浅析分光光度法、pcr技术、生物芯片技术、膜片钳技术和干细胞技术的原理及在体育实践中的应用

'浅析分光光度法、PCR技术、生物芯片技术、膜片钳技术和干细胞技术的原理及其在体育实践中的应用。作者：石建东（单位：河南大学体育学院专业：运动人体科学）摘要：随着生物科学和生物技术的日益发展，人们越来越重视对生物学研究手段的了解和掌握。作为新世纪的运动生物科学专业的研究者有必要学习DNA重组技术的原理和方法，学会和掌握DNA重组技术。这样才能在将来的体育事业的发展中发挥出自己的知识和能力，更加适应体育事业的发展。关键词：分光光度法PCR技术生物芯片技术膜片钳技术干细胞技术引言：二十一世纪是生物学的世纪，分子生物学作为生物学最前沿的基础学科是生物学类专业通向生物高技术的必修课程，同时也是体育研究工作者必须掌握的基础理论知识。随着人们在分子生物学水平上的研究和学习的深入和广泛展开，除了在分子水平上了解生物学的本质特征外，在分子水平如何进行生物学操作是生物学界共同关心并十分重视的问题，并且也是从事体育科研工作者更加重视的问题。1.现代生物实验技术的概述1.1.分光光度法1.1.1.分光光度法的概念分光光度法是通过测定被测物质在特定波长处或一定波长范围内光的吸收度，对该物质进行定性和定量分析的方法。在分光光度计中，将不同波长的光连续地照射到一定浓度的样品溶液时，便可得到与众不同波长相对应的吸收强度。如以波长（λ）为横坐标，吸收强度（A）为纵坐标，就可绘出该物质的吸收光谱曲线。利用该曲线进行物质定性、定量的分析方法，称为分光光度法，也称为吸收光谱法。用紫外光源测定无色物质的方法，称为紫外分光光度法；用可见光光源测定有色物质的方法，称为可见光光度法。它们与比色法一样，都以Beer-Lambert定律为基础。上述的紫外光区与可见光区是常用的。但分光光度法的应用光区包括紫外光区，可见光区，红外光区。1.1.2.分光光度法的原理核酸具有吸收紫外光线的能力，在波长为260nm的条件下具吸收峰值，而蛋白质在280nm时具有吸收峰值。根据经验数据，纯核酸溶液OD260=1.8~2.0时，认为已达到所要求的纯度。在样品中含有蛋白质等杂质时，会使OD260/OD280的比值下降。用此法测定时，只能区别核酸和蛋白质，而无法区别质粒DNA与染色体DNA及RNA。1.2.PCR技术1.2.1.PCR技术的概念聚合酶链式反应(PolymeraseChainReaction)，简称PCR，是一种分子生物学技术，用于放大特定的DNA片段。可看作生物体外的特殊DNA复制。DNA聚合酶（DNApolymeraseI）最早于1955年发现，而较具有实验价值及实用性的KlenowfragmentofE.Coli则是于70年代的初期由Dr.H.Klenow所发现，但由于此酶不耐高温，高温能使之变性,因此不符合使用高温变性的聚合酶链式反应。现今所使用的酶(简称Taqpolymerase), 则是于1976年从温泉中的细菌（Thermusaquaticus）分离出来的。它的特性就在于能耐高温，是一个很理想的酶，但它被广泛运用则于80年代之后。PCR最初的原始雏形概念是类似基因修复复制，它是于1971年由Dr.KjellKleppe提出。他发表了第一个单纯且短暂性基因复制（类似PCR前两个周期反应）的实验。而现今所发展出来的PCR则于1983由Dr.KaryB.Mullis发展出的，Dr.Mullis当年服务于PE公司，因此PE公司在PCR界有着特殊的地位。Dr.Mullis并于1985年与Saiki等人正式发表了第一篇相关的论文。此后，PCR的运用一日千里，相关的论文发表质量可以说是令众多其它研究方法难望其项背。随后PCR技术在生物科研和临床应用中得以广泛应用，成为分子生物学研究的最重要技术。Mullis也因此获得了1993年诺贝尔化学奖。1.2.2.PCR原理⑴PCR的技术原理。DNA的半保留复制是生物进化和传代的重要途径。双链DNA在多种酶的作用下可以变性解链成单链，在DNA聚合酶的参与下，根据碱基互补配对原则复制成同样的两分子挎贝。在实验中发现，DNA在高温时也可以发生变性解链，当温度降低后又可以复性成为双链。因此，通过温度变化控制DNA的变性和复性，加入设计引物，DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的体外复制。　　但是，DNA聚合酶在高温时会失活，因此，每次循环都得加入新的DNA聚合酶，不仅操作烦琐，而且价格昂贵，制约了PCR技术的应用和发展。