲（尤其当溶液浓度较高时），这种现象称为对朗伯—比耳定律的偏离。引起这种偏离的因素（两大类）：（1）物理性因素，即仪器的非理想引起的；（2）化学性因素。 （1）物理性因素单色光不纯，导致负偏差。散射光的影响，胶体、乳浊液或悬浊液由于散射的作用使吸光度增大，或入射光不是垂直通过比色皿（非平行入射光）产生正偏差。为克服非单色光引起的偏离，首先应选择比较好的单色器此外还应将入射波长选定在待测物质的最大吸收波长且吸收曲线较平坦处。 (2)化学性因素吸光质点的相互作用，浓度较大时，产生负偏差，朗伯-比尔定律只适合于稀溶液（C<10-2mol/L)。平衡效应：溶液中存在着离解、聚合、互变异构、配合物的形成等化学平衡时。使吸光质点的浓度发生变化，影响吸光度。例：铬酸盐或重铬酸盐溶液中存在下列平衡：CrO42-＋2H＋=Cr2O72-＋H2O溶液中CrO42-、Cr2O72-的颜色不同，吸光性质也不相同。故此时溶液pH对测定有重要影响。 例1邻二氮菲光度法测铁:(Fe)=1.0mg/L,b=2cm,A=0.38,计算和解：c(Fe)=1.0mg/L=1.0×10-3g/L/55.85g/mol=1.8×10-5mol/L c=1.0mg/L=1.0×10-3g/1000mL=1.0×10-4g/100mL 第三节分光光度计通过棱镜或光栅得到一束近似的单色光.波长可调,故选择性好,准确度高.光源单色器检测系统吸收池记录系统 仪器可见分光光度计 仪器紫外-可见分光光度计 光源：发出所需波长范围内的连续光谱，有足够的光强度,稳定。可见光区：钨灯，碘钨灯(320～2500nm)紫外区：氢灯，氘灯(180～375nm)氙灯：紫外、可见光区均可用作光源/nm钨灯（热辐射光源）4006008001000氙灯（气体放电光源）氢灯强度一、分光光度计的主要部件 氙灯氢灯钨灯 单色器：将光源发出的连续光谱分解为单色光的装置。棱镜:依据不同波长光通过棱镜时折射率不同入射狭缝准直透镜棱镜聚焦透镜出射狭缝白光红紫λ1λ2800600500400 光栅：在镀铝的玻璃表面刻有数量很大的等宽度等间距条痕(600、1200、2400条/mm)。M1M2出射狭缝光屏透镜平面透射光栅光栅衍射示意图原理：利用光通过光栅时发生衍射和干涉现象而分光.波长范围宽,色散均匀,分辨性能好,使用方便 吸收池(比色皿)：用于盛待测及参比溶液。可见光区：光学玻璃池（350～3200nm）紫外区：石英池玻璃（185～4000nm）检流计（指示器）：低档仪器：刻度显示中高档仪器：数字显示，自动扫描记录检测器：利用光电效应，将光能转换成电流讯号。光电池，光电管，光电倍增管 吸光光度法仪器主要差异比较可见光(400～750nm)紫外光(200～400nm)光源钨灯碘钨灯320～2500氢灯氘灯180～375吸收池材料玻璃（350～3200）石英（185～4000） 二、分光光度计的类型1.单光束分光光度计2.双光束分光光度计多通道仪器同时测量200～820nm范围内的整个光谱,比单个检测器快316倍,信噪比增加3161/2倍.3.其他类型分光光度计纤维光度计将光度计放入样品中,原位测量.对环境和过程监测非常重要. 0.575光源单色器吸收池检测器显示单波长单光束分光光度计简单，价廉，适于在给定波长处测量吸光度或透光度，一般不能作全波段光谱扫描，要求光源和检测器具有很高的稳定性。 单波长双光束分光光度计比值光源单色器吸收池检测器显示光束分裂器自动记录，快速全波段扫描。可消除光源不稳定、检测器灵敏度变化等因素的影响，特别适合于结构分析。仪器复杂，价格较高。 2 2.参比溶液的选择试液无吸收,显色剂无吸收试液有吸收,显色剂无吸收试液无吸收,显色剂有吸收试液有吸收,显色剂有吸收 1086420204060800.70.40.20.1AT%Er(36.8)0.434浓度测量的相对误差与T(或A)的关系实际工作中，应控制T在20～65％,A在0.2～0.7之间(调c,b,)3.吸光度读数范围的选择：最佳值最佳读数范围 第四节定性与定量分析定性分析定量分析 一、定性分析二、定量分析定性鉴别纯度检查和杂质限量测定(不介绍)单组分的定量方法多组分的定量方法定性与定量分析 一、定性分析（一）定性鉴别定性鉴别的依据→吸收光谱的特征吸收光谱的形状吸收峰的数目吸收峰的位置（波长）吸收峰的强度相应的吸光系数 续前1．