生物工业分析 第5章 比色分析和分光光度法

'生物工业分析第五章　比色分析和分光光度法第一节　概述第二节　比色分析与分光光度法第三节　紫外分光光度法第四节　其它分光光度法简介 比色分析和分光光度法第一节　概述比色分析和分光光度法具有以下优点：①灵敏度高；②准确度较高；③操作简便、分析速度快；④应用广泛。 比色分析和分光光度法第二节　比色分析与分光光度法一、基本原理1．朗伯—比尔定律比色分析与分光光度分析定量物质的基础是朗伯-比尔定律（Lambert-Beer）：当一束平行单色光通过均匀、非散射的稀溶液时，溶液对光的吸收程度（即为吸光度A）与溶液的浓度和液层的厚度的乘积成正比。A=KCL式中：A——吸光度；K——吸光系数；L——液层厚度；C——被测物质的浓度。 气相色谱分析通常用光吸收曲线来描述待测溶液对各种波长光的吸收情况，将光源中不同波长的光依次通过固定浓度的待测溶液，分别测出溶液在不同波长下的吸光度，以波长λ为横坐标，以吸光度A为纵坐标绘制的曲线称为光吸收曲线或吸收光谱曲线。在光吸收光谱曲线上，光吸收程度最大处对应的波长为该物质的最大吸收波长，用λmax表示，最大吸收波长对应的颜色就是物质吸收光的颜色。在一定条件下物质的吸收强度与其浓度成正比关系，这是物质进行定量分析的依据。在各种物质的分子吸收光谱中吸收峰的波长位置、吸收峰的相对强度以及吸收峰的形状（峰宽）是对物质进行定性与结构分析的依据。 气相色谱分析2．仪器及使用方法（1）581-G型光电比色计　581-G型光电比色计光学系统如图5-1所示。图5-1　581-G型光电比色计光学系统1—光源2—反射镜3—吸热玻璃4—聚光镜5—滤光片6—比色皿7—硒光电池8—检流计 气相色谱分析其中光源灯泡是6.3V的钨丝灯泡；滤光片的作用是从白光中把最能为被测溶液吸收的某波段的单色光分出来，除去不被溶液吸收且干扰测定的其他波段的光，比色分析选用的滤光片的颜色应该是溶液的互补色，每块滤光片上都标有该滤光片允许通过的光波的波长数值，单位为nm。581-G型光电比色计配有3块滤光片，即红（650nm）、绿（530nm）、蓝（420nm）色滤光片。括号内波长表示该滤光片最强透过光的波长。选择滤光片的原则是，滤光片透过的光应是溶液吸收最强的光，这可根据颜色的互补关系来选择，见表5-1。 气相色谱分析溶液颜色滤光片的颜色滤光片能通过的波长（nm）黄色青紫400～435黄蓝435～480桔红绿蓝480～490红蓝绿490～500紫绿500～560青紫黄绿560～580蓝黄580～595绿蓝桔红590～610蓝绿红610～750表5-1　溶液颜色与滤光片互补关系 气相色谱分析（2）721型分光光度计　它的工作波长范围为420～720nm,主要是专供一般化验室在可见光区作常规定量比色分析。721型分光光度计原理示意图如图5-2所示。图5-2　721型分光光度计原理示意图1—光源2—聚光透镜3—反射镜4—弯曲狭缝5—保护玻璃6—准直镜7—棱镜8—光亮调节器9—聚光镜10—吸收池11—光门12—保护玻璃13—光电管14—直流放大器15—微安表 气相色谱分析721型分光光度计的使用方法如下:①在仪器接通电源以前,先将各种控制旋钮开关置于关的位置上,并打开比色皿盒上的翻盖。②预热20分钟，同时启动检流计的电源开关，调节检流计的零点粗、细调节器，使透光度为100。待仪器稳定后再使用。③选择测定波长。④将盛有溶液的比色皿放在比色皿架上，空白溶液放在第一格内，显色溶液放在其它格内，把暗箱盖好。 气相色谱分析⑤用空白溶液调透光度为100。然后将比色皿定位拉杆依次轻轻拉出，使待测溶液依次进入光路，读出吸光度或透光度。必要时可将空白溶液推入光路核对吸光度零位，再读数一次。⑥使用完毕，应将比色皿盒上的翻盖打开，切断检流器电源，最后切断仪器电源，将仪器用盖好。同时用蒸馏水将比色皿洗涤干净，存放于比色皿专用盒内。使用时应注意以下事项:①仪器连续使用2小时后，最好休息半小时，再继续使用；②操作时，应尽量避免试液滴入比色皿暗盒内或仪器的面板上，若有滴出应及时揩干，以免腐蚀仪器。 气相色谱分析二、定量分析方法（1）标样计算法　此法使用于个别样品的分析。首先测出标准溶液（浓度为Cs是已知的）的吸光度As，然后在相同的条件下测出样品溶液的吸光度Ax（由于实验条件相同，故K、L为定值，符合比尔定律）。依公式CxAs=CsAx可计算出待测样品的浓度。（2）标准曲线法　此法适合于成批试样的分析。首先配制一系列不同浓度的标准溶液，分别测定其吸光度，以浓度为横坐标，相应的吸光度为纵坐标绘制标准工作曲线。样品也经过同样的处理，在和标准溶液相同的条件下测吸光度。根据样品的吸光度在标准工作曲线上查出相应的浓度。 气相色谱分析三、应用实例1．啤酒色度的测定①基本原理啤酒（或麦汁）的色泽越深，则在一定波长下的吸光度越大，因此，可以直接用吸光度表示啤酒的色度。也可以采用EBC比色计来测定.测定的样品必须是清亮透明的。本实验采用GB4927－2001规定的方法，即使用EBC比色计，将除气后的试样注入EBC比色计中，与标准EBC色盘比较，目视读数或自动数字显示出试样的色度，以EBC色度单位表示。②仪器EBC色度计（或使用同等分析效果的仪器）：具有2EBC～27EBC单位的目视色度盘或自动数据处理与显示装置。 