发现耐热DNA聚合酶--Taq酶对于PCR的应用有里程碑的意义，该酶可以耐受90℃以上的高温而不失活，不需要每个循环加酶，使PCR技术变得非常简捷、同时也大大降低了成本，PCR技术得以大量应用，并逐步应用于临床。⑵PCR的工作原理。PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：①模板DNA的变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；②模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；③引物的延伸：DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基互补配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链，重复循环变性--退火--延伸三过程就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。1.2.3.影响PCR的因素PCR方法操作简便,但影响因素较多,欲得到好的反应结果,需根据不同的DNA模板,摸索最适条件.现将几种主要影响因素介绍如下:⑴、模板单、双链DNA或RNA都可以作为PCR的样品，若起始材料是RNA，须通过逆转录得到第一条cDNA。虽然PCR可以仅用极微量的样品（甚至是来自单一细胞的DNA），但为了保证反应的特异性，一般还宜用ng量级的克隆DNA、μg水平的染色体DNA或104拷贝的待扩增片段来做起始材料。原料可以是粗制品，但不能混有任何蛋白酶、核酸酶、Taq DNA聚合酶抑制剂以及能结合DNA的蛋白。另外，有的实验者认为，用线性化的或缺刻的DNA比用超螺旋构型的DNA能获得更好的反应结果；虽然有时并没有进行线性化或缺刻的步骤，但因样品已存在有部分这种构型，故PCR亦能成功。⑵、引物引物是决定PCR结果的关键。下列原则有助于引物的合理设计：（1）引物长度以15-30个碱基为宜，（G+C）含量约50%，应尽量避免数个嘌呤或嘧啶的连续排列；（2）避免引物内部形成二级结构，必要时应通过计算机进行结构分析；（3）两个引物之间不应发生互补，特别是在引物3’端，避免形成“引物二聚体”；（4）人工合成的寡聚核苷酸引物最好经过PAGE或离子交换HPLC进行纯化；（5）引物浓度不宜偏离，浓度过高有两个弊端，一是易形成引物二聚体，二是当扩增微量靶目标并且起始材料又比较粗时，容易产生非特异性产物。一般来说，用低浓度引物不仅经济，反应特异性也较好。⑶、Mg2+浓度Mg2+浓度对反应物的特异性及产量有显著影响。浓度过高，使反应特异性降低；浓度过低，使产物产量减少。在各种单核苷酸浓度为200μmol/L时，Mg2+为1.5mmol/L较合适。若样品中含有EDTA或其他螯合物，可适当增加Mg2+的浓度。在高浓度DNA及dNTP条件下进行反应时，也必须相应调节Mg2+的浓度。⑷、dNTP浓度高浓度dNTP易产生错误掺入，而浓度过低，势必降低反应产物的产量。PCR常用50-200μmol/L。四种脱氧单核苷酸的浓度应相同，如果其中任何一种的浓度明显不同于其他几种时（偏高或偏低），就会诱发聚合酶的错误掺入作用，降低合成速度过早终止延伸反应。此外，dNTP能与Mg2+结合，使游离Mg2+降低。因此，dNTP的浓度直接影响到反应中起重要作用的Mg2+浓度。⑸、TaqDNA聚合酶用量在100μl反应液中，一般加入2.5U的酶量，足以达到每分钟延伸1000-4000个核苷酸的掺入速度。酶量过多导致产生非特异性产物。⑹、循环参数PCR程序是把起始材料加热到90℃-95℃，保持短时间使双链DNA（dsDNA）解链，然后冷却到37℃-55℃，使引物同模板上与其相互补链的序列退火，再升温至70℃-75℃，在TaqDNA聚合酶的作用下掺入单核苷酸使引物沿模板延伸。解链不完全是导致PCR失败的最主要原因。用DNA扩增仪时，94℃保持1分钟可使模板的起始物完全变性。若用低于94℃时条件，则需适当延时，但不可过长，因为高温环境对聚合酶活性保持不利。引物与模板退火温度由引物及GC含量决定。一般先用55℃的反应条件，如果在电泳检测时发现有并非所需的产物，则要增加退火温度。短时间退火（1-2分钟）有利于产物的特异性。引物延伸在70℃-75℃保温的时间根据扩增的片段的长短来调节。正常情况下，每分钟可延伸1kb的长度，如果扩增的片段在15bp左右（或者更少），则可免去此步骤，因为退火温度下聚合酶显示出的活性以完成短序列的合成。