北京大学UV紫外可见分光光度法分析教程 内部使用

'第十一章紫外-可见分光光度法一、紫外-可见分光光度法的基本原理和概念（一）紫外-可见吸收光谱的产生（二）紫外-可见吸收光谱的电子跃迁类型（三）相关的基本概念（四）吸收带类型和影响因素（五）朗伯—比尔定律（六）偏离比尔定律的因素二、紫外-可见分光光度计（一）主要部件（二）分光光度计的类型和光学性能三、紫外-可见分光光度分析方法（一）定性鉴别（二）纯度检查（三）单组分的定量方法（四）多组分的定量方法——计算分光光度法（五）紫外在有机化合物分子结构研究上的应用（六）光电比色法 第一节紫外-可见分光光度法的基本原理和概念一、紫外-可见吸收光谱的产生二、紫外-可见吸收光谱的电子跃迁类型三、相关的基本概念四、吸收带类型和影响因素 一、紫外-可见吸收光谱的产生1．分子吸收光谱的产生——由能级间的跃迁引起能级：电子能级、振动能级、转动能级跃迁：电子受激发，从低能级转移到高能级的过程EEEE分电振转c能级差Ehh若用一连续的电磁辐射照射样品分子，将照射前后的光强度变化转变为电信号并记录下来，就可得到光强度变化对波长的关系曲线，即为分子吸收光谱 续前2．分子吸收光谱的分类：分子内运动涉及三种跃迁能级，所需能量大小顺序EEE电振转E1~20ev0.06~1.25m紫外可见吸收光谱电E0.05~1ev25~1.25m红外吸收光谱振E0.005~0.05ev250~25m远红外吸收光谱转3．紫外-可见吸收光谱的产生由于分子吸收紫外-可见光区的电磁辐射，分子中价电子（或外层电子）的能级跃迁而产生（吸收能量=两个跃迁能级之差） 二、紫外-可见吸收光谱的电子跃迁类型预备知识：价电子：σ电子→饱和的σ键π电子不饱和的π键n电子轨道：电子围绕原子或分子运动的几率轨道不同，电子所具有能量不同基态与激发态：电子吸收能量，由基态→激发态c成键轨道与反键轨道：σ<πn→σ*>π→π*>n→π* 图示 续前注：紫外光谱电子跃迁类型：n—π*跃迁π—π*跃迁饱和化合物无紫外吸收电子跃迁类型与分子结构及存在基团有密切联系•根据分子结构→推测可能产生的电子跃迁类型；•根据吸收谱带波长和电子跃迁类型→推测分子中可能存在的基团（分子结构鉴定） 三、相关的基本概念1．吸收光谱（吸收曲线）：不同波长光对样品作用不同，吸收强度不同以λ~A作图next2．吸收光谱特征：定性依据吸收峰→λmax吸收谷→λmin肩峰→λsh末端吸收→饱和σ-σ跃迁产生 图示back 续前3．生色团（发色团）：能吸收紫外-可见光的基团有机化合物：具有不饱和键和未成对电子的基团具n电子和π电子的基团产生n→π*跃迁和π→π*跃迁跃迁E较低例：C＝C；C＝O；C＝N；—N＝N—注：当出现几个发色团共轭，则几个发色团所产生的吸收带将消失，代之出现新的共轭吸收带，其波长将比单个发色团的吸收波长长，强度也增强4．助色团：本身无紫外吸收，但可以使生色团吸收峰加强同时使吸收峰长移的基团有机物：连有杂原子的饱和基团例：—OH，—OR，—NH—，—NR—，—X2 续前5．红移和蓝移：由于化合物结构变化（共轭、引入助色团取代基）或采用不同溶剂后吸收峰位置向长波方向的移动，叫红移（长移）吸收峰位置向短波方向移动，叫蓝移（紫移，短移）6．增色效应和减色效应增色效应：吸收强度增强的效应减色效应：吸收强度减小的效应7．强带和弱带：ε>105→强带maxε<103→弱带min 四、吸收带类型和影响因素1．R带：由含杂原子的不饱和基团的n→π*跃迁产生C＝O；C＝N；—N＝N—•E小，λ250~400nm，ε<100maxmax•溶剂极性↑，λ↓→蓝移（短移）max2．K带：由共轭双键的π→π*跃迁产生(—CH＝CH—)，—CH＝C—CO—n•λ>200nm，ε>104maxmax•共轭体系增长，λ↑→红移，ε↑maxmax•溶剂极性↑，对于—(—CH＝CH—)—λ不变nmax对于—CH＝C—CO—λ↑→红移max 续前3．B带：由π→π*跃迁产生芳香族化合物的主要特征吸收带•λ=254nm，宽带，具有精细结构；max•ε=200max•极性溶剂中，或苯环连有取代基，其精细结构消失4．E带：由苯环环形共轭系统的π→π*跃迁产生芳香族化合物的特征吸收带•E180nmε>104（常观察不到）1max•E200nmε=7000强吸收2max•苯环有发色团取代且与苯环共轭时，E带与K带合并2一起红移（长移） 图示 图示 图示 续前影响吸收带位置的因素：1．