气相色谱分析③试剂和溶液　哈同（Hartong）基准溶液：称取重铬酸钾（K2Cr2O7）0.100g和亚硝酰铁氰化钠（Na2[Fe（CN）3NO]·2H2O）3.500g，用水溶解并定容至1000mL，贮存于棕色瓶中，于暗处放置24h后使用。④操作（a）啤酒的除气　取啤酒一瓶，启盖后用手堵住瓶口摇动，并经滤纸过滤，以充分除去酒中的二氧化碳，静置至泡沫完全消失后即可待用。除气后的酒样，清亮透明。但啤酒样品暴露在空气和阳光中的时间应尽可能的短，以减少测定误差。 气相色谱分析（b）仪器的校正　将哈同溶液注入40mm比色皿中，用比色计测定，其标准色度应为15EBC单位；若使用25mm比色皿，其标准读数为9.4EBC。仪器的校正应每月一次。（c）色度测定　将清亮试样注入25mm比色皿中，然后放到比色盒中，与标准色盘进行比较，当两者色调一致时直接读数。或使用自动数字显示色度计，自动显示、打印其结果。 气相色谱分析⑤计算（a）如使用其他规格的比色皿，则需要换算成25mm比色皿的数据，报告其结果。试样的色度按下式进行计算：试样的色度（EBC单位）＝×25式中：S——实测色度（EBC）；H——使用比色皿的厚度（mm）；25——换算成标准比色皿的厚度。（b）测定浓色和黑色啤酒时，需要将酒样稀释至合适的倍数，然后将测定结果乘以稀释倍数，所得结果表示至整数。SH 气相色谱分析2．啤酒中铁的测定（比色法）①基本原理　在微酸性条件下，邻菲罗啉与Fe2+离子生成桔红色配合物，用比色法测定啤酒中铁含量。反应如下：邻菲罗啉桔红色 气相色谱分析②试剂与仪器试剂（a）邻菲罗啉溶液　称取0.30g邻菲罗啉，加100mL水，加热至70℃，使其溶解即可。（b）抗坏血酸溶液　称取2.5g抗坏血酸，用水溶解并稀释至100mL，本试剂需当日配制。（c）标准铁溶液　准确称取1.755g硫酸亚铁铵[Fe（NH4）2（SO4）2.6H2O]，用水溶解，加0.6mL浓盐酸，用水定容至250mL。使用时吸取5mL该溶液，用水稀释定容至1000mL，每毫升含铁5μg。仪器可见光范围的分光光度计，比色管，1cm比色皿。 气相色谱分析③测定步骤　准确吸取标准铁溶液（5μg/mL）0.0、1.5、2.5、3.5、5.0、10.0mL，分别放入6个50mL的容量瓶中，用水分别定容至刻度摇匀，其浓度分别为0.0、0.15、0.25、0.35、0.50、1.0μg/mL。于6只比色管中分别准确吸入上述不同浓度的标准铁稀释溶液25mL。准确吸取25mL除气啤酒放入另一只比色管中。向上述7只比色管中，分别加入抗坏血酸溶液1mL，摇匀，再加入邻菲罗啉溶液2mL，摇匀，在60℃水浴中保持15min，冷却。然后在505nm处，用1cm比色杯测吸光度。以标准铁的浓度为横坐标，吸光度为纵坐标绘制标准工作曲线，以试样管的吸光度在标准工作曲线上查出试样管中铁的含量。 气相色谱分析④讨论（a）配制试剂及测定中用的水均系以玻璃仪器重蒸的蒸馏水。（b）邻菲罗啉比色法测定铁，灵敏度较高，溶液中含铁0.1mg/L时其颜色也很明显，且色泽很稳定，易于比色。（c）加抗坏血酸的作用是将三价的铁离子还原为二价的铁离子。（d）二价铁离子与邻菲罗啉在pH2～9的范围内都能显色，但为了减少其他离子对测定的影响，通常在pH5的微酸性溶液中显色。由于啤酒的PH值与此接近，故不用加缓冲溶液。 气相色谱分析3．白酒中杂醇油的测定（比色法）①基本原理　杂醇油中的异丁醇、异戊醇在脱水剂浓硫酸的存在下，可与芳香醛缩合成有色物质，因此，可以用比色法进行测定。显色剂为对二甲氨基苯甲醛，标准杂醇油采用异丁醇和异戊醇（1:4）的混合液。②试剂与仪器试剂（a）0.5%对二甲氨基苯甲醛浓硫酸溶液称取0.5g对二甲氨基苯甲醛，溶于100mL浓硫酸中，此试剂应新鲜配制。（b）标准杂醇油溶液准确吸取0.26mL重蒸异丁醇和1.04mL重蒸异戊醇，置于100mL容量瓶中，加入50mL无杂醇油乙醇，用蒸馏水定容至刻度，此试剂每毫升含杂醇油10mg,使用时应稀释为0.1mg/mL。 气相色谱分析（c）无杂醇油乙醇取分析纯无水乙醇200mL，加0.25g盐酸间苯二胺，于沸水浴中回流2h，然后改用分馏柱于沸水浴中蒸馏，收集中间馏分约100mL，经检查不显色为合格。（检查方法：吸取0.1mL制备的无杂醇油乙醇置于10mL比色管中，加入0.9mL蒸馏水和2mL0.5%对二甲氨基苯甲醛浓硫酸溶液，摇匀，于沸水浴中加热20min，取出迅速冷却，加2mL蒸馏水稀释，与试剂空白比较不显色即可）。（d）样品的制备吸取1mL（V1）酒样，加蒸馏水定容至10mL。仪器可见光范围的分光光度计，比色管，1cm比色皿。 气相色谱分析③测定步骤在10mL的比色管中按下表加入各溶液：以上各比色管摇匀放冰水浴中，沿稍倾斜的比色管壁缓慢加入0.5%对二甲氨基苯甲醛浓硫酸溶液2mL，使硫酸溶液至管底，摇匀，放入沸水浴中加热15min后取出迅速冷却。然后各加入2mL蒸馏水（色深可加5mL），混匀。10min后，在波长520nm处，测吸光度，绘制标准工作曲线，依样品管测得的吸光度在标准曲线上查得酒样稀释液中杂醇油的含量。编号标准管样品管0123456标准杂醇油溶液（0.1mg/mL）mL00.10.20.30.40.5吸取酒样稀释液0.3mL（V2）mg0O.O10.020.030.040.05蒸馏水（mL）10.90.80.70.60.50.7 气相色谱分析④计算样品管中杂醇油的含量（mg）杂醇油（g/100mL）=×100式中：V1——所取酒样的体积（mL）；V2——酒样稀释液的体积（mL）。