常规PCR一般为25-40个周期。随着周期次数增加，TaqDNA 聚合酶活性降低、聚合时间延长、引物及单核苷酸减少等原因，反应后期容易发生错误掺入。所以，在满足产物得率的前提下，应尽量减少周期次数。1.3.生物芯片技术1.3.1生物芯片技术简介生物芯片技术是通过缩微技术，根据分子间特异性地相互作用的原理，将生命科学领域中不连续的分析过程集成于硅芯片或玻璃芯片表面的微型生物化学分析系统，以实现对细胞、蛋白质、基因及其它生物组分的准确、快速、大信息量的检测。按照芯片上固化的生物材料的不同，可以将生物芯片划分为基因芯片、蛋白质芯片、细胞芯片和组织芯片。目前，最成功的生物芯片形式是以基因序列为分析对象的“微阵列（microarray）”，也被称为基因芯片（Genechip)或DNA芯片（DNAchip)。1998年6月美国宣布正式启动基因芯片计划，联合私人投资机构投入了20亿美元以上的研究经费。世界各国也开始加大投入，以基因芯片为核心的相关产业正在全球崛起，目前美国已有8家生物芯片公司股票上市，平均每年股票上涨75％，据统计全球目前生物芯片工业产值为10亿美元左右，预计今后5年之内，生物芯片的市场销售可达到200亿美元以上。生物芯片技术通过微加工工艺在厘米见方的芯片上集成有成千上万个与生命相关的信息分子，它可以对生命科学与医学中的各种生物化学反应过程进行集成，从而实现对基因、配体、抗原等生物活性物质进行高效快捷的测试和分析。它的出现将给生命科学、医学、化学、新药开发、生物武器战争、司法鉴定、食品与环境监督等众多领域带来巨大的革新甚至革命。1.3.2.生物芯片技术研究背景原定于2005年竣工的人类30亿碱基序列的测定工作（HumanGenomeProject，基因组计划）由于高效测序仪的引入和商业机构的介入已经完成，。怎样利用该计划所揭示的大量遗传信息去探明人类众多疾病的起因和发病机理，并为其诊断、治疗及易感性研究提供有力的工具，则是继人类基因组计划完成后生命科学领域内又一重大课题。现在，以功能研究为核心的后基因组计划已经悄然走来，为此，研究人员必需设计和利用更为高效的硬软件技术来对如此庞大的基因组及蛋白质组信息进行加工和研究。建立新型、高效、快速的检测和分析技术就势在必行了。这些高效的分析与测定技术已有多种，如DNA质谱分析法，荧光单分子分析法，杂交分析等。其中以生物芯片技术为基础的许多新型分析技术发展最快也最具发展潜力。早在1988年，Bains等人就将短的DNA片段固定到支持物上，以反向杂交的方式进行序列测定。当今，随着生命科学与众多相关学科（如计算机科学、材料科学、微加工技术、有机合成技术等）的迅猛发展，为生物芯片的实现提供了实践上的可能性。生物芯片的设想最早起始于80年代中期，90年代美国Affymetrix公司实现了DNA探针分子的高密度集成，即将特定序列的寡核苷酸片段以很高的密度有序地固定在一块玻璃、硅等固体片基上，作为核酸信息的载体，通过与样品的杂交反应获取其核酸序列信息。生物芯片由于采用了微电子学的并行处理和高密度集成的概念，因此具有高效、高信息量等突出优点。1.3.3.生物芯片技术检测的原理 荧光标记和检测是利用荧光标记的DNA碱基在不同的波长下吸收和发射光。在微阵列分析中，多色荧光标记可以在一个分析中同时对二个或多个生物样品进行多重分析，多重分析能大大地增加基因表达和突变检测结果的准确性，排除芯片与芯片间的人为因素。荧光为基础的分析使得利用一些先进的数据获得技术成为可能，包括共聚焦扫描的CCD照相技术。用于芯片制备的无孔基质表面使得芯片检测中的生化反应大大受益。玻璃基质所需的反应体积（5-200ul）比传统的分析要小的多（5-50ml），小反应体积降低了试剂的消耗，增加了微阵列分析中核酸的反应物的浓度（0.1-1um）,相对于传统分析（0.1-4pm）增加100000倍之多，浓度的增加又能加速杂交的速度，从而减少获得强荧光信号的时间，并可用盖玻片封闭杂交槽进行杂交反应。对于以核酸杂交为原理的检测技术，主要过程为：首先用生物素标记经扩增（也可使用其它放大技术）的靶序列或样品然后再与芯片上的大量探针进行杂交。用链霉亲和素(streptavidin)偶联的荧光素（常用的荧光素还有lassamine和phycoerythrin）作为显色物质，图象的分析则用落谢荧光显微镜、激光共聚焦显微镜或其它荧光显微装置对片基扫描，由计算机收集荧光信号，并对每个点的荧光强度数字化后进行分析。