溶剂效应：对λ影响：nextmaxn-π*跃迁：溶剂极性↑，λ↓蓝移maxπ-π*跃迁：溶剂极性↑，λ↑红移max对吸收光谱精细结构影响next溶剂极性↑，苯环精细结构消失溶剂的选择——极性；纯度高；截止波长<λmax2．pH值的影响：影响物质存在型体，影响吸收波长 图示back 图示back 五、Lamber-Beer定律（一）Lamber-Beer定律：吸收光谱法基本定律描述物质对单色光吸收强弱与液层厚度和待测物浓度的关系Lamber定律：AlBeer定律：AC假设一束平行单色光通过一个吸光物体入射光强为I0透过光强为I物体截面为S厚度为l吸光质点数为n 续前取物体中一极薄层设入射光强为Ix薄层的吸光质点数为dn不让光子通过的面积为dSkdndSkdn光子通过薄层被吸收的几率SS透过薄层减弱的光强为dIxdIkdnIdIxnkdSxISI0I0SxxIknInlnlgEISIS00Vn由S和nVClClS 续前ILamberBeer定律表达式lgEClI0I透光率TI0AECl吸光度AlgTECl或T1010E：吸光系数讨论：1．Lamber-Beer定律的适用条件（前提）入射光为单色光溶液是稀溶液2．该定律适用于固体、液体和气体样品3．在同一波长下，各组分吸光度具有加和性应用：多组分测定AAAA总abc （二）吸光系数和吸收光谱1．吸光系数的物理意义：单位浓度、单位厚度的吸光度AECl讨论：1）E=f（组分性质，温度，溶剂，λ）当组分性质、温度和溶剂一定，E=f（λ）2）不同物质在同一波长下E可能不同（选择性吸收）同一物质在不同波长下E一定不同3）E↑，物质对光吸收能力↑,定量测定灵敏度↑→定性、定量依据 续前2．吸光系数两种表示法：1）摩尔吸光系数ε：在一定λ下，C=1mol/L，L=1cm时的吸光度2）百分含量吸光系数/比吸光系数：在一定λ下，C=1g/100ml，L=1cm时的吸光度3）两者关系M1%E1cm103．吸收光谱（吸收曲线）：λ~A最大吸收最小吸收特征值→定性依据肩峰末端吸收 续前4．吸光度测量的条件选择：A测定灵敏度高maxmax1）测量波长的选择：左右较小的AmaxAE须在下测定maxCl2）吸光度读数范围的选择：选A=0.2~0.73）参比溶液(空白溶液)的选择：空白溶液配制样品的溶剂光学性质和厚度相同参比池样品池调节光路空白溶液参比池A0，T100%参样品溶液样品池A样注：采用空白对比消除因溶剂和容器的吸收、光的散射和界面反射等因素对透光率的干扰 六、偏离Beer定律的因素AECl依据Beer定律，A与C关系应为经过原点的直线偏离Beer定律的主要因素表现为以下两个方面（一）光学因素（二）化学因素 （一）光学因素1．非单色光的影响：Beer定律应用的重要前提——入射光为单色光照射物质的光经单色器分光后并非真正单色光其波长宽度由入射狭缝的宽度和棱镜或光栅的分辨率决定为了保证透过光对检测器的响应，必须保证一定的狭缝宽度这就使分离出来的光具一定的谱带宽度 续前设入射光由波长为和的光组成12入射光光强分别为I和I0102对应的透过光光强分别为I和I12IEClAlgTlgEClII100I0III10E1ClI10E2Cl120102又TIIII01020102II10（E2E1）Cl10E1Cl0102II0102II10（E2E1）Cl0102AlgTECllg1II0102 续前讨论：入射光的谱带宽度严重影响吸光系数和吸收光谱形状EEAECl成线性关系121EEA与C不成线性关系，偏离Beer定律12（EE）A与C偏离线性关系越严重21结论：•选择较纯单色光（Δλ↓，单色性↑）•选λ作为测定波长（ΔE↓，S↑且成线性）max 续前2．杂散光的影响：杂散光是指从单色器分出的光不在入射光谱带宽度范围内，与所选波长相距较远杂散光来源：仪器本身缺陷；光学元件污染造成杂散光可使吸收光谱变形，吸光度变值3．反射光和散色光的影响：反射光和散色光均是入射光谱带宽度内的光直接对T产生影响散射和反射使T↓，A↑，吸收光谱变形注：一般可用空白对比校正消除4．非平行光的影响：使光程↑，A↑，吸收光谱变形 （二）化学因素Beer定律适用的另一个前提：稀溶液浓度过高会使C与A关系偏离定律 （三）透光率的测量误差——ΔTA1AlgTEClCElEllgTC0.434T浓度的相对误差CTlgT影响测定结果的相对误差两个因素：T和ΔTΔT影响因素：仪器噪音1）暗噪音2）讯号噪音 续前1）暗噪音——与检测器和放大电路不确切性有关与光讯号无关d0.434T0.434T(0.434lgT)()02dTTlgT(TlgT)lgT0.434，T36.80%对应最小的测量误差大多数分光光度计的T0.2%~1%今假设T0.5%T：65%~20%适宜测量范围测定结果相对误差较小A：0.2~0.7 续前2）讯号噪音——与光讯号有关表明测量误差较小的范围一直可延至较高吸光度区，对测定有利 第二节紫外－可见分光光度计 1．