⑤说明　对二甲氨基苯甲醛浓硫酸溶液与丙醇、异丙醇及正丁醇无显色反应。因此，用一种醇作为标准来计算白酒中杂醇油的含量是有误差的。准确定量白酒中杂醇油的含量应用气相色谱法。样品管中杂醇油的含量V2×V1/10×1000 气相色谱分析4．味精中锌的测定①基本原理　在pH4.0～5.5的弱酸性介质中，锌与双硫腙（又名打萨腙、二苯腙、二苯磺腙、二苯硫代偶氮碳酰肼、二苯硫卡巴腙、二苯基缩二氨基硫脲等）形成红色配合物，然后用比色法在530nm处进行测定。反应如下： 气相色谱分析②试剂与仪器试剂（a）标准锌溶液　准确称取1g锌粒，溶于8mL1﹕1盐酸溶液中，转入1000mL的容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度。（b）20%盐酸羟胺溶液　称取20g盐酸羟胺，溶于100mL蒸馏水中，置于分液漏斗中，用0.004%双硫腙四氯化碳溶液分次抽提，直至四氯化碳层为绿色为止。（c）醋酸-醋酸钠缓冲溶液　取2mol/L醋酸溶液和2mol/L醋酸钠溶液等体积混合，置于分液漏斗中，用0.004%双硫腙四氯化碳溶液分次抽提，直至四氯化碳层为绿色为止。（d）1%硫化钠溶液　称取1g硫化钠，溶于100mL蒸馏水中即可。　　（e）0.004%双硫腙四氯化碳溶液　称取0.04g双硫腙，溶于1000mL四氯化碳中即可。（f）味精试样溶液　准确称取5g味精试样，加蒸馏水20mL溶解后，转入250mL分液漏斗中即可。仪器可见光范围的分光光度计。 气相色谱分析③测定步骤（a）标准系列的制备　准确吸取0、2、4、6、8、10mL标准锌溶液（1µg/mL），分别置于250mL分液漏斗中，各加入10mL醋酸-醋酸钠缓冲溶液，2mL20%盐酸羟胺溶液，2mL1%硫化钠溶液，用蒸馏水稀释至约150mL，混匀。加10mL0.004%双硫腙四氯化碳溶液，剧烈摇振15min，静止分层，取四氯化碳层比色。（b）味精液的处理　同标准系列液的处理。（c）测定　在530nm波长处测定标准系列及味精试样的吸光度，以标准锌溶液的浓度为横坐标，相应的吸光度为纵坐标，绘制标准工作曲线。从标准工作曲线上求得味精试样吸光度对应的锌含量（微克数），然后计算处理。 气相色谱分析④计算式中：W1——标准曲线上查得的锌的微克数；W2——所取的味精重量。⑤讨论（a）实验证明，双硫腙锌配合物在pH4.7～5.2范围内能定量地被四氯化碳萃取，而且色泽至少在2h内稳定。（b）测定过程中加入20%盐酸羟胺溶液是为了防止双硫腙的氧化。（c）测定过程中加入硫化钠溶液是为了防止铜、汞、金、铋、铅、镉、锰等金属离子对测定的干扰。 气相色谱分析5．柠檬酸中砷的测定（砷斑比色法，又称Gutzeit比色法）①基本原理　三氧化二砷和亚砷酸在酸性溶液中被氢迅速还原为砷化氢：反应中生成的砷化氢，通过用醋酸铅湿润过的棉花以吸去可能夹杂的硫化氢，然后与浸过溴化汞（或二氯化汞）溶液的试纸发生反应，使试纸呈现黄色： 气相色谱分析在测定过程中，为加速砷酸（H3AsO4）的还原,可加入碘化钾将砷还原为亚砷酸，所生成的碘用酸性氯化亚锡还原，同时，氯化亚锡也可以使五价砷还原为三价砷化合物：溴化汞（或二氯化汞）试纸着色强度与样品中砷的含量成正比。因此，用已知砷量的标准溶液处理得到的试纸进行比色，可以测定样品中砷的含量。 气相色谱分析②试剂与仪器试剂（a）砷标准溶液准确称取0.1g三氧化二砷，加5mL20%氢氧化钠，然后用1﹕4硫酸溶液中和，再过量10mL1﹕4硫酸溶液，转入1000mL容量瓶中，用蒸馏水稀释至刻度。使用时，吸取10mL1﹕4硫酸溶液，用蒸馏水稀释定容至1000mL，稀释后每毫升含三氧化二砷1μg。（b）20%碘化钾溶液称取20g碘化钾，溶于100mL蒸馏水中即可。（c）溴化汞试纸称取1g溴化汞，加20mL乙醇温热溶解，置入棕色瓶中，避光保存。将干净、光洁的滤纸切成小块，于溴化汞溶液中浸渍1h，取出风干，置入棕色瓶中避光保存。浸渍与风干过程最好避光操作。 气相色谱分析（d）酸性氯化亚锡溶液称取20g锡，加60mL浓盐酸和20mL蒸馏水，温热至气泡消失，加蒸馏水至100mL，多余的锡仍留在溶液中。（e）乙酸铅棉花取脱脂棉，用5%乙酸铅溶液浸透后除去多余的溶液，并使疏松，在100℃以下温度干燥，置于带塞瓶中，干燥处保存。（f）无砷锌粒（g）浓盐酸仪器Gutzeit定砷器见图5-3。 气相色谱分析图中，A为100mL三角瓶，B为橡皮塞，C为全长约18cm的上粗下细的玻璃管，粗管部分的内径约为6.5mm,长约14cm，细管部分的内径约为1～3mm粗管部分装入长约5～6cm的乙酸铅棉花，乙酸铅棉花距离上端管口至少3cm。细管部分紧密插入橡皮塞B中，深入瓶中大约1cm。D、E均为有机玻璃平板，中间有一与C管较粗部分相匹配的小孔。D、E两板的两侧均有对应的突出部分用于固定。使用时，将E板盖在D板上，使两圆孔相吻合，中间夹一溴化汞试纸，用橡皮圈将两板固定。 