由于完全正常的Watson-Crick配对双链要比具有错配(mismatch)碱基的双链分子具有较高的热力学稳定性，所以，前者的荧光强度要比后者强出5-35%。从这一点来说，该检测方法是具有一定特异性的，而且荧光信号的强度还与样品中靶分子含量呈一定的线性关系。1.3.4.生物芯片技术的应用意义对来源于不同个体（正常人与患者）、不同组织、不同细胞周期、不同发育阶段、不同分化阶段、不同病变、不同刺激（包括不同诱导、不同治疗阶段）下的细胞内的mRNA或逆转录后产生的cDNA与表达谱基因芯片进行杂交，可以对这些基因表达的个体特异性、组织特异性、发育阶段特异性、分化阶段特异性、病变特异性、刺激特异性进行综合的分析和判断，迅速将某个或几个基因与疾病联系起来，极大地加快这些基因功能的确立，同时进一步研究基因与基因间相互作用的关系。所以，无论何种研究领域，利用表达谱基因芯片可以获得大量与研究领域相关的基因，使研究更具目的性和系统性，同时也拓宽研究领域1.4膜片钳技术1.4.1.膜片钳技术概述膜片钳技术又称单通道电流记录技术，研究离子通道的一种电生理技术，是施加负压将玻璃微电极的尖端(开口直径约1μm)与细胞膜紧密接触，形成高阻抗封接，可以精确记录离子通道微小电流。能制备成细胞贴附、内面朝外和外面朝内三种单通道记录方式，以及另一种记录多通道的全细胞方式。　1976年德国马普生物物理化学研究所Neher和Sakmann首次在青蛙肌细胞上用双电极钳制膜电位的同时，记录到ACh激活的单通道离子电流，从而产生了膜片钳技术。1980年Sigworth等在记录电极内施加5-50cmH2O的负压吸引，得到10-100GΩ的高阻封接（Giga-seal），大大降低了记录时的噪声实现了单根电极既钳制膜片电位又记录单通道电流的突破。1981年Hamill和Neher等对该技术进行了改进，引进了膜片游离技术和全细胞记录技术，从而使该技术更趋完善，具有1pA的电流灵敏度、1μm的空间分辨率和10μs的时间分辨率。1983年10月，《Single-ChannelRecording》一书问世，奠定了膜片钳技术的里程碑。Sakmann和Neher也因其杰出的工作和突出贡献，荣获1991年诺贝尔医学和生理学奖。1.4.2.膜片钳技术原理膜片钳技术是用玻璃微电极吸管把只含1-3个离子通道、面积为几个平方微米的细胞膜通过负压吸引封接起来，由于电极尖端与细胞膜的高阻封接，在电极尖端笼罩下的那片膜事实上与膜 的其他部分从电学上隔离，因此，此片膜内开放所产生的电流流进玻璃吸管，用一个极为敏感的电流监视器（膜片钳放大器）测量此电流强度，就代表单一离子通道电流。膜片钳技术的建立，对生物学科学特别是神经科学是一资有重大意义的变革。这是一种以记录通过离子通道的离子电流来反映细胞膜单一的（或多个的离子通道分子活动的技术。些技术的出现自然将细胞水平和分子水平的生理学研究联系在一起，同时又将神经科学的不同分野必然地融汇在一起，改变了既往各个分野互不联系、互不渗透，阻碍人们全面认识能力的弊端。1.5干细胞技术1.5.1.干细胞概述干细胞(stemcells,SC)是一类具有自我复制能力(self-renewing)的多潜能细胞，在一定条件下，它可以分化成多种功能细胞。根据干细胞所处的发育阶段分为胚胎干细胞(embryonicstemcell，ES细胞)和成体干细胞(somaticstemcell)。根据干细胞的发育潜能分为三类：全能干细胞(totipotentstemcell,TSC)、多能干细胞（pluripotentstemcell）和单能干细胞（unipotentstemcell）。干细胞(StemCell)是一种未充分分化，尚不成熟的细胞，具有再生各种组织器官和人体的潜在功能，医学界称为“万用细胞”。1.5.2.干细胞技术的基本原理干细胞技术的兴起，得益于生物技术和医学工程的飞速发展。其基本原理是利用干细胞的可塑性。胚胎干细胞是最原始的细胞，它具有与胚胎细胞相似的形态特征及分化潜能。在饲养层上或含有白血病抑制因子或分化抑制因子的培养基中培养时保持未分化状态，但在适当条件下可被诱导分化。在这种细胞注入受体胚胎时，能参与各种组织器官发育，形成嵌合体。正是由于这些特征，胚胎干细胞具有分化为一切细胞的潜能。多能干细胞和专能干细胞也具有分化为相应细胞的能力。要获得所需的各级细胞，首先是干细胞的分离、获取，在适宜的条件下进行培养，然后诱导分化为目的细胞。马岚等报道了猕猴胚胎干细胞的分离培养和鉴定。赵宇等报道了人骨髓间充质干细胞复合新型生物材料向软骨分化的实验研究。