光源：钨灯或卤钨灯——可见光源350~1000nm氢灯或氘灯——紫外光源200~360nm2．单色器：包括狭缝、准直镜、色散元件棱镜——对不同波长的光折射率不同色散元件分出光波长不等距光栅——衍射和干涉分出光波长等距 续前3．吸收池：玻璃——能吸收UV光，仅适用于可见光区石英——不能吸收紫外光，适用于紫外和可见光区要求：匹配性（对光的吸收和反射应一致）4．检测器：将光信号转变为电信号的装置光电池光电管光电倍增管二极管阵列检测器5．记录装置：讯号处理和显示系统 类型：1．单光束分光光度计：特点：•使用时来回拉动吸收池→移动误差•对光源要求高•比色池配对 续前2．双光束分光光度计：特点：•不用拉动吸收池，可以减小移动误差•对光源要求不高•可以自动扫描吸收光谱 续前3．双波长分光光度计特点：•利用吸光度差值定量•消除干扰和吸收池不匹配引起的误差 第三节紫外-可见分光光度分析方法定性鉴别一、定性分析纯度检查和杂质限量测定单组分的定量方法二、定量分析多组分的定量方法三、紫外在有机化合物分子结构研究上的应用四、光电比色法 一、定性分析（一）定性鉴别定性鉴别的依据→吸收光谱的特征吸收光谱的形状吸收峰的数目吸收峰的位置（波长）吸收峰的强度相应的吸光系数 续前1．对比吸收光谱的一致性同一测定条件下，与标准对照物谱图或标准谱图进行对照比较 续前2．对比吸收光谱的特征值1%max，max，E1cmsh，min 续前3．对比吸光度或吸光系数的比值：例：药典规定VB定性鉴别：12，，三处最大吸收278361550AA3613611.70~1.88，3.15~3.45AA278550 续前（二）纯度检查和杂质限量测定1．纯度检查（杂质检查）1）峰位不重叠：找λ→使主成分无吸收，杂质有吸收→直接考察杂质含量2）峰位重叠：主成分强吸收，杂质无吸收/弱吸收→与纯品比较，E↓杂质强吸收>>主成分吸收→与纯品比较，E↑，光谱变形 续前2．杂质限量的测定：例：肾上腺素中微量杂质——肾上腺酮含量计算2mg/mL-0.05mol/L的HCL溶液，λ310nm下测定规定A≤0.05即符合要求的杂质限量≤0.06%310A0.05C1%El43511cm41.110g/100ml31.110mg/ml31.110肾上腺酮%1000.06%2 二、定量分析（一）单组分的定量方法定量依据：AECl1．吸光系数法2．标准曲线法3．对照法：外标一点法 续前1．吸光系数法（绝对法）前提：要求单色光稀释E已知过程：W(g)样/含iC(g/mL)求ACiAC[g/100mL]iElA或C[mol/L]ilCii%100%C样 练习例：维生素B的水溶液在361nm处的百分吸光系12数为207，用1cm比色池测得某维生素B溶液的吸12光度是0.414，求该溶液的浓度（见书P209例1）解：A0.414C0.00200g/100mL20.0g/mLEl2071 练习例：精密称取B样品25.0mg，用水溶液配成100ml。12精密吸取10.00ml，又置100ml容量瓶中，加水至刻度。取此溶液在1cm的吸收池中，于361nm处测定吸光度为0.507，求B的百分含量？12解：0.50735C2.4510g/100mL2.4510g/mLi207122.5010105C2.5010g/mL样1001005Ci2.4510B%100%100%98.0%12C5样2.5010 练习HCL5mL吡啶25ml例：20.00mg样品稀至250mL移取10mL稀至100mL367测A0.591(已知E764.0)求i%解：A0.59146C7.9210g/100mL7.9210g/mLiEl7646C7.9210ii%100%100%99.0%2C2.01010样100250 续前2．标准曲线法前提：固定仪器和测定条件AKCAC固定条件过程：配制标准系列分别测定AC~A曲线同上条件样品测定A查得C样样CACA样样标样C样CAA标标标 示例芦丁含量测定分别移取0.200mg/mL标样0~5mL25mL样品3.0mg25mL0.710mg/25mL 续前3．