气相色谱分析③测定步骤（a）标准砷斑的制备　吸取2mL标准砷溶液（1μgAs2O3/mL）置于A瓶中，加21mL蒸馏水，5mL浓盐酸，5mL20%碘化钾溶液和5滴酸性氯化亚锡溶液，于室温下放置10min，加1.5g无砷锌粒，迅速安装好仪器（注意密封！），保持反应温度在25～40℃之间（视反应快慢而定，但不应超过40℃），1小时后取出溴化汞试纸，置于干燥的玻璃管中，即可制成标准砷斑。（b）样品的测定　准确称取2g柠檬酸样品，置于A瓶中，加23mL蒸馏水溶解，以下同标准砷斑的制备。如生成的砷斑色泽比浅，则此柠檬酸样品砷含量合格。 气相色谱分析④讨论（a）Gutzeit定砷法灵敏度高，因此，实验过程所用的试剂均不应生成砷斑。（b）无砷锌粒系指细的颗粒，如使用的锌粒较大，则用量需酌量增加。（c）砷斑在空气中易褪色，如需保存，可在含5%固体石蜡的石油醚中浸一下，待石油醚挥发后，避光保存于干燥处。 气相色谱分析6．白酒中铅的测定（比色法）①基本原理　铅离子与双硫腙在pH9.0左右的弱碱性溶液中生成红色配合物，该化合物溶于氯仿，其颜色深浅与铅离子的浓度成正比，因此，可用比色法测定白酒中铅的含量。反应如下： 气相色谱分析②试剂与仪器试剂（a）标准铅溶液　准确称取于105℃干燥2h的分析纯硝酸铅0.1598g,加1%硝酸100mL溶解后,转入1000mL容量瓶中,用蒸馏水定容至刻度.使用时,吸取10mL上述溶液,用蒸馏水稀释定容至100mL,每毫升稀释后溶液含铅10μg。（b）双硫腙氯仿溶液　称取精致过的双硫腙0.1g,加100mL氯仿溶解,作为贮备液.使用时,吸取1mL双硫腙贮备液,加100mL氯仿稀释,每毫升稀释后溶液含双硫腙10μg。（c）20%柠檬酸铵溶液称取50g柠檬酸铵,溶于100mL蒸馏水中,加2滴酚红指示剂,用氨水调成微红色（pH8.5～9.0）,置入分液漏斗中,用双硫腙氯仿溶液分次抽提,直至抽提液呈绿色,弃去双硫腙氯仿层,再用少量氯仿提取残剩的双硫腙,直至氯仿层为无色,将柠檬酸铵溶液加水至250mL。 气相色谱分析（d）20%盐酸羟胺溶液称取20g盐酸羟胺,溶于60mL蒸馏水中,加2滴酚红指示剂,用氨水调成微红色（pH8.5～9.0）,置入分液漏斗中,用双硫腙氯仿溶液分次抽提,直至抽提液呈绿色,弃去双硫腙氯仿层,再用少量氯仿提取残剩的双硫腙,直至氯仿层为无色,将盐酸羟胺溶液用6mol/L盐酸酸化成酸性（成黄色）加蒸馏水至100mL。（e）酚红指示剂　称取0.1g酚红,溶于100mL95%乙醇中,过滤。（f）10%及1%氰化钾溶液（除铅的方法同试剂c和d）。（g）1﹕1氨水。（h）6mol/L盐酸。（i）10%盐酸。（j）10％的氰化钾溶液。仪器可见光范围的分光光度计。 气相色谱分析③测定步骤（a）标准系列管的制备在50mL比色管中,按下表加入各溶液：每只比色管中各加2滴酚红指示剂,用浓氨水调成微红色（pH8.0～9.5）,各加1mL10%氰化钾溶液,10mL双硫腙氯仿溶液,剧烈摇振1min,静置分层。编号012345标准铅溶液（10μg/mL）毫升0.0O.20.40.60.810微克0.0O.0020.0040.0060.0080.010蒸馏水（毫升）10.09.89.69.49.29.020%柠檬酸铵溶液（mL）22222220%盐酸羟胺溶液（mL）111111 气相色谱分析（b）试样管的制备　取适量酒样（含铅量约5μg左右），置于50mL烧杯中，于沸水浴中蒸干。加10mL1﹕1盐酸溶液，于沸水浴中再次蒸干（若消化液呈黄色，则再用5mL1﹕1盐酸溶液，于沸水浴中再次蒸干）。加2mL10%盐酸溶液溶解残渣，转入50mL比色管中，用蒸馏水洗涤烧杯，并用蒸馏水稀释至约10mL，以下操作同标准系列管的制备。（c）测定　目视比色法测定将试样管氯仿层与标准系列管中氯仿层颜色比较，求得酒样中铅的含量：铅（mg/L）=×1000式中：V1——是试样管与标准管色泽相当的标准管中铅溶液体积（mL）；V——所取酒样的体积（mL）。V1×0.01V 气相色谱分析分光光度法测定　将标准系列管与试样管中水层分弃，用氯仿层比色，在510nm波长下测吸光度，绘制标准曲线，从标准工作曲线上求得试样管吸光度对应的铅的微克数（W），按下式计算：铅（mg/L）=式中：V——所取酒样的体积（mL）。WV 气相色谱分析④讨论（a）双硫腙法测定铅其灵敏度高，因此，对测定过程所用试剂及溶剂都需检查是否含铅，必要时需纯化处理。（b）双硫腙能与许多金属离子呈色，故双硫腙并非铅的专一试剂。但在一定的条件下能消除别的金属离子的干扰。①pH控制在8.5～9.0；②加入氰化钾配合剂，使许多金属离子形成稳定的配合物而被掩蔽；③加入柠檬酸铵，防止在碱性条件下碱土金属的沉淀；④加入还原剂盐酸羟胺，防止三价铁离子对双硫腙的氧化。（c）酚红指示剂变色pH为6.8～8.0，颜色改变从黄色变为红色，在酸性条件下酚红也呈红色。因试样管为酸性，加酚红指示剂后呈红色，需用氨水调制由红变黄，再由黄变红为止。 气相色谱分析7．单核苷酸类的测定（定磷法）①基本原理单核苷酸中的磷酸基为有机磷，经硫酸消化后转变为无机磷，与钼酸铵作用，在酸性条件下被还原剂如维生素C还原为钼蓝，用比色法测定。②试剂与仪器试剂（a）10mol/L硫酸溶液　量取27.8mL浓硫酸，缓慢倒入适量水中，用水稀释至100mL。（b）6mol/L硫酸溶液　量取16.7mL浓硫酸，缓慢倒入适量水中，用水稀释至100mL。（c）维生素C溶液　称取10g维生素C（抗坏血酸），用水溶解并稀释至100mL。 