特定条件下成体干细胞在许多组织和器官产生新的干细胞，或者按一定的程序分化形成新的功能细胞。成体干细胞经常位于特定的微环境中，微环境中的间质细胞能够产生一系列生长因子或配体与干细胞相互作用，控制干细胞的更新和分化。1.5.3.干细胞研究的意义分化后的细胞，往往由于高度分化而完全丧失了再分化的能力，这样的细胞最终将衰老和死亡。然而，动物体在发育的过程中，体内却始终保留了一部分未分化的细胞，这就是干细胞。干细胞又叫做起源细胞、万用细胞，是一类具有自我更新和分化潜能的细胞。可以这样说，动物体就是通过干细胞的分裂来实现细胞的更新，从而保证动物体持续生长发育的。　　干细胞根据其分化潜能的大小，可以分为两类：全能干细胞和组织干细胞。前者可以分化、发育成完整的动物个体，后者则是一种或多种组织器官的起源细胞。人的胚胎干细胞可以发育成完整的人，所以属于全能干细胞。　　早在19世纪，发育生物学家就知道，卵细胞受精后很快就开始分裂，先是1个受精卵分裂成2个细胞，然后继续分裂，直至分裂成有16至32个细胞的细胞团，叫做桑椹胚。这时如果将组成桑椹胚的细胞一一分开，并分别植入到母体的子宫内，则每个细胞都可以发育成一个完整的胚胎。这种细胞就是胚胎干细胞，属于全能干细胞。骨髓、脐带、胎盘和脂肪 中则可以获取组织干细胞。每个人的体内都有一些终生与自己相伴的干细胞。但是，人的年龄越大，干细胞就越少。为了弥补干细胞的不足，一些科学家建议从胚胎或胎儿以及其他动物身上获取干细胞。进行培养和研究。　　干细胞的用途非常广泛，涉及到医学的多个领域。目前，科学家已经能够在体外鉴别、分离、纯化、扩增和培养人体胚胎干细胞，并以这样的干细胞为“种子”，培育出一些人的组织器官。干细胞及其衍生组织器官的广泛临床应用，将产生一种全新的医疗技术，也就是再造人体正常的甚至年轻的组织器官，从而使人能够用上自己的或他人的干细胞或由干细胞所衍生出的新的组织器官，来替换自身病变的或衰老的组织器官。假如某位老年人能够使用上自己或他人婴幼儿时期或者青年时期保存起来的干细胞及其衍生组织器官，那么，这位老年人的寿命就可以得到明显的延长。美国《科学》杂志于1999年将干细胞研究列为世界十大科学成就的第一，排在人类基因组测序和克隆技术之前。　　新加坡国立大学医院和中央医院通过脐带血干细胞移植手术，根治了一名因家族遗传而患上严重的地中海贫血症的男童，这是世界上第一例移植非亲属的脐带血干细胞而使患者痊愈的手术。医生们认为，脐带血干细胞移植手术并不复杂，就像给患者输血一样。由于脐带血自身固有的特性，使得用脐带血干细胞进行移植比用骨髓进行移植更加有效。现在，利用造血干细胞移植技术已经逐渐成为治疗白血病、各种恶性肿瘤放化疗后引起的造血系统和免疫系统功能障碍等疾病的一种重要手段。科学家预言，用神经干细胞替代已被破坏的神经细胞，有望使因脊髓损伤而瘫痪的病人重新站立起来；不久的将来，失明、帕金森氏综合症、艾滋病、老年性痴呆、心肌梗塞和糖尿病等绝大多数疾病的患者，都可望借助干细胞移植手术获得康复。　　同胚胎干细胞相比，成人身体上的干细胞只能发育成20多种组织器官，而胚胎干细胞则能发育成几乎所有的组织器官。但是，如果从胚胎中提取干细胞，胚胎就会死亡。因此，伦理道理问题就成为当前胚胎干细胞研究的最大问题之一。美国政府明确反对破坏新的胚胎以获取胚胎干细胞，美国众议院甚至提出全面禁止胚胎干细胞克隆研究的法案。美国的一些科学家则对此提出了尖锐的批评，他们认为，将干细胞用于医学研究，在减轻患者痛苦方面很有潜力。如果浪费这样一个绝好的机会，结果将是悲剧性的。　　我国的干细胞研究和应用已经具备了一定的基础，早在20世纪60年代就开始了骨髓干细胞移植方面的研究，目前研究和应用得最多的是造血干细胞。1992年，我国内地第一个骨髓移植非亲属供者登记组在北京成立，“中华骨髓库”也正式接受捐赠。2002年，北京建立了脐带血干细胞库。关于胚胎干细胞的研究，我国目前还没有明确的法律规定。　2009年，国家干细胞工程技术研究中心医学转化基地在上海成立，干细胞技术进入临床应用阶段。1.现代生物实验技术在体育实践中的应用2.1.分光光度技术在体育比赛中兴奋剂违禁药品检测中的应用⑴、测定溶液中物质的含量 　　可见或紫外分光光度法都可用于测定溶液中物质的含量。测定标准溶液（浓度已知的溶液）和未知液（浓度待测定的溶液）的吸光度，进行比较，由于所用吸收池的厚度是一样的。也可以先测出不同浓度的标准液的吸光度，绘制标准曲线，在选定的浓度范围内标准曲线应该是一条直线，然后测定出未知液的吸光度，即可从标准曲线上查到其相对应的浓度。　　