微波辅助萃取－分光光度法测定细梗胡枝子叶中总黄酮的含量

'　　微波辅助萃取－分光光度法测定细梗胡枝子叶中总黄酮的含量张帆，齐小花，邹明强，解瑞丽，李锦丰，杨屹，张宏桂【摘要】　　目的采用微波辅助萃取法提取，以分光光度法测定细梗胡枝子叶中的总黄酮含量。方法单因素法优化微波提取条件为：使用75%乙醇，在液固比70ml/g下，加热至75℃后持续辐射15min。结果与传统的乙醇浸提法和超声法相比，微波法具有操作简便，经济可靠，重现性好等特点。结论微波法适合推广应用于各类中草药中总黄酮含量测定的样品前处理。【关键词】微波辅助萃取分光光度法细梗胡枝子总黄酮　　Abstract：ObjectiveToextracttotalflavonesfromLespedezavirgata(Thunb.)DC.bymicroineitscontentbyabsorptionspectroscopy.MethodsTheextractedconditionsofflavonesizedas70ml/gof75%ethanoltoleavesperatureof75℃for15min.Resultsparedocerationandultrasonic-assistedextraction,micropleandaccurateinationofflavoneinmanykindsoftraditionalChinesemedicines.　　Keyicrol容量瓶中，取少量样品溶液，依次加入若干毫升的NaNO2溶液，Al(NO3)3溶液和NaOH溶液，然后用乙醇溶液定容至10ml，于室温下放置10min，用1cm比色皿，以试剂空白为参比，在选定波长下测定其吸光度〔15，16〕。根据标准曲线求得总黄酮的提取率，其计算公式为：提取率(mg/g)＝X×V/m，其中X是从标准曲线上查得的浓度值，V为萃取液体积，m为细梗胡枝子叶的质量。　　3结果　　3.1测定波长的选择取适量总黄酮萃取液进行显色反应，用分光光度计对其红色产物在400～700nm之间扫描，在510nm处有最大吸收，所以确定510nm为测定波长。　　3.2显色反应时间的确定准确吸取一定量样品溶液，按照实验方法在0～60min范围内，每隔5min测定其吸光度考察反应体系的稳定性。由实验结果可以看出，黄酮显色产物在前30min内吸光度基本不变，但在30min后，吸光度开始略有下降，因此其吸光度应控制在定容后前30min内测定。　　3.3标准曲线的建立精确称取芦丁标准品10mg，用75%乙醇水溶液定容至100ml容量瓶中，配好冷藏放置于冰箱中。分别取0.0，0.5，1.0，1.5，2.0，2.5ml标准液于10ml容量瓶中，分别加入一定量的75%乙醇水溶液稀释成5.0ml。加入5%NaNO2溶液0.3ml，摇匀，放置6min；再加入10%的Al(NO3)3溶液0.3ml，摇匀，再放置6min；加4%的NaOH溶液2.0 ml，用水稀释至刻度，放置10min，在分光光度计上，以试剂空白为参比于510nm处测其吸光度，得到回归方程为：A=11.7C-0.0047(r=0.9997)，式中A为吸光度，C为溶液中芦丁的浓度(g/ml)。该方程在所测范围内(5～25g/ml)线性关系良好。　　3.4微波辅助萃取法的单因素实验　　3.4.1乙醇浓度对黄酮提取率的影响　　本文用乙醇溶液作为提取体系，考察了乙醇浓度对微波萃取细梗胡枝子叶中黄酮类物质的影响，结果见图1。由图1可见，总黄酮提取率随乙醇浓度的增大先呈上升趋势，在乙醇浓度为75%时达到最大，之后乙醇浓度再增大时，提取率呈下降趋势，因此考虑选75%乙醇作提取剂为宜。　　3.4.2液固比对黄酮提取率的影响　　在其他条件相同下，不同溶剂用量对黄酮提取率的关系如图2所示。从图2可知，提取率随着液固比的增大而呈上升趋势，但增大到70ml/g后就趋于下降，之后实验中选择液固比为70ml/g。　　