气相色谱分析（d）2.5%钼酸铵溶液称取2.5g钼酸铵，用水溶解并稀释至100ml。（e）定磷试剂取6mol/L硫酸溶液、2.5%钼酸铵溶液、水和维生素C溶液，依次按体积比1:1:2:1混合，本试剂应新鲜配制。（f）标准磷溶液准确称取磷酸二氢钾0.4329g，用水溶解并定容至1000mL。使用时，吸取10mL上述溶液，用水稀释定容至100mL，每毫升含磷10μg。（g）浓硫酸。（h）过氧化氢。仪器可见光范围的分光光度计。 气相色谱分析③测定步骤（a）标准曲线的绘制在6只试管中按下表要求加入各种试剂：以上6只试管于45℃水浴中显色25min，在660nm波长下测吸光度，绘制标准工作曲线。编号012345标准磷溶液（10μg/mL）毫升（mL）0.00.20.40.60.81.0微克（μg）0.0246810水（毫升，mL）32.82.62.42.22.0定磷试剂（毫升，mL）333333 气相色谱分析（b）试样液的制备　准确称取0.1g试样，溶于水中（难溶时可加1～2滴浓氨水），并用水稀释定容至100mL。（c）总磷的测定　吸取1mL试样液，置于50mL凯氏瓶中，加2.5mL浓硫酸，加热至冒白烟，冷却。加2滴过氧化氢，继续加热至无色透明，冷却，用水稀释定容至50mL。吸取3mL稀释消化液（含磷量10μg以下），以下操作同标准曲线的绘制，测其吸光度，从标准曲线中求得磷量（W1，µg）。（d）无机磷的测定　吸取1mL试样液，用水稀释定容至50mL，吸取3mL稀释液，以下操作同标准曲线的绘制，测其吸光度，从标准曲线中求得磷量（W2，µg）。 气相色谱分析④计算按下式计算单核苷酸的含量式中：M1——单核苷酸相对分子质量M2——磷的相对原子质量W——称取试样重量（g）⑤讨论本法中磷含量在0～10µg内符合比尔定律。 气相色谱分析8．液化型淀粉酶活力的测定①基本原理液化型淀粉酶能使淀粉水解为分子量大小不一的糊精和少量的麦芽糖和葡萄糖，使淀粉与碘呈蓝紫色反应逐渐消失，颜色的消失速度可以衡量酶活力的高低。②试剂与仪器（a）稀碘液　称取11g碘，22g碘化钾，置于研钵中，加少量蒸馏水研磨至碘完全溶解，用蒸馏水稀释至500mL，贮存于棕色瓶中。吸取上述碘溶液2mL，加碘化钾20g，用蒸馏水稀释至500mL，贮存于棕色瓶中。（b）标准比色液　甲液：精确称取40.2439g氯化钴（CoCl2•6H2O）和0.4878g重铬酸钾（K2Cr2O7），用蒸馏水溶解并定容至500mL。乙液：精确称取40mg铬黑T，用蒸馏水溶解并定容至100mL。使用时，取41mL甲液和4.5mL乙液混合，于冰箱中保存，使用7天后需重新配制。 气相色谱分析（c）pH6.0磷酸氢二钠—柠檬酸缓冲溶液　称取45.23g磷酸氢二钠（Na2HPO4•12H2O），8.07g柠檬酸，用蒸馏水溶解并稀释至1000mL。（d）2%可溶性淀粉溶液　准确称取可溶性淀粉2g（预先于100～105℃烘干），加少量水调匀，倾入80mL沸水中，继续煮沸至透明，冷却后用水定容至100mL。（e）酶液　准确称取酶粉2g，用pH6.0磷酸氢二钠—柠檬酸缓冲溶液稀释定容至一定体积（使其测定时酶解反应控制在2～3min内）,于40℃水浴浸取半小时，纱布过滤，滤液为实验用酶液。 气相色谱分析③测定步骤（a）取2mL标准比色液于白瓷板空穴内，作为比较颜色的标准。（b）取20mL2%可溶性淀粉和5mLpH6.0磷酸氢二钠—柠檬酸缓冲溶液，注入三角瓶中，在60℃恒温水浴中预热10min，然后加入预先稀释好的酶液0.5mL，立即记录时间，充分摇匀，定时用滴管取出反应液约0.5mL。滴入预先充满比色稀碘液（约1.5mL）的白瓷板空穴内，当穴内颜色反应由紫色逐渐变为红棕色，与标准比色液相同时，即为反应终点，并记录时间T（分钟,min.）。 气相色谱分析④计算以1g酶粉或1mL酶液于60℃pH6.0的条件下，1小时液化可溶性淀粉的克数来表示。用下式计算：式中：n——酶液稀释倍数；20——可溶性淀粉吸取体积（mL）；0.5——测定时用酶液体积（mL）；2%——淀粉液浓度；T——测定记录时间（min.）；W——酶粉取样量（g）。 气相色谱分析⑤讨论（a）酶反应全部时间应控制在2～2.5min之内，商品液化型淀粉酶粉剂活力为1500～2500单位，酶粉稀释100～200倍为宜。（b）可溶性淀粉的质量对液化型淀粉酶活力有一定的影响，为统一起见，可溶性淀粉使用浙江菱湖淀粉厂生产的化学纯试剂配制。 气相色谱分析9．蛋白酶活力的测定①基本原理蛋白酶水解酪蛋白，其产物酪氨酸能在碱性条件下使福林—酚试剂还原，生成钼蓝与钨蓝，以比色法测定。②试剂与仪器试剂（a）福林—酚试剂　称取钨酸钠（Na2WO4·2H2O）和钼酸钠（Na2MoO4·2H2O），置于1000mL圆底烧瓶中，加350mL蒸馏水，25mL85%磷酸，50mL浓盐酸，文火微沸10h，取下回流冷凝器，加50mL硫酸锂（Li2SO4）和25mL蒸馏水，混匀后，加溴水脱色，直至溶液呈金黄色，再微沸15min，驱除残余的溴，冷却，用4号耐酸玻璃过滤器抽滤，滤液用蒸馏水稀释至500mL。 气相色谱分析（b）标准酪氨酸溶液　准确称取DL—酪氨酸0.1g，加入少量0.2mol/L盐酸溶液（取1.7mL浓盐酸，用蒸馏水稀释至100mL），加热溶解，用蒸馏水定容至1000mL，每毫升含酪氨酸100μg。