分光光度法测定水体叶绿素a含量的测量不确定度分析

'仲恺农业技术学院学报,16(3):25～32,2003JournalofZhongkaiAgrotechnicalCollege文章编号:1006-0774(2003)03-0025-08分光光度法测定水体叶绿素a含量的测量不确定度分析余文永,胡迪琴,年冀,黎映雯,朱大明(广州市环境监测中心站,广东广州510030)摘要:采用分光光度法测定湖泊、水库水体中叶绿素a含量,评定其测量不确定度.根据水体中藻类数量的多寡,按1L和0.1L2个采样量采样.影响水体叶绿素a测量不确定度的因素包括分析取样量、样品前处理、仪器吸光度读数、玻璃量具、比色皿光程等.按照测量不确定度的传播规律建立数学模式,通过对各标准不确定度分量分析计算,求出合成不确定度(uc)和扩展不确定度33(U).结果表明,样品量在1L和0.1L时,U分别为0.214mg/m和2.32mg/m.关键词:分光光度法;叶绿素a;水体;测量不确定度中图分类号:X173文献标识码:A一切测量都不可避免地存在不确定度.20多年来,国外在测量不确定度的评定方面做了[1]大量的工作,国际标准化组织(ISO)于1993年发布了测量不确定度的评定标准.为了适应全球经济一体化发展的需求,20世纪90年代末,我国在检测和校准领域亦引用不确定度概[2,3]念,取代传统的误差评定,并颁布了相应的评定标准.中国实验室国家认可委员会按ISO/IEC17025《校准和检测实验室能力的通用要求》对校准和检测实验室认可时,亦有测量[4]不确定度的评定要求.某一检测项目的测量不确定度是实验室经过评定给出,测量不确定度在某种程度上能反映实验室的分析水平.目前,水体叶绿素a含量的测量不确定度分析尚未见有报道.作者通过分析水体叶绿素a含量的测量不确定度,找出影响测量不确定度的因素,给出不确定度,如实反映测量的置信度和准确性.1测量方法[5～7]按浮游植物采样方法采样,水库水样品量为1L,湖泊、池塘水为011L.用玻璃纤维滤膜浓缩水样,并将滤膜样品置于4℃以下冰箱6～8h,用体积分数90%的丙酮研磨提取叶绿素a,加入少量碳酸镁粉防止酸化,然后3000～4000r/min离心10min,取上清液,再提取1次,用体积分数90%的丙酮定容至10ml.取上清液以体积分数90%的丙酮作参比,在722收稿日期:2003-02-23作者简介:余文永(1972-),男,广东饶平人,助理工程师. 26仲恺农业技术学院学报第16卷型光栅分光光度计上分别读取750、663、645、630nm波长处的吸光度,根据下列公式(1)计算叶绿素a含量.[11164(D663-D750)-2116(D645-D750)+0110(D630-D750)]×V1C=(1)V2δ3式中:C为叶绿素a含量(mg/m);V2为样品体积(L);D为吸光度;V1为定容体积(ml);δ为比色皿光程(cm).2建立数学模型由公式(1)可见,被测样品叶绿素a浓度C的合成不确定度,来源于4个波长的吸光度、定比体积(比色管)、样品体积(容量瓶)和比色皿光程的不确定度.由不确定度的传播规律得出被测量叶绿素a含量C的合成不确定度uc(C)的方差,见公式(2).222229C29C29C29Cuc(C)=×u(D750)+×u(D663)+×u(D645)+×9D7509D6639D6459D63022229C29C29C2u(D630)+×u(V1)+×u(V2)+×u(δ)(2)9V19V29δ式中:uc(C)为样品中叶绿素a含量测定的合成不确定度;u(D750)为750nm波长吸光度的标准不确定度;u(D663)为663nm波长吸光度的标准不确定度;u(D645)为645nm波长吸光度的标准不确定度;u(D630)为630nm波长吸光度的标准不确定度;u(V2)为样品体积的标准不确定度;u(V1)为样品定容体积的标准不确定度;u(δ)为比色皿光程的标准不确定度.公式(2)中各影响因子的传播系数为:9C9.58V1C(D750)==-(3)9D750V2δ9C11.64V1C(D663)==(4)9D663V2δ9C2.16V1C(D645)==-(5)9D645V2δ9C0.1V1C(D630)==(6)9D630V2δ9C[11164(D663-D750)-2116(D645-D750)+0110(D630-D750)]C(V1)==(7)9V1V2δ 第3期余文永,等:分光光度法测定水体叶绿素a含量的测量不确定度分析279C[11164(D663-D750)-2116(D645-D750)+0110(D630-D750)]V1C(δ)==2(8)9δ-V2δ9C[11164(D663-D750)-2116(D645-D750)+0110(D630-D750)]V1C(V2)==2(9)9V2-V2δ3测量不确定度评定311标准不确定度分量评定311114个波长吸光度的标准不确定度分别采集水库水(样品量为1L)和湖泊水(样品量为011L)进行4个波长吸光度的重复性试验,此部分不确定度包含研磨、离心等前处理过程的影响.4个波长吸光度的标准不确定度(u(DW))由以下两部分组成:重复性试验的不确定度(A类评定,uA)和分光光度计刻度的不确定度(B类评定,uB),计算公式:22u(DW)=uA+uB(10)31111114个波长吸光度的不确定度A类评定4个波长吸光度的不确定度A类评定(uA)即为重复性试验的平均值标准偏差(s€x).