3.4.3溶液温度对黄酮提取率的影响　　在其他条件相同下，得黄酮提取率与溶液温度的关系，见图3。由图3可知，75℃以前总黄酮提取率随功率增加呈现上升，75℃后开始下降。因此实验中溶液温度最好控制在75℃。　　3.4.4微波辅助提取时间对黄酮提取率的影响　　在其他条件相同下，考察了黄酮提取率与微波辅助提取时间的关系，见图4。由图4可知，提取率随微波辐射时间的增加而呈现先增加后下降的趋势。从时间效益考虑，微波时间应控制在15min。　　3.5最佳条件下的重复性和回收率实验　　3.5.1重复性实验　　取同一批细梗胡枝子叶样品5份，在最佳条件下进行萃取，分别测定各自的总黄酮含量，结果表明其相对标准偏差为1.79%。　　3.5.2加样回收率实验　　准确称取一定量样品9份，加入不同量的芦丁对照品溶液在相同微波条件下进行萃取，萃取物按实验方法进行显色，测定吸光度，计算回收率，结果表明回收率在99%～102%之间，说明此方法有较好的准确度。　　3.6微波法与乙醇浸提法及超声波萃取法的比较　　本实验应用了乙醇浸提法和超声波萃取法进行对比实验。乙醇浸提法：温度75℃，乙醇浓度75%，液固比35ml/g，连续提取2次，第1次3h，第2次3h，平均提取率为18.4mg/g。超声波提取法：100〕.上海:上海科学技术出版社,1999,4:3243. 　　〔2〕ToshioM,MitsuakiS,HarukoN,etal.AntioxidantsfromLespedezahomoloba(I)〔J〕.Phytochemistry,1999,52:303.　　〔3〕MaximovOB,KuleshNI,StepanenkoLS,etal.NeLespedezavirgata(Thunb.)DC.:Structuralelucidationandantioxidativeactivity〔J〕.BioorganicMedicinalChemistryLetters,2007,17:6311.　　〔6〕王威,闫喜英,王永奇,等.胡枝子属植物化学成分及药理活性研究进展〔J〕.中草药,2000,31(2):144.　　〔7〕GanzlerK.,SzinaiI.,SalgoA..Effectivesamplepreparationmethodforextractingbiologicallyactivepoundsfromdifferentmatricesbyamicroatogr.A,1990,520:257.　　〔8〕董彩玉,郑庆伟,杨屹,等.微波间歇萃取-分光光度法测定三七中总皂苷〔J〕.分析试验室,2007,26(S1):10.　　〔9〕张帆,杨屹,郭振库.微波辅助萃取鬼箭羽叶中芦丁和槲皮素〔J〕.高等学校化学学报,2007,28(8):1480.　　〔10〕颜流水,黄智敏,胡臻恺,等.藜蒿中黄酮类化合物的微波辅助萃取研究〔J〕.分析试验室,2006,25(3):66.　　〔11〕陈雷,杨屹,张新祥,等.密闭微波辅助萃取丹参中有效成分的研究〔J〕.高等学校化学学报,2004,25(1):35.　　〔12〕阮贵华,陈皓,肖小华,等.微波辅助提取-GC/MS联用分析苍耳子中油脂成分的研究〔J〕.分析试验室,2007,26(3):21.　　〔13〕侯翔燕,杨屹,郭振库.微波辅助萃取新鲜芦荟叶中芦荟甙的研究〔J〕.高等学校化学学报,2005,26(9):1627.　　〔14〕杨屹,唐睿,丁明玉.密闭微波辅助萃取天麻中天麻素的研究〔J〕.分析试验室,2004,23(10):9.　　〔15〕云学英,陈其秀,佟杰,等.蒙药珍宝丸Ⅱ,Ⅲ中黄酮类化合物含量分析〔J〕.光谱学与光谱分析,2004,24(1):89.　　〔16〕彭密军,周春山,刘建兰,等. 杜仲中活性成分分析条件的优化研究〔J〕.光谱学与光谱分析,2004,24(12):1655.'