（c）pH7.2磷酸缓冲溶液取28mL磷酸二氢钠溶液[配制称取31.2g磷酸二氢钠（NaH2PO4·2H2O）用蒸馏水溶解并稀释至1000mL]和72mL磷酸氢二钠溶液[配制称取71.6g磷酸氢二钠（Na2HPO4·12H2O）用蒸馏水溶解并稀释至1000mL]，混合后用蒸馏水稀释至1000mL。（d）2%酪蛋白溶液称取2.00g酪蛋白（又名干酪素），加约40mL蒸馏水和2～3滴浓氨水，于沸水浴中加热溶解，冷却后，用pH7.2磷酸缓冲溶液稀释定容至100mL，贮存于冰箱中。 气相色谱分析（e）0.4mol/L三氯乙酸溶液称取三氯乙酸65.5g，用蒸馏水溶解并定容至1000mL。（f）0.4mol/L碳酸钠溶液称取无水碳酸钠42.4g，用蒸馏水溶解并定容至1000mL。（g）酶液准确称取酶粉2g，用pH7.2磷酸缓冲溶液定容至200mL，置于40℃水浴浸取半小时，用纱布过滤。根据酶活力的高低，再用pH7.2磷酸缓冲溶液稀释一定倍数（使其测定吸光度在0.2～0.4范围内为宜）。仪器可见光范围的分光光度计。 气相色谱分析③测定步骤（a）标准曲线的绘制取九支试管按下表将标准酪氨酸溶液进行稀释：从上述各试管中各取1mL，分别加入5mL0.4mol/L碳酸钠溶液，1mL福林—酚试剂，于40℃水浴中显色20min，在680nm波长下测定吸光度，绘制标准工作曲线，在标准曲线上求得吸光度为1时相当的酪氨酸微克数（即为K值）。编号012345678标准酪氨酸溶液（毫升,mL）012345678蒸馏水（毫升,mL）1098765432稀释酪氨酸溶液浓度（微克/毫升）01020304050607080 气相色谱分析（b）蛋白酶活力测定取4支10mL离心管，分别加入1mL稀释酶液，其中一支为空白管，三支为平行试验管。置于40℃水浴中预热3～5min，在三支平行试验管中分别加入1mL2%酪蛋白溶液，准确计时保温10min。立即加入2mL0.4mol/L三氯乙酸溶液，15min后离心分离或用滤纸过滤。分别吸取1mL清液，加5mL0.4mol/L碳酸钠溶液，最后加入1mL福林—酚试剂，摇匀，置于40℃水浴中显色20min。空白管中先加入2mL0.4mol/L三氯乙酸溶液，再加入1mL2%酪蛋白溶液，15min后离心分离或用滤纸过滤。以下操作与平行试验管相同。以空白管为对照，在680nm波长下测定吸光度，取其平均值。 气相色谱分析④计算蛋白酶活力单位定义：1克酶粉，在40℃，pH7.2条件下，每分钟水解酪蛋白为酪氨酸的微克数。用下式计算：式中：A——平行试验管的平均吸光度；4——离心管中反应液的总体积（毫升,mL）；10——反应10分钟；N——稀释倍数；W——酶粉称取量（克,g）。 气相色谱分析⑤讨论（a）对于同一台分光光度计与同一批福林－酚试剂，其工作曲线K值可以沿用，当另配时，工作曲线应重做。（b）当用不同产品的酪蛋白对同一蛋白酶测定时，其结果会有差异，故蛋白酶活力表示时应注名所用酪蛋白的生产厂。（c）本方法为中性蛋白酶活力的测定方法。酸性蛋白酶活力的测定可将缓冲溶液改为乳酸—乳酸钠缓冲溶液（取35mL乳酸，2mL乳酸钠，用蒸馏水稀释定容至1000mL，pH为2.3），碱性蛋白酶活力的测定可将缓冲溶液改为硼砂—氢氧化钠缓冲溶液（称取12.367g硼酸（H3BO3），加100mL1mol/L氢氧化钠溶液，用水稀释至1000mL,即为0.1mol/L硼砂溶液。取49.9mL0.1mol/L氢氧化钠溶液,用0.1mol/L硼砂溶液稀释至100mL，pH为11，即为硼砂—氢氧化钠缓冲溶液）。 气相色谱分析第三节　紫外分光光度法一、紫外分光光度计1．紫外分光光度计的光学系统及工作原理751-G型紫外分光光度计的光学系统采用自准式光路，其示意图如图5-4所示。751-G型紫外分光光度计在测定波长为320～1000nm内用钨丝灯做光源，波长为200～320nm内用氢灯做光源。以石英棱镜为单色器,以真空光电管作为光电转换元件。 气相色谱分析图5-4　751-G型紫外分光光度计的光学系统示意图1—氢弧灯2—凹面反射镜3—钨丝灯4—平面镜5—入射狭缝及石英窗6—球面准直镜7—石英棱镜8—出射狭缝9—石英透镜10—滤光片拉杆11—比色皿12—比色皿架拉杆13—暗电流控制闸门拉杆14—紫敏光电管15—红敏光电管16—光电管调动架拉杆 气相色谱分析工作原理:由光源1或3发出的连续辐射光线，射到凹面反光镜2上聚光，再被反射到平面镜4上，然后反射至入射狭缝5上，由此入射到单色器内。而狭缝5正好位于球面准直镜6的焦面上因此，入射光线到达准直镜上反射后，就以一束平行光射向棱镜7（该棱镜背面是镀铝的）。光线经棱镜后，在其中色散，光线入射角处在最小的偏向角，入射光在铝面上反射后并不是依原路反射回来，而是从棱镜色散出来的光线经准直镜反射后，会聚在出射狭缝8射出。为了消除杂散光对于测量结果的影响，在出射狭缝后装有滤光片，光线通过滤光片后进入样品室，根据波段需要，可以选用玻璃或石英比色皿。为了减少光线的反射程度，使光线能尽量集中照射到光电管上，在出射狭缝后装有石英透镜9，光线经透镜聚光后，照射到试样比色皿上，透过光到光电管的阴极上产生相应的光电流，经放大后，测得相应的吸光度。 气相色谱分析2．紫外分光光度计的构造紫外分光光度计主要有光源、单色器和检测器构成。