样品量为1L和011L时,5个平行样品4个波长吸光度平均值及其标准偏差见表1.表14个波长吸光度均值(€x)及其标准偏差(s(€x))(n=5)Table1Absorbency(€x)andstandardvariation(s(€x))offourwavelengths样品量1LVolumeofsample:1L样品量011LVolumeofsample:0.1L750nm663nm645nm630nm750nm663nm645nm630nm吸光度均值€x0.0030.01660.00540.00460.00220.0280.00940.0068Absorbencys-4-4-4-4-4-4-4(€x)0.0005.10×104.00×104.00×102.00×106.32×102.45×102.00×103.1.1.24个波长吸光度的不确定度B类评定722型分光光度计最小刻度的变化为0.001,则0.001-4uB==5.77×1033.1.1.34个波长吸光度的标准不确定度按公式(10)分别计算出样品量为1L和0.1L时,4个波长吸光度的标准不确定度(u(DW))(表2).表24个波长吸光度的标准不确定度(u(DW))Table2Standarduncertaintyofrepeatedreadingofabsorbencyinfourwavelengths样品量1LVolumeofsample:1L样品量0.1LVolumeofsample:0.1L-4-4u(D750)5.77×10u(D750)6.11×10-4-4u(D663)7.70×10u(D663)8.56×10-4-4u(D645)7.02×10u(D645)6.27×10-4-4u(D630)7.02×10u(D630)6.11×10 28仲恺农业技术学院学报第16卷3.1.2比色皿光程的标准不确定度(B类)《国家计量检定规范》178-96规定,比色皿光程对比最大允差为0.5%,属B类评定,则0.5%-3u(δ)==2.89×10(cm)33.1.3定比体积(10ml比色管)的标准不确定度定比体积的标准不确定度主要来源于玻璃量具的最大允差、温度变化引起的体积改变及量具刻度读数重复性的标准不确定度分量.3.1.3.110ml比色管允差引起的标准不确定度按A级标准容器要求,10ml比色管允差为±0.1ml,自由度V=∞,属B类评定,则0.1-2u(V1-1)==5.77×10(ml)33.1.3.2温度变化引起比色管体积变化的标准不确定度设温度变化±3℃,水的膨胀系-4数在20℃时,α=2.1×10/℃,则-4-3u(V1-2)=αVt=2.1×10×3×10.0=6.3×10(ml)3.1.3.3比色管定比刻度读数重复性引起的标准不确定度将比色管称干重,加蒸馏水至定比刻度,再称重,将两次称重之差换算成体积,重复5次,换算体积的标准偏差就是定比刻度读数重复性引起的标准不确定度(u(V1-3))(表3).表3比色管定比刻度读数重复性试验Table3Repeatabilitytestinreadingcolorimetrictubescale1#2#3#4#5#u(V1-3)/ml-3称重Weight/g(22.5℃)30.261030.231430.190430.233430.22241.59×10水的质量Massofwater/g10.044110.01459.973510.016510.0055水的体积Volumeofwater/ml(20℃)10.078110.047910.006910.049910.0389管干重Netweightoftube/g20.183520.183520.183520.183520.18353.1.3.4定比体积的标准不确定度定比体积(10ml比色管)的标准不确定度为:222u(V1)=(V1-1)+(V1-2)+(V1-3)-22-32-32=(5.77×10)+(6.3×10)+(1.59×10)-2=5.81×10(ml)3.1.4样品体积(容量瓶)的标准不确定度样品体积的标准不确定度来源与定容体积相同.3.1.4.11L容量瓶的标准不确定度(1)1L容量瓶允差引起的标准不确定度:1L容量瓶(A级)最大允差为±0.40ml,自由度V=∞,属B类评定,则0.40u(V2-1)==0.23(ml)3(2)温度变化引起容量瓶体积变化的标准不确定度:设温度变化±3℃,水的膨胀系数-4在20℃时,α=2.1×10/℃,则 