分光光度法及分光光度计使用方法.ppt

'分光光度法南方医科大学生物化学与分子生物学实验教学中心 内容3分光光度法的原理1如何求被测组分的含量2分光光度计的基本结构分光光度计的使用与注意事项43 分光光度法概念：是利用物质所特有的吸收光谱来鉴别物质或测定其含量的一项技术。特点：灵敏度高、精确度高、操作简便、快速。对于复杂的组分系统，无须分离即可检测出其中所含的微量组分的特点。 分光光度法的原理Lambert定律I0I入射光强度透过光强度LC液层厚度溶液浓度 分光光度法的原理Beer定律I0I入射光强度透过光强度LC液层厚度溶液浓度 分光光度法的原理Lambert-Beer定律＋＝如果同时考虑液层厚度和溶液浓度对光吸收的影响，将Lambert和Beer定律合并，描述物质对单色光吸收强弱与液层厚度和待测物浓度的关系。 分光光度法的原理 如何求被测组分的含量1.利用标准管计算测定物的含量2.利用标准曲线计算测定物含量3.利用标准系数法求出待测溶液的浓度4.利用消光系数法求出待测溶液的浓度 利用标准管计算测定物的含量在相同条件下测定已知浓度（CS）标准液的吸光度（AS），同时也测定末知浓度（CU）的吸光度（AU）， 利用标准曲线计算测定物含量先配制一系列浓度由小到大的标准溶液，分别测出它们的吸光度。然后以各管吸光度（A）为纵坐标，各管的浓度（C）为横坐标，在方格坐标纸上作图。若被测物质对光的吸收符合光的吸收定律，则必然得到一条通过原点的直线，即标准曲线，亦称工作曲线。以后对末知浓度物质测定时，无需再作标准管，据测定管吸光度从标准曲线上即可求得测定物的浓度。 标准曲线(浓度-吸光度曲线）0.20.80.40.6A012345××××根据测定管吸光度从标准曲线上即可求得测定物的浓度。C V-1100型可见光分光光度计 0.000ATCFMODEPRINT0%T100%TA：吸光度T：透射比C：浓度F：斜率MODEATCF切换键PRINT确认键0%T100%T校零、下降键校100、上升键V-1100分光光度计键盘控制的使用说明 V-1100分光光度计操作步骤开机，预热30分钟。转动波长旋钮，调所需波长。按键切换到T档。将黑体放入光路中，合上盖，按键校零,T=000.0。开盖，将参比液按空白液、标准液、待测液顺序放入比色杯架上，拉动比色架拉杆，将空白液放入光路中，合上盖，按键校T=100.0合上盖，按键切换到A档拉动拉杆，将标准、待测液依次放入光路中，即可读取其吸光度A值。重复3次，记录3组数据。读数后，将黑体放入光路中，开盖取出比色杯。将参比液倒回原试管中，清洗比色杯并倒扣在滤纸上晾干关机，盖上防尘盖，登记仪器使用登记本。MODE0%MODE100% V-1100分光光度计使用注意事项注意防震、防潮、防光和防腐蚀。每台仪器所配套的比色皿不能与其他仪器的比色皿单个调换。不可用手指或毛刷摩擦比色杯的透光面。盛装参比液时，达到比色杯的3/4即可，不宜过多，以防溶液溢出。比色杯外壁如有液体，只能用滤纸沾去水份，再用擦镜纸拭净。注意比色杯的清洁，用后应先用自来水冲洗，再用蒸馏水清洗。测试结束要及时登记，仪器有问题及时报告。 操作练习实验材料试剂：CuSO4标准液（8mg/ml）待测CuSO4溶液蒸馏水器材：加样枪、刻度吸管、试管、试管架V-1100型可见光分光光度计 操作练习步骤加入物BSU蒸馏水3ml——CuSO4标准液—3ml—CuSO4待测液——3ml分别取3支试管，做好标记，按下表操作：以空白管B调零，在690nm处，读取标准管S和待测管U吸光度A值，记录3组数据，取平均A值，代入公式计算。 数据处理表格测定管各管测定次数各管平均A值123标准管待测管各管各测定3次，取其平均A值再代入公式计算。 结果计算 南方医科大学生物化学与分子生物学实验教学中心ThankYou!'