对比吸收光谱的一致性同一测定条件下，与标准对照物谱图或标准谱图进行对照比较 续前2．对比吸收光谱的特征值 续前3．对比吸光度或吸光系数的比值：例： 二、定量分析（一）单组分的定量方法1．吸光系数法2．标准曲线法3．对照法：外标一点法 续前1．吸光系数法（绝对法）在没有标准品可供比较测定的条件下，按文献规定条件测定被测物的吸光度，从样品的配制浓度、测定的吸光度及文献查出的吸光系数即可计算样品的含量. 练习例：维生素B12的水溶液在361nm处的百分吸光系数为207，用1cm比色池测得某维生素B12溶液的吸光度是0.414，求该溶液的浓度解： 练习例：称取B12样品25.0mg，用水溶液配成100ml。精密吸取10.00ml，又置100ml容量瓶中，加水至刻度。取此溶液在1cm的吸收池中，于361nm处测定吸光度为0.507，求B12的百分含量？解： 练习例：解： 续前2．标准曲线法 标准工作曲线法先配制一系列标准溶液，在最大吸收波长处，测出它们的吸光度，作图，同条件测未知液的吸光度，从图中查出未知液的浓度cA标准工作曲线图Axcxc1c2c3c4c5A1A2A3A4A5 示例芦丁含量测定0.710mg/25mL 绘制标准曲线应注意以下几点：（1）按选定浓度，配制一系列不同浓度的标准溶液时，浓度范围应包括未知试样浓度的可能变化范围，一般至少应作四个点。（2）测定时每一浓度至少应同时作两管（平行管），同一浓度平行管测定得到的吸光度值相差不大时，取其平均值管测定得到的吸光度值相差不大时，取其平均值（3）用坐标纸绘制标准曲线。也可用最小二乘法处理，由一系列的吸光度-浓度数据求出回归方程。（4）绘制完标准曲线后应注明测定波长、吸收池厚度、时间等。 微量铁的测定氨基酸的测定邻二氮菲法茚三酮法(紫色化合物)蛋白质的测定考马斯亮蓝法总磷的测定海水中营养盐的测定磷钼蓝法单组分的测定 优点:标准曲线法对仪器的要求不高，是吸收光谱中简单易行的方法。此法在大量样品分析时显得尤其方便，在测定条件固定的情况下，标准曲线可以反复使用。缺点:但仪器搬动或经维修后应重新校正波长、更换新仪器、试剂重新配制、测定时温度改变较大等条件发生变化时，标准曲线就必须重新绘制。 3、标准对照法——根据Lambert-BeerLaw，以该物质吸收光谱图中的max为入射光，首先配制一个与被测溶液浓度相近的标准溶液cS，测其AS，再将样品溶液推入光路，测其AX，则试样溶液的浓度cX为：此法适于非经常性的分析工作，准确度不如标准曲线法。 续前对照法：外标一点法注：当样品溶液与标准品溶液的稀释倍数相同时 练习解：1）对照法例题：维生素B12的含量测定精密吸取B12注射液2.50mL，加水稀释至10.00mL；另配制对照液，精密称定对照品25.00mg，加水稀释至1000mL。在361nm处，用1cm吸收池，分别测定吸光度为0.508和0.518，求B12注射液注射液的浓度以及标示量的百分含量（该B12注射液的标示量为100μg/mL） 练习2）吸光系数法 练习1．取咖啡酸，在165℃干燥至恒重，精密称取10.00mg，加少量乙醇溶解，转移至200mL容量瓶中，加水至刻度线，取此溶液5.00mL，置于50mL容量瓶中，加6mol/L的HCL4mL，加水至刻度线。取此溶液于1cm比色池中，在323nm处测定吸光度为0.463，已知该波长处的，求咖啡酸百分含量 练习解：2．精密称取0.0500g样品，置于250mL容量瓶中，加入0.02mol/LHCL溶解，稀释至刻度。准确吸取2mL，稀释至100mL。以0.02mol/LHCL为空白,在263nm处用1cm吸收池测定透光率为41.7%，其摩尔吸光系数为12000，被测物分子量为100.0，试计算263nm处和样品的百分含量。 目视比色法标准系列未知样品特点利用自然光比较吸收光的互补色光准确度低(半定量)不可分辨多组分方法简便，灵敏度高 1.了解分子对光的吸收.吸收曲线—定性分析的基础。2.掌握光吸收基本定律:朗伯-比尔定律—定量分析的基础A=Kbc=-lgT式中各参数的物理意义，定量计算。3.分光光度计基本部件;4.灵敏度的表示—5.吸光测量条件的选择：波长、浓度、参比的选择6.