第3期余文永,等:分光光度法测定水体叶绿素a含量的测量不确定度分析29-4u(V2-2)=αVt=2.1×10×3×1000.0=0.63(ml)(3)1L容量瓶的标准不确定度:1L容量瓶刻度线读数重复性的不确定度较小,可忽略不计,则1L容量瓶的标准不确定度为:22u(V2)=u(V2-1)+u(V2-2)=0.67(ml)3.1.4.20.1L容量瓶的标准不确定度(1)0.1L容量瓶允差引起的标准不确定度:0.1L容量瓶(A级)最大允差为±0.10ml,自由度V=∞,属B类评定,则0.10-2u(V2-1)==5.77×10(ml)3(2)温度变化引起容量瓶体积变化的标准不确定度评定:设温度变化±3℃,水的膨胀-4系数在20℃时,α=2.1×10/℃,则-4-2u(V2-2)=αVt=2.1×10×3×100.0=6.3×10(ml)(3)容量瓶刻度读数重复性引起的不确定度评定:方法同比色管读数重复性试验,换算体积的标准偏差就是容量瓶刻度引起的标准不确定度(u(V2-3))(表4).表4容量瓶定容刻度读数重复性试验Table4Repeatedtestinthereadingofcontainerbottlescale1#2#3#4#5#u(V2-3)ml-3称重Weight/g(22.5℃)157.6484157.6036157.6331157.6323157.63277.27×10水的质量Massofwater/g99.677899.633099.662599.661799.6621水的体积Volumeofwater/ml(20℃)100.011899.967099.996599.995799.9961瓶干重Netweightofbottle/g57.970657.970657.970657.970657.9706(4)0.1L容量瓶的标准不确定度为:222u(V2)=(V2-1)+(V2-2)+(V2-3)-32-22-32=(5.77×10)+(6.3×10)+(7.27×10)-2=6.37×10(ml)3.2计算合成标准不确定度样品量为1L和0.1L时,标准不确定度分析结果分别见表5、表6.将各波长吸光度均值代入公式(7)～(9),按公式(3)～(9),计算出样品量为1L和0.1L时,各影响因子的传播系数,再将各影响因子的传播系数和标准不确定度分量代入公式(2),计算合成不确定度,结果见表7.3.3计算扩展不确定度U样品量为1L的扩展不确定度,取k=2,则3U1=k×uc(C1)=0.214(mg/m)样品量为0.1L的扩展不确定度,取k=2,则3U2=k×uc(C2)=2.32(mg/m) 30仲恺农业技术学院学报第16卷表5样品量为1L时的标准不确定度分析Table5Theevaluationofstandarduncertainty(volumeofsample:1L)标准不确标准不分布特征类型定度分量不确定度来源确定度CharacterofTypeofKindsofstandardSourcesofuncertaintyStandarddistributionevaluationuncertaintyuncertaintyu(D750)750nm波长吸光度的标准不确定度正态NormalA类5.77×10-4Standarduncertaintyofabsorbencyat750nmdistributionTypeAu(D663)663nm波长吸光度的标准不确定度均匀MeanB类7.70×10-4Standarduncertaintyofabsorbencyat663nmdistributionTypeBu(D645)645nm波长吸光度的标准不确定度正态NormalA类7.02×10-4Standarduncertaintyofabsorbencyat645nmdistributionTypeAu(D630)630nm波长吸光度的标准不确定度均匀MeanB类7.02×10-4Standarduncertaintyofabsorbencyat630nmdistributionTypeBu(V2)样品体积的标准不确定度均匀MeanB类6.7×10-4(L)StandarduncertaintyofsamplingscalevolumedistributionTypeBu(V1)样品定比体积的标准不确定度均匀MeanB类5.81×10-2(ml)StandarduncertaintyofsamplingscalevolumedistributionTypeB正态NormalA类distributionTypeAu(δ)比色皿光程的标准不确定度均匀MeanB类2.89×10-3(cm)StandarduncertaintyofcolorimetricutensilthicknessdistributionTypeB表6样品量为0.1L时的标准不确定度分析Table6Theevaluationofstandarduncertainty(volumeofsample:0.1L)标准不确标准不分布特征类型定度分量不