含量测定时所用波长通常要选择被测物质的最大吸收波长，这样做有两个好处：①灵敏度大，物质在含量上的稍许变化将引起较大的吸光度差异；②可以避免其它物质的干扰。　　⑵、用紫外光谱鉴定化合物　　使用分光光度计可以绘制吸收光谱曲线。方法是用各种波长不同的单色光分别通过某一浓度的溶液，测定此溶液对每一种单色光的吸光度，然后以波长为横座标，以吸光度为纵座标绘制吸光度──波长曲线，此曲线即吸收光谱曲线。各种物质有它自己一定的吸收光谱曲线，因此用吸收光谱曲线图可以进行物质种类的鉴定。当一种未知物质的吸收光谱曲线和某一已知物质的吸收光谱曲线开关一样时，则很可能它们是同一物质。一定物质在不同浓度时，其吸收光谱曲线中，峰值的大小不同，但形状相似，即吸收高峰和低峰的波长是一定不变的。紫外线吸收是由不饱和的结构造成的，含有双键的化合物表现出吸收峰。紫外吸收光谱比较简单，同一种物质的紫外吸收光谱应完全一致，但具有相同吸收光谱的化合物其结构不一定相同。除了特殊情况外，单独依靠紫外吸收光谱决定一个未知物结构，必须与其它方法配合。紫外吸收光谱分析主要用于已知物质的定量分析和纯度分析。2.2.PCR技术在基因选材中的应用随着分子遗传学研究的进展,人们已经认识到不同的基因背景可以造成某些疾病不同的易感性，形成不同的体质，进而影响个人的运动能力。对于人类基因多态性的研究可以了解各种基因的不同基因型在人群中的分布,有助于我们从基因水平更深刻的阐明不同种族、不同人群的体质和运动能力不同的原因和内在机制。有本研究曾经报道了中国北方汉族人ATP1A2基因第23外显子SNP/G772A的分布频率，并发现中国北方汉族人772G等位基因的分布频率与欧美等其他种族人群有极其显著性差异。研究发现，中国北方汉族人群的772G等位基因频率为0.84，而美国新泽西人为0.75，高加索人为0.79，中国北方汉族人的772G等位基因频率极其显著性的高于这些人种（P<0.01）；但加拿大魁北克人的772G等位基因频率为0.82，与中国北方汉族人相比没有显著性差异（P>0.05），与美国新泽西人种有极其显著性差异（P<0.01），这说明人类ATP1A2基因第23外显子多态分布频率与其他种族存在人种和地域上的差别，这些差异的出现可能与种族进化，人类迁移及自然淘汰有关。此外，有研究曾经确定了ATP1A2BglIIexon(21-22)多态位点的位置在ATP1A2基因第23外显子3’非编码区772碱基处，并使用了PCR-RLFP的方法对ATP1A2基因第23外显子SNP/G772A多态位点进行研究，经测序检验后证明，这种方法准确性高而且更易于操作，为以后该位点的相关研究提供了新的实验手段。有研究选取转铁蛋白基因Exon15SNP/C1765T位点，用PCR-RFLP方法对123名中国汉族优秀长跑运动员与206名中国汉族普通大学生进行基因型与等位基因的比较分析，探寻优秀长跑运动员是否具有与普通人对照组不同的基因型分布频率特征；并通过102名中国汉族士兵18周5000米长跑的耐力训练，比较不同基因型个体训练前后有氧耐力相关表型、左心室结构与功能指标的变化，探寻转铁蛋白基因多态性与耐力训练效果的关联性。最终确定转铁蛋白基因多态性可否作为长跑运动员基因选材的分子生物学指标。2.3.生物芯片技术在生命科学中的应用DNA测序技术的快速发展使得人类或其他物种的基因组序列破译成为可能，这些序列的功能和序列之间的相互关系，构成了一个庞大的复杂网络。传统的方法只能分析小范围基 因的表达和功能，生物芯片技术为进行大规模的研究提供了一种高通量的分析方法。经过近20年的探索和发展，生物芯片技术已经积累了大量数据．以其快速、准确、高通量的特点推动了生命科学研究、医学研究和检疫检验等领域的进展。生物芯片在生命科学研究中的应用根据遗传学的中心法则，人体的遗传信息从DNA，传递到RNA．再翻译成蛋白质，发挥其功能。生物芯片在遗传信息传递的各个阶段中都有应用。在RNA水平即基因的表达水平．利用基因芯片技术研究在细胞和个体发育、疾病的发生过程中基因的表达变化，建立全基因组表达谱。如采用基因芯片研究白血病的ALL和AML型样本。获得了两种不同型的白血病的特征型谱。为临床疾病分子分型提供了依据：荷兰癌症研究所利用表达谱芯片对乳腺癌患者5年内的转移情况进行了分子水平的分型工作，研究结果显示可以利用基因表达谱的差异来预测预后情况。成为用表达谱对疾病进行分子分型和预后研究的经典案例。2006年根据这项研究成果生产的表达谱芯片成为第一张通过FDA批准进入临床使用的表达谱芯片，迈出了生物芯片从实验室走向临床的第一步。