应用及方法:单一组分测定示例、本章要求 本课小结基本原理仪器主要部件主要应用吸收定律即溶液的吸光度与溶液的浓度和光程的乘积成正比光源　钨灯或碘钨灯、氢灯或氘灯单色器　棱镜或光栅定性鉴别、杂质检查及含量测定紫外∣可见分光光度法吸收池　玻璃或石英吸收池检测器　光电池、光电管、光电倍增管及二极管阵列检测器信号显示系统 课堂练习1、将下列透光度换算成吸光度（1）10％（2）60％（3）100％解：用A表示吸光度，T表示透光度，由公式可得：（1）（2）（3）将下列吸光度值换算为透光率：(1)0.05(2)0.15(3)0.30(4)0.70(5)1.20解：吸光度与透光率为负对数关系：（1）A=0.05，则T=0.89(2)A=0.15，则T=0.71(3)A=0.30，则T=0.50(4)A=0.70，则T=0.20（5）A=1.20，则T=0.063 2、某试液用2cm的比色皿测量时，T=60%，若改用1cm或3cm比色皿，T%及A等于多少？解：由公式。由，当T=60%时，A＝0.22。故当b=1cm时，；同理可得，当b=3cm时，。 3.现取某含铁试液2.00ml定容至100.0ml，从中吸取2.00ml显色定容至50.00ml，用1cm比色皿测得透光率为39.8％，已知显色化合物的ε＝1.1×104L·mol-1·cm-1，求该试液的铁含量为多少g·L-1？（MFe：55.85g·mol-1）解：A＝-lgT＝-lg0.398＝0.400 4、两份不同浓度的某有色配合物溶液，当L=1cm时，其T%分别为(1)甲65.0%(2)乙41.8%求：（1）A甲和A乙（2）当甲的浓度c=6.5×10-4mol/L时，溶液乙的浓度为多少？解：（1）据朗伯—比耳定律A=－lgT=KcLA甲=－lg0.650=0.187A乙=－lg0.418=0.379（2）c甲=6.5×10-4mol/Lc乙=mol/L 5、以丁二酮肟为显色剂。用吸光光度法测Ni2+，当L=2cm时，红色络合物NiR2的浓度为1.7×10-5mol/L，在470nm波长处测得的吸光度为0.523，求ε值。解：据朗伯—比耳定律A=εcLε470=L/（mol·cm） 1.吸光光度法的定量分析的理论依据是（）A.朗白比耳定律B.能斯特方程C.塔板理论D速率方程2.吸光光度法的仪器中，光源的作用是（）A光源的作用是提供所需波长范围内的连续光谱。B.光源的作用是提供激发样品所需的能量。C.光源的作用是提供反应所需的能量。D光源的作用是提供所需的单色光。3..吸光光度法的仪器中，单色器的作用是（）A.单色器的作用是将光源发出的连续光谱分解为最容易被样品溶液吸收的单色光。B.单色器的作用是将光源发出的连续光谱分解为单色光。C.单色器的作用是将光能转换成电流进行测量.。D单色器的作用是盛装吸收试液。选择题 4.吸光光度法的仪器中，吸收池的作用是（）A.吸收池的作用是将光源发出的连续光谱分解为最容易被样液吸收的单色光。B.吸收池的作用是将光源发出的连续光谱分解为单色光。C.吸收池的作用是将光能转换成电流进行测量.。D吸收池的作用是用于盛装吸收试液。5.吸光光度法的仪器中，检测系统的作用是（）A.检测系统的作用是将透过吸收池的光转换成电流进行测量.B.检测系统的作用是将光源发出的连续光谱分解为单色光。C.检测系统的作用是将光能转换成电流进行测量.。D检测系统的作用是用于盛装吸收试液。AAADA 6.吸收光谱曲线是（B）A：吸光度（A）--时间（t）曲线B:吸光度（A）--波长（λ）曲线C:吸光度（A）--浓度（C）曲线D.吸光度（A）-温度(t)曲线 例1现测得氯霉素(M：323.15g／mo1)的水溶液在278nm处有最大吸收，设用纯品配制100ml含氯霉素2.00mg的溶液，用lcm的吸收池，在278nm处测得吸光度为0.614，试求其ε。例2有一浓度为10μg／ml的Fe2+溶液，以邻二氮菲显色后，在波长510nm处，用厚度为2cm的吸收池，测得吸光度A为0.380，计算(1)透光度T；(2)百分吸光系数；(3)摩尔吸光系数ε。 例1现测得氯霉素(M：323.15g／mo1)的水溶液在278nm处有最大吸收，设用纯品配制100ml含氯霉素2.00mg的溶液，用lcm的吸收池，在278nm处测得吸光度为0.614，试求其ε。例2有一浓度为10μg／ml的Fe2+溶液，以邻二氮菲显色后，在波长510nm处，用厚度为2cm的吸收池，测得吸光度A为0.380，计算(1)透光度T；(2)百分吸光系数；(3)摩尔吸光系数ε。'