确定度来源确定度CharacterofTypeofKindsofstandardSourcesofuncertaintyStandarddistributionevaluationuncertaintyuncertaintyu(D750)750nm波长吸光度的标准不确定度正态A类6.11×10-4Standarduncertaintyofabsorbencyat750nmNormaldistributionTypeA663nm波长吸光度的标准不确定度均匀B类8.56×10-4u(D663)Standarduncertaintyofabsorbencyat663nmMeandistributionTypeBu(D645)645nm波长吸光度的标准不确定度正态A类6.27×10-4Standarduncertaintyofabsorbencyat645nmNormaldistributionTypeAu(D630)630nm波长吸光度的标准不确定度均匀B类6.11×10-4Standarduncertaintyofabsorbencyat630nmMeandistributionTypeBu(V2)样品体积的标准不确定度均匀B类6.37×10-5(L)StandarduncertaintyofsamplingscalevolumeMeandistributionTypeB正态A类NormaldistributionTypeAu(V均匀B类-21)样品定比体积的标准不确定度5.81×10(ml)StandarduncertaintyofsamplingscalevolumeMeandistributionTypeB正态A类NormaldistributionTypeAu(δ)比色皿光程的标准不确定度均匀B类2.89×10-3(cm)StandarduncertaintyofcolorimetricutensilthicknessMeandistributionTypeB 第3期余文永,等:分光光度法测定水体叶绿素a含量的测量不确定度分析31表7样品量为1L和0.1L时各影响因子的传播系数和合成标准不确定度计算结果Table7Disseminationcoefficientofinfluencefactorsandcombinedstandarduncertainty(volumeofsample:1Land0.1L)样品量1Lvolumeofsample1L样品量0.1Lvolumeofsample0.1LC2各影响因子传播系数1(D750)-95.8C2(D750)-9.58×10C3Disseminationcoefficientof1(D663)116.4C2(D663)1.164×10C2influencefactors1(D645)-21.6C2(D645)-2.16×10C1(D630)1.0C2(D630)10C1(V1)0.153C2(V1)2.85C21(V2)-1.53C2(V2)-2.85×10C1(δ)-1.53C2(δ)-28.5u33c(C1)0.107(mg/m)uc(C2)1.16(mg/m)合成标准不确定度Com2binedstandarduncertainty4结语分析结果显示,用分光光度法测定水体叶绿素a,样品量为1L和0.1L的测量不确定度3分别为0.214和2.32mg/m.影响水体叶绿素a含量的测量不确定度分量主要是波长在750、663、645nm处吸光度的标准不确定度,而测量使用的各种量具则影响甚微.影响吸光度不确定度的因素贯穿整个测量过程,主要来源于研磨、离心、样品的新鲜度等几个方面.为了确保分析结果的准确可靠,样品采集后应及时抽滤、分析,如不能及时处理则应在低温避光处保存,并加1%碳酸镁粉悬浊液保鲜样品.在叶绿素a提取步骤应充分研磨,离心转速应达到规定的3000～4000r/min.提取液在750nm的吸光度应控制在0.005以下,否则将对测量结果产生明显影响.致谢:原国家标准物质研究中心罗涤明老师对本文的计算过程进行了指导,特此致谢!参考文献:[1]ISO21993.GuidetotheExpressionofUncrertaintyinMeasurement[S].[2]JJF105921999.测量不确定度评定与表示[S].[3]JJF100121998.通用计量术语及定义[S].[4]ISO/IEC1702521999.GeneralrequirementsforthecompetenceoftestingandCalibrationlaboratories[S].[5]国家环保局.环境监测技术规范[S].1986.17218.[6]国家环保总局.水和废水监测分析方法(第4版)[M].北京:中国环境科学出版社,2002.6702671.[7]金相灿,屠清英.湖泊富营养化调查规范[M].北京:中国环境科学出版社,1990.2682270. 