生物芯片在检测基因组结构变异方面也有广泛的应用。SNP是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起DNA序列多态性，是人类可遗传的变异中最常见的一种。占所有已知多态性的90％以上。SNP被认为是一种能稳定遗传的早期突变，与疾病有着稳定的相关性。因此研究者期望应用高密度的SN图谱．用相关分析的方法来定位一系列多基因疾病，如糖尿病、高血压、哮喘、癌症等的主基因。针对大规模SNP筛选的需要，Affymetrix公司、IUumina公司等开发了高密度SNP检测芯片．一次实验可以对数万个至百万个SNP进行分析．已经用于基因的连锁分析和疾病相关的SNP的筛选。基因芯片也可用于研究表观遗传学的改变，检测microRNA的表达．研究DNA与蛋白的相互作用，建立DNA的调控网络．在全基因组水平检测DNA甲基化改变。如：Meier等采用ChIP—chip实验方法，检测到了发生DNA损伤时，相应的修复因子在DNA上的分布。。Guenthe等用ChIP-chip实验发现基因的转录起始可能不是特异的．大多数的人类基因包括原来被证明转录失活的编码基因都能启动转录，细胞通过对基因组的修饰来控制转录的延伸过程，从而达到调控基因转录的目的。2008年Lupien等用ChiP—chip和一系列的实验，证实了基因组表观遗传学修饰能调控FoxA1，通过FoxA1改变染色质的结构，从而控制基因的组织特异性表达。2.4.膜片钳技术在运动生理学研究中的应用　膜片钳技术发展至今，已经成为现代细胞电生理的常规方法，它不仅可以作为基础生物医学研究的工具，而且直接或间接为临床医学研究服务。目前膜片钳技术广泛应用于神经（脑）科学、心血管科学、药理学、细胞生物学、病理生理学、中医药学、植物细胞生理学、运动生理等多学科领域研究。　　随着全自动膜片钳技术（Automaticpatchclamptechnology）的出现，膜片钳技术因其具有的自动化、高通量特性，在药物研发、药物筛选中显示了强劲的生命力。 　使用的标本种类繁多。从最早的肌细胞（心肌、平滑肌、骨骼肌）、神经元和内分泌细胞发展到血细胞、肝细胞、耳窝毛细胞、胃壁细胞、上皮细胞、内皮细胞、免疫细胞、精母细胞等多种细胞；从急性分散细胞和培养细胞（包括细胞株）发展到组织片（如脑片、脊髓片）乃至整体动物；从蜗牛、青蛙、蝾螈、爪蟾卵母细胞发展到鸡细胞、大鼠细胞、人细胞等等；从动物细胞发展到细菌、真菌以及植物细胞。此外，膜片钳技术还广泛地应用到平面双分子层（Planarbilayer）、脂质体（Liposome）等人工标本上。　　研究对象已经不局限于离子通道。从对离子通道（配体门控性、电压门控性、第二信使介导的离子通道、机械敏感性离子通道以及缝隙连接通道等等）的研究发展到对离子泵、交换体以及可兴奋细胞的胞吞、胞吐机制的研究等。　　(1).膜片钳技术在通道研究中的重要作用　　应用膜片钳技术可以直接观察和分辨单离子通道电流及其开闭时程、区分离子通道的离子选择性、同时可发现新的离子通道及亚型，并能在记录单细胞电流和全细胞电流的基础上进一步计算出细胞膜上的通道数和开放概率，还可以用以研究某些胞内或胞外物质对离子通道开闭及通道电流的影响等。同时用于研究细胞信号的跨膜转导和细胞分泌机制。结合分子克隆和定点突变技术，膜片钳技术可用于离子通道分子结构与生物学功能关系的研究。　　利用膜片钳技术还可以用于药物在其靶受体上作用位点的分析。如神经元烟碱受体为配体门控性离子通道，膜片钳全细胞记录技术通过记录烟碱诱发电流，可直观地反映出神经元烟碱受体活动的全过程，包括受体与其激动剂和拮抗剂的亲和力，离子通道开放、关闭的动力学特征及受体的失敏等活动。使用膜片钳全细胞记录技术观察拮抗剂对烟碱受体激动剂量效曲线的影响，来确定其作用的动力学特征。然后根据分析拮抗剂对受体失敏的影响，拮抗剂的作用是否有电压依赖性、使用依赖性等特点，可从功能上区分拮抗剂在烟碱受体上的不同作用位点，即判断拮抗剂是作用在受体的激动剂识别位点，离子通道抑或是其它的变构位点上。　　(2).与药物作用有关的心肌离子通道　　心肌细胞通过各种离子通道对膜电位和动作电位稳态的维持而保持正常的功能。近年来，国外学者在人类心肌细胞离子通道特性的研究中取得了许多进展，使得心肌药理学实验由动物细胞模型向人心肌细胞成为可能。　　(3).对离子通道生理与病理情况下作用机制的研究　　通过对各种生理或病理情况下细胞膜某种离子通道特性的研究，了解该离子的生理意义及其在疾病过程中的作用机制。