喜炎平注射液溶血的分光光度法检查

'喜炎平注射液溶血的分光光度法检查邱海强江苏省无锡药品检验所，无锡214028摘要目的：建立喜炎平注射液溶血检查的分光光度方法。方法：按《中国药典》2010年版一部方法配制供试品溶液、阴性对照和阳性对照溶液，用分光光度法测定吸光度，并计算溶血率，检测波长545nmo结果：溶血率上限定为5%,样品的溶血率均小于1%。结论：喜炎平注射液可以用分光光度法进行溶血检查，其灵敏度高于药典方法。关键词：喜炎平注射液；溶血；分光光度法ThespectrophotometricmethodforthehemolysisexaminationofXiyanpingInjectionQIUHai-qiangJiangsuWuxiInstituteforDrugControl,Wuxi214028AbstractObjective：ToestablishaspectrophotometricmethodforthehemolysisexaminationofXiyanpingInjection.Method：Thesamplesolution,negativecontrolsolutionandpositivecontrolsolutionwerepreparedaccordingtothemethodofChinesePharmacoperia(2010edition,VolI),thelightabsorbanceatthewavelengthof545nmwasdetectedusingspectrophotometricmethod,andthehemolysisratewascalculated.Result：Theupperlimitofthehemolysisratewas5%,andthehemolysisrateofallofthesampleswaslessthan1%.Conclusion：ThespectrophotometricmethodcanbeusedforthehemolysisexaminationofXiyanpingInjection,thesensitivityishigherthanthatofthePharmacoperiamethod.Keywords：XiyanpingInjection;hemolysis;spectrophotometry喜炎平注射液，主要成份为穿心莲内酯总磺化物，具有清热解毒、止咳止痢的作用，临床用于支气管炎、扁桃体炎、细菌性痢疾等。其现行质量标准为国家药品标准WS-10863(ZD-0863)-2002-2011Z,规定“溶血与凝聚”项按《中国药典》2010年版一•部附录XIIIH溶血与凝聚检查法进行山。药典附录溶血与凝聚检查法是经典的传统方法，检验结果采用目测观察。其主要缺点为：检验结果靠检验者的经验來判断，主观干扰较大；由于采用目测观察，当对检验结果有异议时，难以捉供客观的数据来佐证检验结果。现釆用分光光度法测定供试品溶液的吸光度并计算溶血率，对喜炎平注射液的溶血检查方法进行了改进。1仪器与试药1.1仪器：Cary100紫外■可见分光光度计，SPX-250B-Z型生化培养箱，均经检定合格。80・2型离心沉淀器。1.2动物：普通级新西兰家兔，体重3.5kg,雄性，实验动物使用许可证号SYXK(苏)2014-0012号。1.3试药：喜炎平注射液，规格2ml：50mg,批号20110526、20120423、20121217、2013012402>2013030802.2013033003,江西某药业有限公司(依次编为样1〜样6)o氯化钠注射液，规格500ml：4.5g,批号131012ZT,安徽某药业有限责 任公司。纯化水。2方法与结果2.12%红细胞混悬液的制备取兔心血，按《中国约典》2010年版一部附录XIIIH规定的方法，制成2%红细胞混悬液囚。2.2药典标准检验取洁净玻璃试管，按表1所示依次加样，混匀后立即置37°C温育，3小时后观察溶血和凝聚反应。如溶液呈澄明红色，管底无细胞残留或冇少量细胞残留，表明有溶血发生；若有棕红色或红棕色絮状沉淀，轻轻倒转3次仍不分散，表明可能有红细胞凝聚发生，显微镜下观察有红细胞凝集，则为凝聚。溶血或凝聚均以“+^表示。如红细胞全部下沉，上清液无色澄明，表明无溶血发生；无棕红色或红棕色絮状沉淀，表明无红细胞凝聚发生。均以“一"表示。结果6批供试品按药典标准检验，溶血与凝聚检查均符合规定。见表2。表1喜炎平注射液溶血与凝聚药典检查方法试管编号1、23452%红细胞悬液/ml2.52.52.5氯化钠注射液/ml2.22.54.7纯化水/ml2.5喜炎平注射液/ml0.3().3表1中,1、2号管为供试品管,3号管为阴性对照,4号管为阳性对照,5号管为供试品对照。表2喜炎平注射液溶血与凝聚药典检查结果供试品编号样1样2样3样4样5样6阴性对照阳性对照溶血--------+红细胞凝聚一一一一一一一一一一一一一一2.3分光光度法检查参照GB/T1423322005屮“溶血试验”方法，并以该标准规定的溶血率5%作为合格上限。按表1所示加样，6批喜炎平注射液供试品管、阴性对照管、阳性对照管平行各3管，6批供试品对照管各1管。混匀后立即置37°C温育3小时。1500转/分离心15分钟，取上清液。2.3.1取6批供试品对照溶液，以氯化钠注射液为空口，按紫外■可见分光光度法，在波长200nm~800nm范围内进行扫描。