3．紫外分光光度计的操作方法　下面以751-G型紫外分光光度计的操作方法为例加以介绍。（1）接通电源，预热10分钟。（2）工作前，先将暗电流控制闸门拉杆置于关闭位置，以进行仪器的校正和保护光电管。（3）将选择开关旋至“校正”位置。（4）转动波长旋钮将波长刻度调至需波长的位置上。（5）选定所需波长的光电管。同时根据相应的波长来选择光源灯。 气相色谱分析（6）根据波长选择比色皿。350nm以上可选用玻璃比色皿，350nm以下一定要选用石英比色皿。将装好溶液的比色皿放入比色皿架内，然后将盖板盖好。（7）调节暗电流旋钮，使电表指针到零，为了得到较高的准确度，每测量一次，暗电流应随时校正一次。（8）调节灵敏度旋钮，一般从左面停止位置按顺时针方向转动约三圈，此时度数盘转动1％透光率，电表指针可偏转3小格。（9）拉动比色皿架拉杆，将空白溶液移入光路。（10）调节读数电位器旋钮，使透光度读数指示在透光度100％处。（11）将选择开关拨至“×1”档。（12）拉开暗电流闸门，使单色光射入光电管。 气相色谱分析（13）调节狭缝旋钮，大致使电表的指针指零，然后再用灵敏度旋钮作精细调节，使电表的指针准确地指在零位。（14）移动比色皿架拉杆，使待测溶液移入光路。这时电表的指针偏离零位。（15）旋转读数电位器旋钮，重新使电表的指针指在零位，此时从吸光度读数盘上即能读取吸光度。依次拉出一格试样，旋动读数电位器旋钮，使电表重新指零，可从吸光度读数盘上读得相应得吸光度。注意：从读数窗读取待测溶液得透光度或吸光度值，当选择开关置于“×1”档时，透光度范围时0～100％，相应得吸光度范围是∞～0。可以直接读数，不需换算。当试液浓度过大，其透光度小于10％，吸光度大于1时，可把选择开关置于“×0.1”档，以获得较准确得读数，此时所读出得透光度值应以10除之，或把读出得吸光度值加上1.0。 气相色谱分析（16）更换试样或暂停测试时，必须将暗电流控制闸门拉杆关闭，以保护光电管。（17）测试几个试样时，可重复上述操作。但需经常用空白溶液校准透光率100％。（18）使用完毕后，将仪器复原。对于仪器的维修，应注意的是：①经常更换仪器中的干燥剂，发现变色应及时取出烘干后再用；②仪器停止工作时，必须切断电源，将选择开关放在“关”，狭缝转到0.01刻度，波长旋在625nm，透光率旋钮放在100％；③使用半年以上或搬动后，要进行波长精确性的检查。 气相色谱分析二、应用实例1.啤酒中双乙酰含量的测定（比色法）基本原理邻苯二胺与双乙酰反应如下：反应中生成的产物2，3-二甲基喹喔啉的盐酸盐在335nm处有一最大吸收值，可对连二酮进行定量测定。结果以双乙酰含量表示。 气相色谱分析②试剂与仪器试剂（a）4mol/L盐酸溶液　量取50mL浓盐酸，用重蒸水稀释至150mL。（b）1%邻苯二胺溶液　准确称取分析纯邻苯二胺0.2500g溶解于4mol/L盐酸溶液，并用4mol/L盐酸溶液定容至25mL，摇匀。贮存于棕色瓶中，本试剂应当日配制。若配制出来的溶液呈红色，应重新更换新试剂。（c）消泡剂　有机硅消泡剂或甘油聚醚。仪器（a）紫外分光光度计（b）双乙酰蒸馏装置如图5－5所示。 气相色谱分析1－夹套蒸馏气2－2000mL水蒸汽发生器3－冷凝器4－25mL量筒或容量瓶5－进样口6－电炉7－排气夹子图5－5　双乙酰蒸馏装置 气相色谱分析③测定步骤（a）蒸馏　按图5－5把双乙酰蒸馏装置安装好，把排气夹子7打开，冷凝器下端浸没在盛有2.5mL蒸馏水的25mL量筒的水中，量筒同时用冰水冷却。加热蒸汽发生器至沸，通汽加热夹套蒸馏器，备用。向另取的100mL量筒中加入2～4滴消泡剂，再注入5℃左右未除气啤酒100mL。待夹套蒸馏器下端开始冒大汽时，打开进样口瓶塞，将啤酒迅速注入到蒸馏器内，再用10mL蒸馏水冲洗量筒，洗液同时倒入蒸馏器内，迅速盖好进样口塞子，用水封口。待下端再次冒大汽时，将排气夹子夹住，开始蒸馏，接馏出液，直到馏出液接近25mL时，取下接受量筒，用少量蒸馏水冲洗冷凝管的下端，并入接受量筒，然后用蒸馏水定容至25mL，摇匀。 气相色谱分析（b）显色　混匀馏出液，分别吸取10mL馏出液于两支比色管中。一管作为样品管加入0.5mL1%邻苯二胺溶液，另一管不加1%邻苯二胺溶液作空白，充分摇匀后，同时置于暗处放置20～30min，然后于样品管中加2mL4mol/L盐酸溶液，于空白管中加2.5mL4mol/L盐酸溶液，混匀。（c）测定在335nm波长处，用2cm比色皿以空白做对照，测定样品的吸光度。④计算啤酒中双乙酰的含量按下式计算：双乙酰（mg/L）=A335×1.2式中：A335——用2cm比色皿测得的样品的吸光度。1.2——换算系数。多次用纯双乙酰测得的经验数值。如果实验中使用的是1cm比色皿，则换算系数应为2.4。 气相色谱分析⑤讨论（a）蒸馏时，加入试样要迅速，勿使测定成分损失，而且应尽快蒸馏，最好在5min内完成。（b）蒸馏时，应严格控制蒸汽量，勿使泡沫过多而被蒸汽带出而导致蒸馏失败。如果蒸馏器过小或消泡剂效果较差时，可分两次蒸馏，馏出液接受在同一量筒即可。（c）显色反应应在暗处进行，否则结果将偏高。 气相色谱分析2．单核苷酸的测定①基本原理由于单核苷酸分子中的碱基——嘌呤碱和嘧啶碱中都具有共轭双键，因此核苷酸对紫外光有强烈的吸收性能，其最大吸收波长在260nm附近，在230nm处有一个低谷。