如对钙离子在脑缺血神经细胞损害中作用机制的研究表明，缺血性脑损害过程中，Ca2+介导现象起非常重要的作用，缺血缺氧使Ca2+通道开放，过多的Ca2+进入细胞内就出现Ca2+超载，导致神经元及细胞膜损害，膜转运功能障碍，严重的可使神经元坏死　　(4).对单细胞形态与功能关系的研究　　将膜片钳技术与单细胞逆转录多聚酶链是反应技术结合，在全细胞膜片钳记录下，将单细胞内容物或整个细胞（包括细胞膜）吸入电极中，将细胞内存在的各种mRNA全部快速逆转录成cDNA，再经常规PCR扩增及待检的特异mRNA的检测，借此可对形态相似而电活动不同的结果做出分子水平的解释或为单细胞逆转录多聚酶链式反应提供标本，为同一结构中形态非常相似但功能不同的事实提供分子水平的解释。目前国际上掌握此技术的实验室较少，我国北京大学神经科学研究所于1994年在国内率先开展。 　　(5).对药物作用机制的研究　　在通道电流记录中，可分别于不同时间、不同部位（膜内或膜外）施加各种浓度的药物，研究它们对通道功能的可能影响，了解那些选择性作用于通道的药物影响人和动物生理功能的分子机理。这是目前膜片钳技术应用最广泛的领域，既有对西药药物机制的探讨，也广泛用在重要药理的研究上。如开丽等报道细胞贴附式膜片钳单通道记录法观测到人参二醇组皂苷可抑制正常和“缺血”诱导的大鼠大脑皮层神经元L-型钙通道的开放，从而减少钙内流，对缺血细胞可能有保护作用。陈龙等报道采用细胞贴附式单通道记录法发现乌头碱对培养的Wistar大鼠心室肌细胞L-型钙通道有阻滞作用。　　(6).在心血管药理研究中的应用　　随着膜片钳技术在心血管方面的广泛应用，对血管疾病和药物作用的认识不仅得到了不断更新，而且在其病因学与药理学方面还形成了许多新的观点。正如诺贝尔基金会在颁奖时所说：“Neher和Sadmann的贡献有利于了解不同疾病机理，为研制新的更为特效的药物开辟了道路”。　　(7).创新药物研究与高通量筛选　　目前在离子通道高通量筛选中主要是进行样品量大、筛选速度占优势、信息量要求不太高的初级筛选。最近几年，分别形成了以膜片钳和荧光探针为基础的两大主流技术市场。将电生理研究信息量大、灵敏度高等特点与自动化、微量化技术相结合，产生了自动化膜片钳等一些新技术。1.5.干细胞技术在运动医学领域中的应用。干细胞技术的研究对治疗运动员的损伤无疑具有重大意义，对重大运动性损伤的治疗如脊髓损伤、肌肉损伤、心肌损伤、骨及软骨和肌腱与韧带损伤等具有潜在的应用治疗价值。但它还有一段很长的路要走，如必须克服所谓的免疫排斥问题，探讨最佳的生长增殖和诱导分化条件等，仍是世界范围内亟待解决的问题。当前对于干细胞的分离和培养技术获得了重大的进展，利用单克隆免疫吸附能识别细胞类型或细胞谱系的表面抗原，其分离纯度和细胞活力都很高。1）干细胞技术是近年来迅速发展起来的一门学科，在医学领域已经得到深入的研究，并且在临床医疗方面得到广泛的应用，但还存在较多的问题。2）干细胞技术可以应用在运动医学领域，骨髓间质干细胞可以修复骨组织和肌腱，韧带等，免疫排斥反应小，但治疗周期长，还存在费用较高，寻找适合人体的干细胞载体骨架难等问题。3）干细胞技术可以治疗半月板的损伤，可以解决半月板缺血区损伤带来的问题，既可以修复再生组织，又能使半月板保持原来的生物功能。4）干细胞技术也可以治疗心肌缺血引发的细胞调亡，保护心脏功能。但是任何高科技都是一把双刃剑，在给人类带来无限益处的同时，干细胞技术也存在一些隐患，随着干细胞技术的日益成熟，难免会出现一些另人担忧的事情，假如人们利用干细胞技术制造干细胞兴奋剂，把动物界跳高、跳远、长跑冠军的干细胞移植到运动员身上，以提高他们的成绩。这将存在一系列的伦理道德问题，并且有违“公平竞争”的奥运精神，如何对他们进行检测将是一个重大的研究课题。参考文献：[1]主编冯玉红现代仪器分析实用教程北京大学出版社2008年1月第1版 [2]主编邢婉丽程京生物芯片技术实验教程清华大学出版社2006年1月第1版[3]主编黄静陆泉枝现代生物技术实验讲义华东师范大学生命科学学院2007年9月[4]分子生物学实验技术手册主编江南大学生物工程学院生物系统与生物加工工程研究室2007年12月[5]主编杨轶群曹银祥功能学科实验教程复旦大学上海医学院功能学科教学实验室[6]主编聂尚海时荧光定量PCR技术在医疗方面的应用东胜创新生物科技有限公司[7]主编肖华胜张春秀生物芯片技术的发展与应用生物产业技术2010-02（3月）[8]主编郭勇力于岱峰运动人体科学实验教程中国文史出版社2003年12月第1版（收稿时间2010-7-1）'