6批结果一致，选2号样品见图1。图1喜炎平注射液扫描结果3q4<1200300400500600700800Wavelength(nm)2.3.2供试品对照溶液吸光度的测定以氯化钠注射液为空白，用分光光度法在545nm处测定供试品对照溶液吸光度，结果见表3。表3供试品对照溶液545nm波长吸光度供试品编号样1样2样3样4样5样6吸光度0.00150.00210.00120.00090.00180.0040 图1表明，喜炎平注射液的最大吸收波长在3OOnm以下，在400nm-800nm范围内，吸光度很小。而溶血反应产生的血红蛋白，其最大吸收波长为545nm[3],因此，样品本身对血红蛋白的检测干扰很小。同时，检测供试品溶液时，是以供试品对照溶液作空口，其影响可完全消除。表3结果进一步证实了这一结论。2.3.3供试品溶液吸光度检测及溶血率计算以氯化钠注射液作空白，检测波长545nm,测定阴性对照（3管）和阳性对照（3管）溶液的吸光度。分别以6批供试品对照溶液为空口，测定6批供试品溶液（各3管）的吸光度。以3管吸光度的平均值计算溶血率⑶，结果6批供试品的溶血率均小丁1%O参照GB/T14233.2-2005溶血试验的判断标准，溶血率小于5%,则判定样品溶血检查符合规定⑶。分光光度法与药典方法结果一致。见表4。表4供试品溶液吸光度及溶血率结果样1样2样3样4样5样6阴性对照阳性对照吸光度平均值0.02660.03040.03010.02620.02550.02490.01782.2780溶血率0.4%0.6%0.5%0.4%0.3%0.3%溶血率（％）计算公式：%=（A-B）/（C-B）x100%,式中A、B、C分别为供试品溶液、阴性对照、阳性对照的吸光度。234“不合格样品叩勺制备及检测取2、4、6号喜炎平注射液，按表5加样，混匀后立即置37°C温育3小时，取出观察溶血结果。3批供试品均在9号管开始出现明显溶血现象，8号管隐约可见轻微溶血，而1〜7号管均无明显溶血现象。再1500转/分离心15分钟，取上清液。离心后8号管上清液可见较明显的溶血现象。按2.3.3方法测定吸光度并计算溶血率，阴性、阳性对照采用表4数据。结果见表6、表7。表5“不合格样品”的制备管号1234567891011122%红细胞悬液/ml2.52.52.52.52.52.52.52.52.52.52.52.5氯化钠注射液/ml2.22.01.81.61.41.21.00.80.60.40.2纯化水/ml0.20.40.60.81.01.21.41.61.82.02.2喜炎平注射液/ml0.30.30.3().30.30.30.30.30.3().30.30.3表6“不合格样品"吸光度结果管号123456789101112样20.02730.03240.03330.03550.03830.04790.05980」8070.43871.10501.66642.1294样40.02680.03010.03510.03850.04210.04560.05660.14950.42060.97431.46382.1499样60.02630.02750.02850.03000.03580.04160.05190.14090.41411.08361.36752.0782表7“不合格样品”溶血率结果管号123456789101112样20.4%0.6%0.7%0.8%0.9%1.3%1.9%7.2%18.6%48.1%72.9%93.4%样40.4%0.5%0.8%0.9%1.1%1.2%1.7%5.8%17.8%42.3%64.0%94.3%样60.4%0.4%0.5%0.5%0.8%1.1%1.5%5.4%17.5%47.2%59.7%91.2%表7结果表明，目测法与分光光度法相比，当溶血率约为5%〜7%时仅能观察到轻微溶血现象，而观察到明显溶血现象吋的溶血率已达到17%。上述实验结果证明，采用分光光度法，比药典方法能更灵敏地检查出溶血现象。3讨论3.1喜炎平注射液的主要原料穿心莲内酯总磺化物由屮药材捉取而成，成分较为复杂，容易引起过敏反应、溶血、红细胞凝聚等不良反应，因此除注射剂通用 的热原、无菌检查外，现行的法定标准规定了溶血与凝聚、异常毒性、过敏反应的检查。3.2按法定标准检验时，由于红细胞的沉降不可能完全，因此轻微溶血所产生的血红蛋白，其颜色被红细胞掩盖，造成判断怵I难。同吋药典标准屮对溶血的描述为“试管中的溶液呈澄明红色S其红色的程度无法定量，检验者的判断各冇不同，容易造成误判。采用分光光度法则可避免这一缺点。3.3药典规定对红细胞凝聚采用显微镜下观察。随着显微摄像技术的逐步推广,建议将红细胞凝聚的检查结果拍照留存，以保存检验的原始证据。参考文献［1］国家食品药品监督管理局.国家药品标准［S］.WS-10863(ZD-0863)-2002-2011Z.［2］国家药典委员会.中华人民共和国药典:一部［S］.北京:化学工业出版社,2010：附录30,92⑶国家质量监督检验检疫总局.屮华人民共和国国家标准［SJ.GBrr14233.2-2005附作者信息：作者：邱海强，男，副主任药师，大学本科，从事质量检验和标准的研究单位：江苏省无锡药品检验所通讯地址：江苏省无锡市长江南路37号江苏省无锡药品检验所邮编：214028办公电话:0510-66112755,手机：13961726878E-mail：qiuhq1970@163.com盂开发票，发票抬头“江苏省无锡药品检验所邱海强”烦请安排在今年发表。'