32仲恺农业技术学院学报第16卷TheevaluationofuncertaintyinmeasuringchlorophyllawithspectrometryYUWen2yong,HUDi2qin,NIANJi,LIYING2wen,ZHUDa2ming(GuangzhouEnviromentalMonitoringCenter,Guangzhou510030,China)Abstract:Usingspectrometrytomeasurechlorophyllaoflake,reservoir,andevaluatingitsuncertain2ty.Accordingtoalgaamountofwater,wechoosed2samplevolume(1Land0.1L).Impactingfac2torsofmeasuringuncertaintyinclude:theamountofthesamplewater,thesampleshandlingbeforeanalysis,thereadingofspectrometry,glassutensilsandthethicknessofcolorimeter.Basedonuncer2taintyregulationstoestablishthemathematicsmodeandcalculateeachstandarduncertainty,wegot3combinedstandarduncertainty(uc)andexpandeduncertainty(U).ResultsofUwere:0.214mg/m3(1Lofsamplevolume),2.32mg/m(0.1Lofsamplevolume).KeyWords:spectrometry;chlorophylla;water;uncertaintyofmeasurement【责任编辑曾东发】(上接第24页)EffectofbutachlorandatrazineoncocozelleseedgerminationandphotosyntheticcontentintheseedlingsZHANGWei2feng,YUXian2mao,LIANGGuan2sheng,HEWen2feng(DivisionofTeachingAffairs,ZhongkaiAgrotechnicalCollege,Guangzhou510225,China)Abstract:Theexperimentwasconductedbytreatingthefinesandsinwhichthecocozelleseedsownwithbutachlorandatrazinewithdifferentconcentrations,andwithwaterascontrol.Theresultsshowedthatcocozelleseedgerminationratedecreasedwithincreaseofconcentrationsofthechemicalswhenthethefinesandsweretreatedwith10,20,50and100g/Lbutachlorandatrazine,respectively.Comparedwithcontrol,asignificantdifferenceoftheeffectofthechemicalswithdifferentconcentrationsonseedgerminationratewasobserved.Whentheseedlingsintrifoliateperiodweresprayedwith10,20,50,100,150and200mg/Lbutachlorandatrazinerespectively,thetotalcontentofchlorophyll,contentsofchlorophylla,chlorophyllbandcarotenoidalldecreasedwithincreaseoftheconcentrations,andasig2nificantdifferenceofeffectoftwochemicalsoncontentsofchlorophylla,chlorophyllbandcarotenoidwasalsoobserved.Anegativerelationshipbetweenthecontentsofchlorophyllaandchlorophyllbandtotalcontentofchlorophyll,andtreatmenttimewasfoundaftertheseedlingsweresprayedwith100mg/Lbutachlorandatrazinefor2～10d,respectively.Keywords:cocozelle(CucurbitapepoL.);butachlor;atrazine;chlorophyll;carotenoid【责任编辑曾东发】'