柱层析—分光光度法测定益母草中总黄酮含量论文

'　　柱层析—分光光度法测定益母草中总黄酮含量论文余丹妮，徐德生，冯怡，卫洪昌【摘要】目的建立益母草药材总黄酮含量测定方法，并对药材资源进行初步考察。方法以芦丁为对照品，样品经聚酰胺柱分离纯化，三氯化铝试剂显色后，采用紫外分光光度法在412nm波长处测定总黄酮含量。结果芦丁在4.8～29.0μg/ml范围内与吸光度有良好线性关系.freelethodforthequantitativedeterminationoftotalflavonoidsinHerbaLeonuri,maketheprimeexaminationoftheresources.MethodsThesampleidecolumnforseparationandpurification,andiniumtrichloride,andthen,thecontentofflavoneinthesampleinedatthebyultravioletspectrophotometerl，r=0.9996theaveragerecoveryoftheaddedsampleethodissimpleandaccurate.Itcanbeusedforthequalitycontrol.KeynchromatogramUVspectrophotometry益母草为唇形科益母草属植物LeonurousheterophyllusS左右，后者在410nm或270nm附近。因益母草药材在500 nm处有较多的干扰吸收，且样品溶液中存在的槲皮素、山柰素等黄酮成分，以亚硝酸钠-硝酸铝-氢氧化钠显色后在500nm处吸收较弱或无吸收［8］，因此，采用亚硝酸钠—硝酸铝—氢氧化钠做显色剂并不理想。所以选择三氯化铝为显色剂，芦丁为对照品，进行总黄酮含量测定。2.2除杂条件的确定取益母草药材适量，置索氏提取器中，加三氯甲烷回流提取至提取液无色，三氯甲烷液蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解为供试品溶液A。药渣挥去三氯甲烷，加甲醇继续提取至无色，提取液蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解为供试品溶液B。将以上样品及相应对照品溶液分别点样于聚酰胺薄膜上，先以水展开，水展开后将薄膜取出晾干，再以不同浓度乙醇展开，展开后的聚酰胺薄膜喷以三氯化铝试液，于365nm紫外灯下观察荧光。薄层色谱图见图1～3。薄层预示说明，聚酰胺吸附可去除叶绿素（供试液A部分）。水洗脱和20%乙醇洗脱可去除具有显色干扰的水溶性成分。70%乙醇洗脱可富集总黄酮。2.3药材总黄酮提取方法的比较分别取药材细粉3g，加入甲醇50ml，以回流（45min），索氏提取（至无色），超声（200in）3种方法进行提取，测定吸光度，计算总黄酮得率。结果提取方式选择回流提取。2.4益母草药材中总黄酮的测定 2.4.1对照品溶液的制备精密称取105℃干燥至恒重的芦丁标准品0.0025g置25ml容量瓶中，加60%乙醇溶解定容成0.1mg/ml的溶液，即得。2.4.2供试品溶液的制备取药材细粉3g，精密称定。置圆底烧瓶中，精密加入甲醇60ml，称重，加热回流45min，放冷、静置，再称定重量，用甲醇补足减失重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液30ml置蒸发皿中，水浴蒸干。残渣加少量50%乙醇溶解，水浴挥去1/3体积，加蒸馏水至原体积，混悬，将混悬液过聚酰胺柱（80～100目，1g，内径1cm，湿法装柱）。以20ml水冲洗，弃去水液，再以20%乙醇15ml冲洗，并去醇液。最后，以70%乙醇洗脱，检视黄酮类黄色色带的移动，当色带到达下部时收集洗脱液，将洗脱液收集入25ml容量瓶中，收集至近刻度，加50%乙醇定容，摇匀，作为供试品溶液。2.4.3测定波长的选择取对照品及供试品溶液适量，加入0.1mol/LAlCl3溶液1ml显色30min后在200～800nm进行波长扫描，扫描结果见图4。结果表明，芦丁对照品及样品在273nm处均有最大吸收峰，在412nm处，芦丁有最大吸收，样品吸收强却不显示为最大吸收峰。实验中发现，经聚酰胺除杂后273nm处干扰仍然显著。因此选择412nm为测定波长。2.4.4 线性关系考察精密吸取上述对照品溶液0，0.5，1，1.5，2，2.5，3ml分别置于10ml量瓶中，加0.1mol/LAlCl3溶液1ml，以60%乙醇定容至刻度，放置25min，以1号样品为空白，412nm处测定吸收值。以浓度为横坐标，吸光度为纵坐标绘制标准曲线。计算得回归方程为Y=25.089X+0.0153，r=0.9996，表明对照品在浓度范围4.8～29.0μg/ml与吸光度有良好线性关系。2.4.5精密度实验取一定浓度供试品溶液测定吸光度，连续测定5次，其RSD为0.26%，仪器精密度良好。2.4.6稳定性实验取供试品溶液于室温分别放置5，10，15，20，25，30，35，45，55，65，75，85min测定吸光度，供试品溶液放置25min以后显色完全，且1h内稳定，RSD为0.15%。2.4.7重现性实验精密称取同批样品5份，按含量测定方法进行测定，总黄酮含量平均值为3.25mg。RSD为1.4%，重现性良好。2.4.8加样回收率实验精密称取已知含量的益母草药材细粉5份，分别精密加入芦丁对照品适量，按含量测定项下方法进行测定，平均回收率为102%,RSD为3%。2.4.9样品含量测定取6个不同产地的益母草药材细粉适量，按照标准曲线项下方法在412nm处测定吸光度。计算药材中黄酮含量。结果见表1。表16个地区益母草样本含量测定结果（略） 结果表明，黑龙江产益母草总黄酮含量最高，为3.27mg/g；广西产益母草总黄酮含量最低，为0.7mg/g。提示益母草中有效部位含量与地域、种属、采摘季节等因素有着密切的联系。3讨论3.1聚酰胺薄层预试与药材聚酰胺柱分离结果吻合，实验通过薄层考察了10%，20%，30%乙醇除杂效果，以20%乙醇为最好，洗脱选用60%，70%，80%乙醇进行比较，70%洗脱杂质少，且洗脱剂用量较小，因此，确定以70%乙醇洗脱总黄酮，洗脱用水和乙醇用量均以洗脱液薄层分析确定。3.2关于药材和提取物中总黄酮的含量测定国内报道一直较为混乱，各药材所含黄酮种类不一，在对照品、除杂方式、检测方法等方面应有所选择［9，10］，本实验以聚酰胺精制，除去大量干扰物质，使测定结果更趋合理，此方法可用于益母草药材及总提取物的含量测定。3.3实验中曾对不同的含量测定方法进行比较，以亚硝酸钠-硝酸铝-氢氧化钠显色比以三氯化铝显色测定结果偏高。不同的除杂方式对测定结果也有影响，与氯仿除杂相比，经聚酰胺柱除杂后测得的结果较低。因此，除杂方法和含量测定方法的选择在分光光度法测定总黄酮含量的过程中至关重要。【'