对照法：外标一点法前提：固定仪器和测定条件；C截距为0；标样与样品浓度相近Cs过程：一定分别测定A和A样标CiAiCCiSAS注：当样品溶液与标准品溶液的稀释倍数相同时AimmiSASmii%100%m 练习例：维生素B的含量测定12精密吸取B注射液2.50mL，加水稀释至10.00mL；12另配制对照液，精密称定对照品25.00mg，加水稀释至1000mL。在361nm处，用1cm吸收池，分别测定吸光度为0.508和0.518，求B注射液注射液的浓12度以及标示量的百分含量（该B注射液的标示量12为100μg/mL）解：1）对照法2.525.0010000.508CC98.1g/mLii1010000.518CiB标示量%100%98.1%12标示量 练习2）吸光系数法A2.500.508CCiiEl102071C98.1g/mLiCiB标示量%100%98.1%12标示量 续前（二）多组分的定量方法定量依据：AAAA总abc三种情况：1．两组分吸收光谱不重叠（互不干扰）两组分在各自λ下不重叠→分别按单组分定量maxaa过程：测定E；A111bb测定E；A222aaaA1由AECC11aaaE1bbbA2由AECC22bbbE2 续前2．两组分吸收光谱部分重叠λ→测A→b组分不干扰→可按单组分定量测C11aλ→测A→a组分干扰→不能按单组分定量测C22aaa过程：测定E；A111abab测定E和E；A2222aaaA1由AECC11aaaE1ababab由AAAECEC2222a2babaAEC22aCbbE2 续前3．两组分吸收光谱完全重叠——混合样品测定（1）解线性方程组法（2）等吸收双波长消去法（3）系数倍率法 (1)解线性方程组法步骤：测定Ea和Eb；Aab1111abab测定E和E；A2222abababAAAECEC1111a1babababAAAECEC2222a2babbabbAEAE1221CaababEEEE1221abaabaAEAE2112CbababEEEE1221 (2)等吸收双波长法abab步骤：A1A1A1ababAAA222abababaabbabAAA(AA)(AA)AA121212消除a的影响测baa选a的等吸收点和AA1212abbbAAA12bb(EE)C12bECbbababAACbbbbEEE12 续前消去b的影响测abb选b的等吸收点和AA1"2"1"2"abaaA"AA1"2"aa(EE)C12aECaaababA"A"CaaaaEEE1"2"注：须满足两个基本条件•选定的两个波长下干扰组分具有等吸收点•选定的两个波长下待测物的吸光度差值应足够大 (3)系数倍率法前提：干扰组分b不成峰形无等吸收点 续前步骤：b曲线上任找一点→λ1另一点→λ2bA1令K倍率因子bA2abababbaAKA2A1bK(AbAa)(AbAa)A12211bbbaaA2(KA2A1)(KA2A1)abaaaaAKAA(KEE)C2121aλλab12AC消除了b的干扰a优点：同时将待测组分和干扰组分放大信号K倍，提高了待测组分测定灵敏度 练习1．取咖啡酸，在165℃干燥至恒重，精密称取10.00mg，加少量乙醇溶解，转移至200mL容量瓶中，加水至刻度线，取此溶液5.00mL，置于50mL容量瓶中，加6mol/L的HCL4mL，加水至刻度线。取此溶液于1cm比色池中，在323nm处测定吸1%光度为0.463，已知该波长处的E927.9，求咖啡酸百分1cm含量解：0.46346C4.90010g/100mL4.90010g/mLi927.91310.001056C5.00010g/mL样200506Ci4.90010咖啡酸%100%100%98.0%6C样5.0001015注：稀释因子20050 练习2．精密称取0.0500g样品，置于250mL容量瓶中，加入0.02mol/LHCL溶解，稀释至刻度。准确吸取2mL，稀释至100mL。以0.02mol/LHCL为空白,在263nm处用1cm吸收池测定透光率为41.7%，其摩尔吸光系数为12000，被测物分1%子量为100.0，试计算263nm处E和样品的百分含量。1cm1%101012000解：E12001cmM100.0AlgTlg0.417CiElEl12001463.16610g/100mL3.16510g/mL0.050026C4.00010g/mL样2501006Ci3.16510样品%100%100%79.15%6C样4.00010'