而各种单核苷酸都有特定的紫外吸收的吸光度，因此，可用紫外分光光度分析法测定。测定时可采用标准曲线法，也可采用摩尔吸光系数法直接推算。几种但核苷酸的摩尔吸光系数列表如下。以AMP粗制品中AMP的含量测定为例。此法也适用于其他单核苷酸含量的测定。 气相色谱分析单核苷酸摩尔吸光系数（ε260）式量pH=2.0pH=7.0氢型钠型腺嘌呤核苷5’-单磷酸（AMP）14.2×10315.0×103374.22391.22鸟嘌呤核苷5’-单磷酸（GMP）11.8×10311.4×103363.24407.24胞嘧啶核苷5’-单磷酸（CMP）6.2×1037.4×103323.31367.31尿嘧啶核苷5’-单磷酸（UMP）10.0×10310.0×103324.18368.18几种单核苷酸的摩尔吸光系数列表如下： 气相色谱分析②试剂与仪器试剂0.01mol/L盐酸溶液　取0.84mL浓盐酸，用蒸馏水稀释至1000mL。仪器紫外分光光度计③测定步骤准确称取AMP粗制样品25mL，用0.01mol/L盐酸溶液溶解并定容至100mL，摇匀。吸取5mL，再用0.01mol/L盐酸溶液稀释并定容至100mL，以0.01mol/L盐酸溶液为空白，在260nm波长下测定其吸光度。④计算核苷酸的含量用下式进行计算：核苷酸的含量（mg/100mg）=A260×（M/ε260）×稀释倍数×100式中：M——单核苷酸的式量；ε260——260波长下单核苷酸的摩尔吸光系数；A260——测定时260波长下的吸光度。⑤讨论本方法适宜于被测定液中单核苷酸含量在0.01～0.02mg/mL。 气相色谱分析第四节　其它分光光度法简介一、红外分光光度法的基本原理波长在0.75～1000μm间的电磁波称为红外线，这个光谱区间称为红外光区。用具有连续红外线光谱的光源照射一物质时，该物质就要吸收一部分光能，使分子的振动能级和转动能级发生变化。当振动能级和转动能级的跃迁使得分子的偶极距发生了变化而得到的分子的振动-转动光谱就称为红外吸收光谱。通常将红外光区按波长分为三个区域，即近红外区、中红外区和远红外区。它们的波长范围和使用的对象见下表： 气相色谱分析红外吸收光谱与紫外吸收光谱一样，都是带状光谱，也称吸收峰。理论依据是光吸收定律。红外分光光度计自动记录的红外光谱图是以波长（λ）或波数（υ）（波长和波数互为倒数关系）为横坐标，以样品的吸光度A或透光度T为纵坐标绘制而成的。图5-6是2-甲基丁醛的红外谱图。区域名称波长（μm）波数（cm-1）使用对象近红外区0.75～2.513300～4000各种官能团如-OH、-NH2等的定量分析中红外区2.5～15.44000～600物质结构和组成的定性分析远红外区15.4～830650～12金属有机物的金属有机键的分析 气相色谱分析图5-6　2-甲基丁醛的红外谱图 气相色谱分析二、红外分光光度计1．基本结构和工作原理光栅红外分光光度计光路图如图5-7所示。图5-7光栅型双光束红外分光光度计光路图S—光源；M—反射镜；C—切光器；G—光栅；F—滤光旋转调节器；A1—减光器；S1—入口狭缝；S2—出口狭缝；TC—检测器 气相色谱分析2．主要部件红外分光光度计的主要部件有光源、吸收池、单色器和检测器及记录装置五部分组成。三、红外分光光度法的应用1.定性分析利用红外吸收光谱对化合物进行定性分析的过程，称为图谱解析。（1）几个基本术语①伸缩振动和弯曲振动（又称变形振动）②基频峰和泛频峰③特征峰和相关峰 气相色谱分析（2）制样方法（常用的固体样品的制样方法）①压片法　一般将固体试样1～3mg放在玛瑙研钵中，加入干燥的光谱纯KBr100～300mg混合研磨均匀（在红外灯下进行），使其粒度在2.5μm以下，装入压片模具内，在压片机上加压，至压力为100kg并维持10min左右，卸掉压力则得一厚度约为1mm左右的透明的样品片，进行测定即可。②糊剂法　一般取5mg左右的试样放在玛瑙研钵中，滴上一滴石蜡油混合，充分研匀（其粒度在2.5μm以下）成糊膏状。将此糊膏夹于可拆卸池的两块窗片之间（或夹于两块片中），放入光路即可测定。 气相色谱分析糊剂法常用的液体有液体石蜡、六氯丁二烯等，液体石蜡适用于1300～400cm-1（其它波段本身有吸收），六氯丁二烯适用于4000～1300cm-1，两者配合才能完成全波段的测定，否则应扣除它们的吸收。③薄膜法　将试样溶于低沸点溶剂中，然后取其溶液涂于透明窗片（或KBr片）上，待溶剂挥发后，样品遗留在窗片上而成为薄膜。待溶剂挥发干净后即可测定。 气相色谱分析2．定量分析红外定量分析是研究样品的量与吸收入射光之间的关系。对于结构一定的分子，在一定的浓度范围内，该化合物的特征吸收谱带的强度是浓度的函数，也符合光吸收定律。红外光谱图中吸收带很多，因此定量分析时特征吸收谱带的选择尤为重要，除应考虑摩尔吸光系数ε较大之外，还应注意以下几点：①谱带的峰形应具有较好的对称性；②没有其它组分在所选择特征谱带区产生干扰； 气相色谱分析③溶剂或介质在所选择特征谱带区域应无吸收或基本上无吸收；④所选溶剂不应在浓度变化时对所选择特征谱带的峰形产生影响；⑤特征谱带不应在二氧化碳、水蒸汽有强吸收的区域。定量分析的方法很多，根据被测定物质的情况和定量分析的要求可采用直接计算法、工作曲线法、内标法等。'